徐向田¹ 徐淑钦¹ 唐国栋¹ 陈鸿珊²  滕  立²  

1.山东医专肝病研究所   2.中国医学科学院药物生物研究所

摘要 目的：观察华蟾益肝胶囊体外抗乙型肝炎病毒(HBV)作用，方法：试验在HBV基因转染的人肝癌细胞系2.2.15细胞中，研究华蟾益肝胶囊对细胞的毒性，对HBsAg和HBeAg分泌以及对HBV-DNA的抑制作用。并以拉米夫定作为阳性对照。结果：华蟾益肝胶囊的无毒浓度600mg/ml对细胞HBsAg的分泌抑制率为：81.89±0.42%，对细胞HBeAg的分泌抑制率为：30.76±12.98%，对细胞培养上清的HBV-DNA 斑点杂交的IC50为296.18±44.39 mg/ml。拉米夫定的最大无毒浓度药液800mg/ml加入2.2.15细胞培养8天，对HBeAg和HBsAg的分泌无明显抑制作用。对细胞培养上清的HBV-DNA 斑点杂交的IC50为127.97±17.78 mg/ml。结论：华蟾益肝胶囊对细胞培养液内HBV-DNA有显著抑制作用，并对细胞HBsAg的分泌也有抑制作用。

关键词: 华蟾益肝胶囊；2.2.15细胞；HBsAg；HBeAg；HBV-DNA

Huachan Yigan capsules in 2.2.15 cell  culture  of Inhibition of hepatitis B virus

Xu Xiangtian¹,  Xu Shuqin ¹, Tang Guodong¹,Chen Hongshan², Teng Li²

1. Shandong medicoll college,(Shandong linyi,276002)

2. Institute of Medicinal Biothechnology of Peking Union Medical College; (Beijing 100050)      

Abstract   Objective: To observe the Huachan Yigan Capsule  in vitro anti-hepatitis B virus (HBV) role. Methods: Test in HBV gene-transfected human hepatoma cell line 2.2.15 cells to study Huachan Yigan Capsule  on the cytotoxicity of on the secretion of HBsAg and HBeAg and HBV-DNA in vivo. And lamivudine as a positive control. Results: Non-toxic concentration of Huachan Yigan Capsule was 600mg/ml.  The inhibited rate is 81.89±0.42% for HBsAg in the cells. The inhibited rate is 30.76±12.98% for HBeAg in the cells. The inhibited rate is 296.18±44.39 mg/ml the cell culture supernatant of HBV-DNA dot-blot hybridization of the IC50. By adding 2.2.15 concentration of lamivudine in non-toxic liquid is 800 mg/ml  for cell culture 8 days on the secretion of HBeAg and HBsAg was no significant inhibition.The Cell culture supernatant of the HBV-DNA is 127.97±17.78 mg/ml at IC50 dot-blot hybridization. Conclusion:  Huachan Yigan Capsule for HBV-DNA in cell culture medium  have significant inhibition.The secretion HBsAg  of cells have inhibitory effects.

Key words: Huachan Yigan Capsule ; HepG 2.2.15; HBsAg；HBeAg；HBV-DNA

_________________________________________________________________

[基金项目]国家科技部创新基金项目(No.01C26213700154)

[作者单位] 1.山东医专肝病研究所,山东临沂276002。

华蟾益肝胶囊(又名安体维康胶囊,国家食品药品监督管理局临床批号：2006L01147）是山东临沂肝胆病医院和山东医专肝病研究所联合研制的中药复方新药。具有清热解毒、疏肝活血、健脾利湿之功效。临床主要用于治疗慢性乙型肝炎轻中型，湿热瘀阻、肝郁脾虚证。为观察华蟾益肝胶囊抗乙型肝炎病毒(HBV)作用，本试验在HBV基因转染的人肝癌细胞系2.2.15细胞中，研究了华蟾益肝胶囊对细胞的毒性，对HBsAg和HBeAg分泌以及对HBV-DNA的抑制作用。并以拉米夫定作为阳性对照^[1]。

1       试验材料

1.1  受试药：华蟾益肝胶囊,由山东临沂肝胆病医院提供，批号：021106。待测药物为棕色粉末，实验时根据所设计剂量组浓度再用MEM培养液配制。保存条件：4℃冰箱保存。

1.2   阳性对照药拉米夫定：拉米夫定片剂，英国葛兰素威康公司生产，批号：B008923，每片含量100mg，药物经培养液浸泡、溶解，离心去沉淀。4℃冰箱保存。

1.3  2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)基因转染人肝癌细胞(Hep G2)的2.2.15细胞系, 美国Mount Sinai 医学中心构建。

1.4 细胞培养液及试剂配制：MEM培养液100ml：含胎牛血清10%，谷氨酰胺0.03%，G418 380µg/ml，卡那霉素50U/ml。

2. 试验方法

2.1  2.2.15细胞培养

在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25%胰酶，37℃消化10分钟，加培养液吹散，1:3传代，10天长满。

2.2  药物对细胞毒性试验:

实验分无药物细胞对照组和不同药物浓度药物组。无病变为0。计算每批实验每浓度药液平均细胞病变程度和抑制%。按Reed- Muench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。

2.3  对HBeAg、HBsAg抑制试验

试验重复三批， 分别测定HBsAg和HBeAg。用γ-计数仪测定每孔cpm值。华蟾益肝胶囊在2.2.15 细胞培养内对HBsAg和HBeAg的选择指数(SI)

按其对细胞毒性指标细胞病变(SI)计算。以t检验法计算各稀释度HBsAg、HBeAg和对照组间cpm差别的统计学意义。

2.4   对2.2.15细胞DNA抑制实验:2.2.15细胞上清中HBV－DNA提取

2.2.15细胞每毫升20万个接种24孔细胞培养板, 每孔1ml，接种后24小时加入药物，每4天换原浓度药液培养，加药后培养第8天收取上清液，经聚乙二醇沉淀、蛋白酶K裂解、苯酚：氯仿：异戊醇抽提、无水乙醇沉淀核酸等步骤，真空抽干，重溶于TE缓冲液中作样品。

2.5  斑点杂交

点样：取20ul (DNA含量25ug), 经变性、中和，并以20X SSC缓冲液对倍稀释至1:8倍稀释于硝酸纤维素膜上，并经干烤、预杂交、杂交、洗膜、放射自显影等步骤。以常规方法冲洗X光片。扫描仪扫描光片，用gel-pro软件测定密度，计算抑制率及IC50。

3. 结果计算与分析

    细胞培养毒性按Reed-Muench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。对HBsAg和HBeAg 抑制效果按所列公式计算，对  HBV-DNA 抑制效果以  gel-pro  凝胶分析软件分析光片相对密度，计算抑制率及IC50。

4.  试验结果

4.1  在2.2.15细胞培养中的细胞毒性

华蟾益肝胶囊对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌2.2.15细胞的半数中毒浓度（TC50）两批实验平均为: 900.485±73.47mg/ml; 无毒浓度（TC0）为:  600±0mg/ml。阳性对照拉米夫定半数中毒浓度(TC50)为: 1198.97±97.50mg/ml。无毒浓度(TC0)为: 800±0mg/ml。

4.2. 华蟾益肝胶囊对2.2.15细胞培养中HBsAg和HBeAg表达的作用

    无毒浓度华蟾益肝胶囊和阳性对照拉米夫定加入2.2.15细胞培养中，第8天观察其对HBsAg和HBeAg的表达效果。三批实验结果见表1.2.。

4.2.1 对HBsAg的抑制率

华蟾益肝胶囊三批实验：600、300、150、75、37.5mg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBsAg的平均抑制率分别为: 81.89±0.42%、64.63±4.64%、57.09±1.77%、49.25±1.74%、18.48±9.12%。华蟾益肝胶囊对HBsAg的半数有效剂量（IC50）：125.62±7.09。选择指数（SI）为7.18±0.40。

4.2.2 对HBeAg的抑制率

结果：华蟾益肝胶囊三批实验：600、300、150、75、37.5mg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBeAg的平均抑制率分别为: 30.76±12.98%、16.73±6.65%、7.74±7.93%、2.34±2.84%、3.49±4.66%。华蟾益肝胶囊对HBeAg的半数有效剂量（IC50）：>571.79±33.99。选择指数（SI）为：<1.58±0.1。

4.3. 拉米夫定对HBeAg和HBsAg 的作用

    拉米夫定800、400、200、100、50mg/ml  加入2.2.15细胞培养体系中，第8天测定培养液HBsAg和HBeAg滴度，计算抑制效果。

4.3.1  拉米夫定对HBeAg的抑制率：三批试验拉米夫定800、400、200、100、50mg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBsAg 的平均抑制率为: 8.23±3.02%、12.99±0.46%、17.83±2.09%、15.84±2.33%、14.10±1.27%。

4.3.2  拉米夫定对HBsAg的抑制率：三批试验拉米夫定800、400、200、100、50mg/ml各浓度组对2.2.15细胞培养第8天上清液HBeAg的平均抑制率分别为:4.65±6.58%、4.05±5.73%、5.67±4.70% 、8.60±4.88%、3.45±3.95%。

4.4  华蟾益肝胶囊和拉米夫定对2.2.15细胞培养上清液HBV-DNA的抑制作用

4.4.1 华蟾益肝胶囊在2.2.15细胞培养上清液中HBV-DNA 斑点杂交：华蟾益肝胶囊在2.2.15细胞培养上清液中对HBV-DNA的作用,3批实验原液对HBV-DNAIC50分别为245.83、313.08和329.64，平均IC50为296.18±44.39, TC50为900.485±73.47mg/ml, 选择指数分别为3.66、11.45、2.88和2.73，平均：3.09±0.50。结果见表1。

表1   华蟾益肝胶囊在2.2.15细胞培养上清液中对HBV-DNA 的作用

4.4.2 拉米夫定在2.2.15细胞培养中对上清液中HBV-DNA 的作用：拉米夫定二批实验对2.2.15细胞上清液内HBV-DNA的作用, IC50分别为140.54mg/ml和115.40mg/ml，平均IC50为127.97±17.78mg/ml, TC50为1198.97±97.50mg/ml, 选择指数分别为8.53和10.38，平均为9.455±1.31。

5. 讨论

    本试验观察了华蟾益肝胶囊和抗乙型肝炎病毒阳性对照药物拉米夫定在乙型肝炎病毒转染的人肝癌细胞2.2.15细胞系培养中对细胞的毒性，对HBsAg和HBeAg分泌及细胞培养上清和细胞内HBV-DNA的抑制作用。

5.1  华蟾益肝胶囊和拉米夫定对2.2.15细胞培养的毒性

华蟾益肝胶囊半数中毒浓度（TC50）为: 900.485±73.47mg/ml; 无毒浓度（TC0）为: 600±0mg/ml。阳性对照拉米夫定的半数中毒浓度（TC50）为: 1198.97±97.50mg/ml; 无毒浓度（TC0）为: 800±0mg/ml。

5.2  华蟾益肝胶囊和拉米夫定在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的分泌的抑制作用

三批实验平均结果发现，华蟾益肝胶囊5个无毒浓度分别加入2.2.15细胞培养8天，华蟾益肝胶囊最大无毒浓度600mg/ml对HBsAg的抑制率为81.89±0.42%，半数有效浓度(IC50)为125.62±7.09，选择指数(SI)为7.18±0.40。拉米夫定两批实验平均最大无毒浓度800mg/ml对HBsAg的抑制率为8.23±3.02%，不能计算半数有效浓度和选择指数。

华蟾益肝胶囊三批实验平均无毒浓度600mg/ml对HBeAg的抑制率为30.76±12.98%，半数有效浓度（IC50） >571.79±33.99。选择指数(SI) <1.58±0.1。拉米夫定两批实验平均最大无毒浓度800mg/ml对HBsAg的抑制率为4.65±6.58%，不能计算半数有效浓度和选择指数。

5.3  华蟾益肝胶囊和拉米夫定在2.2.15细胞培养内对HBV-DNA抑制作用

三批实验平均结果表明：华蟾益肝胶囊对HBV-DNA抑制作用：培养液斑点杂交IC50为296.18±44.39, SI为 3.09±0.50。拉米夫定对HBV-DNA抑制作用： IC50为: 127.97±17.78mg/ml, SI 为：9.455±1.31。

本实验与早期体外抗HBV试验和临床初步观察结果基本一致^[1-3]。与文献报导和多次实验一致，说明实验可信。

参考文献

[1] 徐向田.中药安体维康胶囊药学和临床研究近况. 山东医学高专学报,2007,29(6):426-428.

[2] 刘庄，傅希贤，张乃临，等. 复方华蟾素口服液抗乙型肝炎病毒体外实验研究[J].中国中西医结合杂志,1996,16(12):738-740.

[3] 徐向田,徐耿美. 安体维康与干扰素联用治疗慢性乙型肝炎临床研究[J].世界中西医结合杂志,2007,2(03):165-166.

作者简介：徐向田，男，教授。研究方向：中西医结合防治肝病和艾滋病。

通讯地址：山东省临沂市兰山区青年路39号，276002, 山东医专肝病研究所,电话/传真：0539-8307778Emailxiangtianxu@126.com.