细胞3D培养-能和细胞2D培养一样流行吗？
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2D细胞培养作为一项生命科学领域中长期使用的技术，使人类能够在体外研究细胞的生理和病理。然而随着对细胞微环境概念的逐渐了解，科学家们发现2D培养细胞的生理状态和活性与体内细胞并不完全一致，其结果常常与动物实验和临床实验结果相矛盾。因此，在过去的十年中，科学家致力于开发各种3D细胞培养技术，以为细胞提供更类似于体内环境的培养环境。研究人员逐渐意识到，若想在体外实现细胞的形态、结构和生理功能，3D细胞培养需要能够模拟包括细胞与细胞，细胞与细胞外基质及细胞与器官的相互作用在内的体内环境的关键特征。那么3D细胞培养技术如何能像2D细胞培养技术一样推而广之呢？
近期，受主编约稿，浙江大学医学院孙苗医师、刘安医师为共同第一作者、浙大贺永教授、王慧明教授为共同通讯的综述“3D cell culture—can it be as popular as 2D cell culture?”发表在《Advanced Nanobiomed Research》杂志。文章概述了以水凝胶系统为核心的生物材料系统、以生物打印为主要手段的生物制造技术及由微流控芯片和生物反应器构成的培养设备系统三个方面相关的3D细胞培养系统的开发。探讨了3D细胞培养的现状及未来，提出3D细胞培养在将来与2D培养一样普及的关键可能在于其制造、培养操作及检测的标准化，这其中涵盖了多种技术难题。
作者首先从培养基质、细胞极性、生物因子扩散、微环境四方面对2D，2.5D与3D细胞培养的差异进行了比较，并作出了示意图。（表1）
表1 2D，2.5D，3D细胞培养对比
为了真正实现体内细胞的形状和功能，科学家引入了一种基于水凝胶的ECM系统。水凝胶中存在的3D网络结构使液体可以在其中扩散或渗透，从而为细胞提供了良好的生长环境。这种基于水凝胶的培养底物系统是整个3D细胞培养系统的核心。作者将3D细胞培养的所需的技术支持以塔表现出来。（图1）
图1三维细胞培养示意图。当我们把三维细胞培养看作是一座建筑塔时，生物材料的ECM模拟、微结构的制造和培养体系构成了整个塔的支柱，支撑着第一级的屋顶——三维细胞培养的应用。随着3D细胞培养技术的发展，塔的第二层展示了我们所面临的挑战。只有攻破这些挑战，才能最终达到3D细胞培养的塔尖。
3D培养的生物材料：
1.水凝胶
水凝胶是一种有效的3D细胞培养基质，它由交联的聚合物链或复杂的天然或合成蛋白质分子网络组成。由于存在大量水，水凝胶的生物物理特性与天然组织的生物物理特性非常相似。作者对3D细胞培养中常用的不同类型的水凝胶及其性质进行了总结。（表2）
表2 水凝胶的性质
用于3D细胞培养的水凝胶需具有多孔性且孔间相互连通，孔径应与目标组织的细胞大小匹配。此外，在物理性质上，由于来自不同组织类型的细胞需要生长基质的不同机械性能，其弹性模量应与目标组织相匹配。水凝胶还应具有生物相容性和可降解性，可为细胞和促进细胞分化的官能团提供附着位点。同时，它在保持液态的同时需具有可成形性，在物理或化学交联后能保持其形状，为细胞提供稳定微环境。（图2）
图2 3D细胞培养所需要的水凝胶的性质
2.脱细胞基质
通过脱细胞技术处理不同类型的组织和器官，可以获得脱细胞的支架。此种支架不含细胞和遗传物质，但可以保留复杂的超微结构并模仿靶组织的自然生理解剖结构，促进定植的干细胞分化为目标组织。但是，残留的免疫原性物质和较低的机械强度阻碍了其在体内的应用。
3.其他细胞支持材料
聚合物、金属、陶瓷生物活性玻璃和碳纤维、纳米管可制成各种形式的3D细胞培养支架，并与细胞包封材料组合使用。将纤维或颗粒添加到水凝胶中可以增加其强度，并充当细胞粘附的结构，进一步改善水凝胶的生物学特性。
接下来，作者以本课题组的科研工作为例，概述了典型的仿生ECM制造。
（1）浇铸法：预先准备具有特定形状的模具，将与细胞混合的水凝胶倒入后通过光、物理、化学等方法固化，从模具中取出后获得培养单元。此种方法的缺点是制造大型结构时缺少内部通道，成型结构的营养供应和代谢废物不足。而微成型允许生产具有多种复杂几何形状的小型结构。利用高流动性的水凝胶和柔软的超细纤维霉菌（SUFM），自动输送液体和细胞，并将细胞均匀地播种到超细通道中（500 nm至100μm）。
（2）微球制造：利用表面张力以及水凝胶的粘度，使用悬滴法制造包裹细胞的微球。在静电场下，可以制造微米级的球，用于高通量培养和检测。
（3）超细纤维制造：利用静电纺丝或挤压3D打印将水凝胶转变为细丝，此种结构可用于神经组织。此外，大量的纤维可形成薄膜或涂层，由细丝的定向结构形成的支架也可以操纵细胞行为。
（4）通道制造：可利用同轴3D打印、牺牲模板复制和DLP打印制造通道结构，用于模仿血管和呼吸道。同轴印刷制造的管堆叠形成的3D结构具有一定的直径且没有分叉，而DLP或牺牲模板复制可产生不同直径的分叉结构和通道。
（5）复合材料：结合不同的制造技术，可以制造具有复杂结构的培养单元以进一步模拟人体器官或组织。
（6）生物3D打印：利用活细胞、细胞外基质、生物因子和生物材料作为制造生物产品的原料。当前3D生物打印的问题是打印精度和打印效率之间的矛盾：结构越精细，分辨率越高，打印效率就越慢。而装载在生物墨水中的细胞难以承受长时间的打印过程。此外，剪切力、不稳定的物理和化学环境、反复的交联过程都会影响产品的质量。
图3 基于水凝胶材料的仿生ECM的典型制造过程
3D细胞培养的应用
3D细胞培养已成功应用于构建四种人体基本组织及多种组织构成的器官：大量的软硬支架（生物陶瓷，羟基磷灰石和胶原蛋白）已被用来模仿骨骼组织并应用于临床；微孔藻酸钠细丝可用于模拟包裹神经细胞的神经纤维的结构；使用3D生物打印制作的内皮化的心肌在微流灌注生物反应器中培养后，心肌细胞定向正确，能够自发并同步收缩；胶原蛋白凝胶和PCL膜已被用作在动物体内模型中重建角膜的细胞载体。可使用3D细胞微球来研究肿瘤的发病机理和药物筛选；骨、软骨组织、心脏组织、皮肤和神经组织都已在动物实验中获得了再生应用；3D细胞培养也已证明可以显著维持干细胞的结构和功能。
图4 3D细胞培养在不同组织培养中的应用
3D细胞培养的困难与挑战
（1）营养供应系统：
在2D细胞培养中，定期更换培养基是2D细胞培养中用于营养供应和废物代谢的方法。3D细胞培养的细胞密度和营养需求远高于2D细胞培养，且培养单元内的细胞不与培养基直接接触，仅通过扩散无法维持大量的物质代谢。可采用灌注系统或内部通道的制造来构建有效养分供应系统。
灌注系统中，培养室与无驱灌注或微泵灌注装置相连，培养室的另一端与废液接收系统相连，以排出废培养液。然而，灌注系统仍存在培养系统内存在静水压力和易发液体泄漏的问题。
利用同轴3D打印技术，在培养单元内部建立管道系统以模拟人体的血液循环系统。这种方法从内部结构上改善了代谢物质的交换效率。此类管道被埋在培养单元中，并连接到灌注设备，以将营养物输送到培养单元中。
（2）检测系统
2D细胞培养时，细胞粘附在培养板上，可在显微镜下直接观察，细胞染色和细胞内外物质提取过程中可直接用试剂代替培养基，操作过程方便。在3D细胞培养中，虽可使用共聚焦显微镜进行小样品的检测，但由于共聚焦显微镜视野和z轴扫描高度（200μm）的限制，培养过程中无法直接观察到大体积的培养单位。因此，对于大型培养单位，科学家需要进行预处理，以细胞或组织的形式对其进行检测。将水凝胶用化学试剂分解后，从中提取细胞或蛋白质，随后用于ELISA、流式细胞仪、PCR、免疫印迹和其他分子生物学测试。
（3）标准化
在实验研究中，随机对照实验是最常用的统计分析方法。因此，大量稳定且可重复的样本是确保研究结果可信度的基础。除了样品的标准化生产之外，培养条件的一致性也是干扰获得的研究结果的主要因素。2D细胞培养技术使用常见的培养装置和设备系统。标准化的设备和操作程序使不同研究人员生成的数据具有可比性，而不同实验室建立的3D细胞培养系统的培养设备和样品不相似，实验数据难以对比。因此，建立模块化培养系统，简化培养操作并降低培养成本也是实现3D细胞培养所需要解决的问题。
（4）结构可控的类器官
近年来在肠和脑组织的3D细胞培养领域中，类器官已迅速发展。3D细胞培养的核心问题，即材料的生物学特性与成型特性之间的矛盾，在类器官的研究中变得越来越重要。细胞以3D方式生长时，需要通过3D微环境传递的力进行动态调节。软培养基质可以传递这种力，但却难以维持精细的结构，更难以精确控制培养基质中的多个细胞或细胞分布。未来的研究重点应放在通过物理调节来构造器官结构并将其与化学调节结合，以更好地诱导所产生的类器官的功能性的技术上。
随着生命科学领域的新发展，对3D细胞培养技术的需求正在急剧增加。将细胞封装在水凝胶中建立3D细胞培养系统的优势明显，未来，3D细胞培养将逐步取代2D细胞培养，更好的反映细胞在体内的生长状态。3D细胞培养技术的广泛应用需要多学科技术之间的良好协调。首先是材料科学，其中高质量水凝胶培养基质的开发是3D细胞培养技术发展的基础。其次，结合材料科学和生物制造技术的体内组织和器官的模拟为实现3D细胞培养提供了可能性。最后，微流体技术的发展可以整合培养和检测功能，是实现片上芯片器官的重要手段。
论文地址：https://doi.org/10.1002/anbr.202000066
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