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[转载]湿热证动物模型造模方法及评价研究

已有 927 次阅读 2023-9-5 11:13 |个人分类:思考中医|系统分类:科研笔记|文章来源:转载

资料来源:李威莹,吴威,孟岩,王凤,姜晓西,杨关林,张会永. 湿热证动物模型造模方法及评价研究. 世界科学技术-中医药现代化2021,23(12):4441-4451

摘要:湿热证是中医临床常见的一种证候类型,病程缠绵反复,贯穿于众多疾病的发展始终,严重影响人们的生活健康。研究人员通过建立动物模型对疾病展开更深入的探讨,目前湿热证动物模型研究较多,以中医病因病机为原理造模,方法较为成熟,操作性强,重复性好;但存在制备方法单一,制备标准模糊,研究方向和研究领域呈扎堆式发展等不足。本文通过对中国知网(CNKI)、维普(VIP)、万方、PubMed数据库建库以来有关湿热证动物模型的研究文献进行整理和分析,从温病湿热证、脏腑湿热证及病证结合湿热证的角度出发,对湿热证动物模型的制备方法以及现存优缺点进行讨论和分析,以期为湿热证动物模型的优化及临床研究提供新的思路与方法。

基金资助:国家自然科学基金委员会重大课题(81603513):基于“脾病;脉道不利”探讨脾虚痰浊小猪dyHDL对冠脉内皮SIPR1/PI3K/Akt的分子调控机制;负责人:张会永;广东省自然科学基金委员会重大课题(2021A1515011485):基于AR靶点的大独活香豆素类抗前列腺癌药效物质基础及其分子作用机制研究;负责人:吴威;沈阳市科学技术局中青年科技创新人才支持计划项目(RC190281):基于“脾虚生痰”探讨肠道菌群影响dyHDL及其亚类促动脉粥样硬化的作用及机制。

湿热证是一组较大的临床证候群,普通人的患病风险为 10.55%,平均病程为 6.05年[1,2]。湿热证涉及疾病种类众多,患病率占痛风性关节炎患者的46.55%[3],占溃疡性结肠炎中医证型分布的 25.93%[4],占新型冠状病毒肺炎患者的 21.56%[5]等。由于 2019 年新冠肺炎的爆发,湿热证成为社会关注的热点,且患病人数逐年上升,病情缠绵反复,已成为医患共同面对的难题。论湿热证候,各家多有研究。清代名医薛生白认为“气钝血滞”是湿热病的基本特征[6];当代国医大师段亚亭[7]认为“湿为阴邪,黏腻胶着,热淫其内,伤阴动火,湿热二邪互为臂膀,易作祟人体”。但由于缺乏充足的湿热证研究机制理论作为支撑,湿热证治疗的推广和应用受到了阻碍。而制备相应的动物模型,有利于研究疾病的发病机制,探讨治疗方法。历史上不同学术派别对湿热证归类略有差异,导致目前湿热证相关研究文献存在证候概括不全面,造模评判观点较少等不足。本文于中国知网(CNKI)、维普(VIP)、万方数据库中,以“湿热”“动物模型”为检索词,于PubMed数据库中以“Damp-heat syndrome”为检索词,查阅建库以来相关湿热证动物模型文献共 517 篇,并收录 83篇,从温病湿热、脏腑湿热及病证结合类湿热证的角度出发,系统汇总建库以来湿热证动物模型中所出现的证候类型,以期为湿热证动物模型的优化及临床研究提供新的思路与方法。

1 湿热证动物模型的构建方法

1988 年郭金龙[8]将模型大鼠放置于湿热环境中,并喂养高脂高糖饲料复制湿阻证动物模型的实验掀开了湿热证动物模型造模的序幕。1990 年,王新华[9]在郭金龙造模方法的基础上加入致病因子大肠模拟疫戾邪气制备温病湿热证动物模型。同年,吴仕九[10]对两种致病因子鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌进行比较造模,并得出使用鼠伤寒沙门氏菌作为致病因子更符合湿热证病因病机的实验结论。此后湿热证动物造模多从“湿”“热”“邪毒”方向思考,采用“湿热环境+肥甘饮食+致病因子”的多因素病因方法造模,具体详见表1。湿热证造模方法单一,但证型分类较多,临床特点略有不同,主要症状是判断造模成功与否的重要指标。由于教材版本及医者临床经验不同,对不同证型湿热证的判断标准也略有差异,故将造模动物一般体征与 2020 年版中医临床诊疗术语湿热证相关辨证分型进行比照,以期对造模评判标准进行完善(表2)。

表1 湿热证动物模型造模方法简述

造模方法

主要内容

造模原理

造模动物

湿热环境模拟工具

湿热环境设置

饮食因素

致病因子

致病因子感染途径

造模周期

治疗原则

治疗中药

反证方剂

诊断标准

致病机制

中医病因病机“湿热环境+肥甘饮食+疫戾邪气”

大鼠、小鼠、白兔、猕猴(从大鼠到猕猴使用频率依次下降)

人工气候箱、亚都超声加湿器;仿真模拟气候仓;高温仓模拟湿热环境或自制调温箱[11]

温度30℃-34 ℃,相对湿度90%-95%(居多)

高脂高糖饲料(以普通饲料+12%猪油+8%蜂蜜混合居多)

大肠杆菌内毒素、大肠埃希氏菌、小鼠肝炎病毒A59株(MHV-A59)、鼠伤寒沙门氏菌

灌胃、静脉注射、腹腔注射等

因湿热环境条件设置及放置时间不同,以14天、28天、30天居多。

辛开苦降法[12]、清热祛湿法[13]、燥湿和胃法[14]、健脾祛湿法[15]等

葛根[16]、苦豆草[17]、茵陈[18-19]、连翘[20]等

三仁汤、灭幽汤、郁金散、王氏连朴饮、葛根芩连汤、甘露消毒丹、藿朴夏苓汤、茵陈蒿汤等加减方

目前无统一标准,以参照高等教育中医药教材或医者临床经验居多

血浆内毒素、水液代谢、炎症细胞因子、免疫功能、血脂水平、胃肠激素等[29]

表2 湿热证临床表现与造模动物体征对照表

分型

临床证候特点

模型动物对照体征

温病湿热证

湿热并重证 


湿重于热证 

热重于湿证

 

岭南湿热证

脾胃湿热证

大肠湿热证


肝胆湿热证

 

膀胱湿热证

身热不扬,脘痞、腹胀,神情淡漠

发热,渴喜热饮,心中烦闷,脘痞、腹胀,呕恶,大便糜烂色黄,或便下赤白黏冻,小便短赤

身热不扬,头重如裹,肢体困重,口淡、不渴,小便不利,便溏

发热,口渴、欲饮,头身困重,面红,目赤,便溏,小便短赤

脘腹痞胀或痛,呕恶、不食,渴不多饮,肢体困重,大便黏滞或溏泻,尿少色黄,可伴见肢体肿胀

发热,口渴,腹胀、腹痛,暴注下泻,下痢脓血,或腹泻不爽,粪质黏稠腥臭,肛门灼热,尿短黄

发热,身目发黄,胁肋胀痛,或胁下有痞块,纳呆,呕恶,厌油腻,尿黄

发热,口渴,尿血或沙石,小便急迫、频数、涩痛、灼痛,小便黄赤或浑浊

肛温升高,取食次数减少,精神萎靡。

肛温升高较显著,饮水次数增加,烦躁易激,肛周污秽,大便溏泄,小便色深黄。

肛温升高,灵敏度降低,反应迟钝,嗜睡懒动,饮水次数减少,毛发稀疏无光泽,肛周污秽,大便溏软。

肛温升高显著,饮水次数增加,反应较慢,易激惹,弓背耸毛,大便溏泄,小便短少色黄。

肛温升高,嗜睡懒动,取食、饮水次数减少,灵敏度降低,反应迟钝,便软,肛周污秽,小便短少色黄,肢肿。

肛温升高,饮水次数增加,蜷缩,便溏,便血,肛周污秽,小便短少、色深黄。

肛温升高,巩膜黄染,皮毛微发黄色,弓背神萎,蜷缩,饮食次数减少,小便色黄。

肛温升高,饮水次数增加,小便次数增加、短少、色深黄或浑浊,尿血。

注:岭南湿热证指发生于广东、广西、海南、港澳等地,有鲜明地方特点的湿热证,目前暂无岭南湿热证明确的证候描述,造模体征评判多参照脾胃湿热证或温病湿热证[20,30-32]。下文中对模型体征出现率、还原度及严重程度等评判均参照表2。

2 温病湿热证

论治湿热之证,乃温病源流,温病湿热证动物造模一直是湿热证研究领域的重点(表3)。初患湿热证,邪气多停留于卫气阶段,此时湿重于热,随着病程发展,湿邪聚而化热从而表现为湿热并重或热重于湿的证候特点。岭南温病湿热证以“热毒”和“湿浊”相互胶结为特点,有卫、气、营血、伤阴、伤阳 5个传变阶段。相关研究表明,肠道菌群的丰度会随着高蛋白饮食的增加而降低,梭菌群属数量增加幅度明显[33]。岭南人喜食高脂高蛋白食物,现代研究中也多从肠道菌群变化角度探讨岭南湿热证的发病机制[20,31,32]。

表3 温病湿热证造模方法详述

模型

造模对象

造模过程

模型评价

温病湿热

 

 

 

 

 

 

岭南湿热

SD大鼠

 

BALB/c雄性小鼠

 

 

Wister雄性大鼠

 

BALB/c雄性小鼠

 

 

BALB/c 小鼠

 


 

BALB/c雄性小鼠

高脂饲料+湿热环境(10 h/天,分别为7天、11天、14天)+灌服大肠埃希氏菌分别为107,109,1011/(mL·200g),4 h后加强1次[34]

高脂饲料+湿热环境(3 h/天,共3天)+灌胃0.4 mL/10 g大肠杆菌(浓度为109/mL),24 h后加强1次;高脂饲料+湿热环境(3 h/天,共3天)+腹腔注射0.5 mL鼠肝炎病毒MHV-A59(浓度为10-5.5[35]

湿重于热:灌服2 g/(mL·200 g)小承气汤(2次/天,持续7天)+高脂饲料+湿热环境(8 h/天,共16天)灌服109/(mL·200 g)大肠杆菌,4h后加强1次

热重于湿:灌服2g/(mL·200g)大黄附子汤(2次/天,持续7天)+高脂饲料+湿热环境(8 h/天,共16天)+灌服109/(mL·200 g)大肠杆菌,4h后加强1次[36]高蛋白饲料+湿热环境(12 h/天)+隔日灌服白酒0.3mL+跑步30 min+ 49天后灌胃10 mL·kg-1超纯水(持续7天)[20]

高脂饲料+20%蔗糖溶液+湿热环境(10 h/天,共30天)+灌胃0.04 mL·g-1大肠杆菌菌液,24 h后加强1次高脂饲料+20%蔗糖溶液+湿热环境(10 h/天,共30天)+腹腔注射1 mg·kg-1 LPS溶液[31]

普通饲料+湿热环境昼夜交替(昼:温度33±2℃、相对湿度85%;夜:20±2℃、相对湿度60%),连续14天[37]

体征还原度高,操作性强,重复性好;不同造模指标的对比有利于探讨更合适的造模标准。

体征还原度高,操作性强,重复性好;不同造模因子所制备的造模动物体征偏向略有不同,提示要选择合适的致病因子制备不同的湿热证分型。

体征还原度高,操作性强,重复性好。



体征还原度高,操作性强,重复性好;采用更符合岭南人饮食的高蛋白饲料,并将舌与小肠的病理结果作为评价指标,严谨性较强。

体征还原度高,操作性强,重复性好;以LPS为致病因子更有利于研究岭南湿热肠道菌群的变化。

以“外感湿热”病机造模,是较好的尝试,操作性强;但体征表现较局限,体征严重程度及持久性略差。

注:没有特别标注造模动物性别的均为雌雄各半或者文献中并未标注,下同。

常丽萍[34]等人探讨不同湿热环境放置时间及致病因子剂量对温病湿热证模型的影响,造模后大鼠均出现体温升高,食量减少,饮水量减少,体重减轻等体征,但以灌服107/(mL·200g)大肠埃希氏菌+28天造模周期的模型稳定性强,齐同性高,体征出现率及严重程度好。笔者通过分析本实验造模结果认为大鼠在灌服致病因子后体征表现更为强烈,证明致病因子是湿热证造模的重要因素。李华锋[35]建立大肠杆菌及MHV-A59 两种不同致病因子的温病湿热证动物模型,小鼠均出现肛温升高,体重减轻,毛发晦暗等体征,但鼠肝炎病毒组体重减轻和四肢瘫痪等表现严重,大肠杆菌组便溏严重,提示我们针对不同的湿热证型选择合适的致病因子。而纳入MHV-A59造模,复制性较好,稳定性强,是一种新的致病因子模型。

张俊英[36]给大鼠灌胃小承气汤与大黄附子汤并给予“湿热环境+高脂饲料+大肠杆菌”制备湿重于热和热重于湿证模型。湿重组大鼠便溏,肛周污秽,嗜睡懒动等体征严重,热重组大鼠肛温升高,饮水量增多,大便干结等体征严重。在此造模过程中,作者强调用口腔灌服的方法感染致病因子,更符合“疫戾邪气从口鼻而入”的湿热证病因。

周祎青[20]等人采用“湿热环境+高蛋白饲料+跑步+灌胃超纯水”的方式制备以脾虚为主的湿热证动物模型。文章根据岭南居民饮食习惯,将常用的高脂高糖饲料改为以60%酪蛋白+24%玉米淀粉+5%大豆油+5% 纤维素+5% 复合矿物质+1% 复合维生素混合构成的高蛋白饲料,更符合发病机理且具有创新型。随着实验的开始,小鼠出现精神倦怠、不思饮食、反应迟钝、毛发晦暗等体征。且根据模型小鼠舌组织及小肠组织病理检测结果判定造模成功。由此可见,湿热证动物模型已将舌与小肠的病理结果作为评价指标。

陈弋[31]等人施加两种不同致病因素脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和肠产毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC),采用湿热环境+高脂饲料建立岭南湿热证小鼠模型。结果显示灌服 ETEC 组小鼠便溏情况严重,且更符合“从口鼻而入”的湿热证发病机制;腹腔注射 LPS小鼠精神萎靡、不思饮食情况严重,且更有利于探讨岭南湿热肠道菌群变化。荣光莉[37]等人排除饮食因素,施以单纯湿热环境造模,小鼠出现嗜卧懒动,饮食减少,毛发晦暗,阴囊下垂等表现。以“外感湿热”病机造模,是一次较好尝试,提供了新的思路。但其动物体征表现较为局限,不能完全复制湿热证临床特点,且体征严重程度及持久性低。

3 脏腑湿热证

湿热为患,虽与季节相关,但往往内应于脏腑而发病。在湿热证动物造模过程中,以脾胃湿热、大肠湿热、肝胆湿热、膀胱湿热较为多见(表4)。

表4 脏腑湿热证造模方法详述

模型

造模对象

造模过程

模型评价

脾胃湿热

 

 

 

 



大肠湿热

 

 

 



肝胆湿热

 






膀胱湿热

SD雄性大鼠

 

SD大鼠

SD大鼠


SD大鼠


SD大鼠


SD大鼠


BALB/c 小鼠


Wister雄性大鼠



Wistar大鼠



Wistar大鼠

普通饲料+ 200 g·L-1蜂蜜水+10 g·kg-1油脂与55°白酒隔日交替灌服(共10天)+湿热环境(共5天)[42]

普通饲料+200g·L-1蜂蜜水+ 15g·kg-1油脂与20 mL·kg-1白酒隔日灌服(分别灌服10天、20天、30天)[43]

高脂饲料(10天)+湿热环境(10天)+灌服2 mL/200 g自来水(1次/天,共8天)+灌服鼠伤寒沙门氏菌(2 mL/200 g),24 h后加强1次(1 mL/200g)[44]

湿重于热:高脂饲料(10天)+湿热环境+2mL/200g60°北京二锅头(1次/天,8天)+灌服大肠杆菌(2mL/200g),24h后加强1次(1mL/200 g)+12 h后灌服,8 mL/200g蒸馏水(2次/天,连续7天)

热重于湿:其余同上+灌服2 mL/200g附子干姜煎剂(1次/天,共8天)[45]

高脂饲料(普通词料加10%蜂蜜,12%猪油制成)+湿热环境(8h/天)+灌胃2mL/只(109个/mL)肠产毒性大肠杆菌,24h后加强1次+24 h后灌胃等体积蒸馏水[49]

高脂饲料(200g·L-1蜂蜜水+15 kg油脂与20 mL·kg-1白酒隔日交替灌服(共20天))+相隔14天注射抗原乳化液1mL(含抗原8mg)+禁食24 h后腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉,并使用TNBs+50%乙醇灌肠[51]灌服10μL/6×108轮状病毒悬浮液+湿热环境(8 h/天,共3天)[52]

一次性灌胃 100 mg·kg-1α-萘异硫氰酸酯花生油,并于 3 天后给予大鼠胆管插管术[54]

灌胃2 mL/100g(50%葡萄糖+50%猪油脂混合液)+湿热环境+灌胃0.5%的异硫氢酸苯酯1次[55]

禁水18 h+腹腔注射40mg·kg-1·2%戊巴比妥钠麻醉+膀胱注射0.5mL大肠杆菌菌液,结扎输尿管+24h后拆线[57]

体征出现率高,操作性强,重复性好;白酒为湿热邪气,温度32±2℃,相对湿度 95% 符合脾胃湿热证发病机制。

以内湿因素为造模依据,操作性强,重复性好;通过对比认为造模20天体征还原度、出现率更高。

体征出现率及严重程度较好,操作性强,重复性好;鼠伤寒沙门氏菌在证候复制中起较大作用。

体征出现率及严重程度较好,操作性强,重复性好;以中药汤剂白虎加苍术汤及清香散对热偏重、湿偏重证候进行治疗,反证其造模方法的有效性。

操作性强,重复性好;但造模参照依据不严谨,夸大了不同湿热分型的共性,忽略了特性。

体征出现率高,操作性强,重复性好;将大鼠证候学指标、病理学指标及免疫学指标作为湿热型 UC 动物造模的评价体系,严谨性较好。


操作性强,重复性好,严谨性强,但对造模后小鼠的一般体征,并未做详细描述。

体征出现率及严重程度好,操作性差,重复性一般。


体征出现率及严重程度较好,操作性强,重复性好。

体征出现率及严重程度较好,操作性略差,重复性一般;且模型复制方法并不完全符合膀胱湿热证的病因病机。

3.1 脾胃湿热

“太阴内伤,湿饮停聚,客邪再至,内外相引”,脾胃是湿热邪气常易侵袭的脏腑之一“湿热之邪始虽外受,终归脾胃”,脾胃湿热证是中医湿热的典型证候,动物实验研究颇多。相关调查显示,脾胃湿热证涉及西医病种约占整体脾胃湿热证的18%[38]。近年来人们将西医疾病发展过程中出现脾胃湿热证的疾病进行结合,制备以幽门螺杆菌相关性胃炎[22]、便应性鼻炎[39]、复发性口腔溃疡[40]、肠易激综合征[41]等常见疾病的脾胃湿热证动物模型,为进一步研究病证机制打下基础。

吕冠华[42]等人施加湿热环境+肥甘饮食制备脾胃湿热证动物模型,大鼠出现体重减轻,饮食量减少,毛发灰暗,大便时干时溏等表现。本实验大鼠体征出现率较高,操作性强,重复性好,且施加白酒为湿热邪气,设置温度32±2℃,相对湿度 95% 更符合脾胃湿热发病机制;翁一洁[43]以高脂饮食+分别灌服10 天、20天、30天白酒的方法制备,大鼠表现为醉卧扎堆,体重增加,嗜睡懒动,毛发无光泽等。本实验将内湿因素作为脾胃湿热证造模的理论依据,认为内湿造模时间定为 20天,其体征还原度、出现率更高。文小敏[44]施以湿热环境+高脂饲料+鼠伤寒沙门氏菌制备,大鼠T淋巴细胞亚群CD4+、CD4+/CD8+降低,CD8+升高。本实验模型大鼠体征出现率及严重程度较好,临床符合度较高,且致病因子鼠伤寒沙门氏菌在证候复制中起到了较大作用。廖荣鑫[45]等人施加致“湿”或致“热”因素白酒或附子干姜煎剂+湿热环境+高脂饮食+大肠杆菌制备湿偏重和热偏重模型,湿重组大鼠便溏,精神萎靡严重,热偏重大鼠便干结,好斗易激严重,灌服大肠杆菌后,表现均加重。本实验模型大鼠体征出现率及严重程度较好,与临床符合度较高;以中药汤剂白虎加苍术汤及清香散对热偏重、湿偏重证候进行治疗,反证了其造模方法的客观性,操作性强,重复性好。

3.2 大肠湿热

有研究表明,大肠湿热证与溃疡性结肠炎关系密切,在辨证要点及治法方药上有相通之处,约占患者总数的 23.37%[46,47]。有学者指出,湿热因素常贯穿于溃疡性结肠炎疾病的发展始终[48]。目前单纯的大肠湿热证动物造模较少,多为溃疡性结肠炎湿热型动物造模。

陈阳[49]等人参照温病湿热证造模方法[50]制备大肠湿热证动物模型,大鼠出现精神萎靡,发热,毛发不光泽,肛温升高,血便和粘液便,不欲饮食,小便短少等现象。由此实验者判定大肠湿热证大鼠造模成功。笔者存在质疑。温病湿热与大肠湿热在临床表现、发病机制等方面具有差异,而实验者根据大鼠造模后的一般状况判定大肠湿热证动物造模成功,夸大了共性,忽略了特性。值得注意的是,这个问题一直贯穿于整个湿热证造模过程中,相似的造模过程却得出不同的湿热证型,提醒我们对湿热证类型的划分予以重视,对湿热证造模指标评价体系应予完善。

翁一洁[51]等人施以高脂高糖饲料+注射抗原乳化液+(三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol,TNBs)+50%乙醇)灌肠制备湿热型溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)动物模型。大鼠出现精神倦怠,嗜睡懒动,不欲饮食,腹泻,血便等体征。通过病理学与免疫学指标胃动素、胃泌素,免疫组化阳性表达明显升高等表现,提示造模成功。此造模方法较为理想,重复性及稳定性较好,体征出现率及还原度高。该模型将大鼠证候学指标、病理学指标及免疫学指标作为湿热型UC动物造模的评价体系,科学性及可行性好。沈健[52]等人采用湿热环境+灌服轮状病毒悬浮液制备轮状病毒湿热型腹泻小鼠模型,通过体重,粪便中隐血,粪便稠度三个指标的平均值评估模型小鼠的损伤程度。操作性强,重复性好,通过腹腔注射黄芩苷以药测证,严谨性较好;但对造模后小鼠的一般体征,并未做详细描述。

3.3 肝胆湿热

肝胆湿热证在临床较为常见,但相关性的动物实验研究较少,多以病证结合形式造模。研究者以患者身目黄染的临床表现为依据,将阳黄证黄疸归于肝胆湿热证范畴[53]。从现代医学角度来看,胆汁淤积会造成身黄目黄小便黄的表现。董伟[54]以此为依据给大鼠一次性灌胃α-萘异硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate,ANIT)花生油,并给予胆管插管术收集4 h内的胆汁,计算分泌量,建立肝胆湿热证动物模型。模型大鼠眼睛黄染,被毛发黄,且病理检测发现大鼠体内、肝内出现胆汁淤积,肝酶水平升高,肝细胞损伤等现象。本实验体征出现率、还原度及病理检测结果均与中医肝胆湿热证候相似,造模方式较好。曲长江[55]等人采用异硫氢酸苯酯灌胃造成大鼠肝损伤+湿热环境+高脂高糖饲料制备中医阳黄证黄疸动物模型。造模大鼠巩膜黄染,耳背皮肤渐黄,倦怠喜卧,被毛枯槁,尿短而黄,大便不爽,肛温升高。本实验依据中医传统病因学理论制备,大鼠体征出现率、还原度及实验指标符合肝内胆汁瘀积性黄疸的病理改变,但只是潜在地分析了阳黄的病变机理及胆红素代谢在茵陈蒿汤作用下的改变,对于茵陈蒿汤的治疗功效需要进一步研究。

3.4 膀胱湿热

膀胱湿热证在临床较为常见,但目前其临床治疗性实验较多,动物模型实验很少。郑小伟[56]把采用“右侧输尿管固定于右侧腹壁外挤出膀胱内残尿并在一天后拆除+膀胱注射大肠杆菌”制备肾盂性肾炎动物模型的方法,归属于膀胱湿热证动物模型造模,丰富了脏腑湿热证动物造模内容。同样的,高丹[57]采用“单侧输尿管半结扎+膀胱内注射大肠杆菌菌液”的方法制备下焦肾(膀胱)湿热证发热模型,模型大鼠体温升高(4 h达到峰值),肺、胃、肾、下丘脑等各组织和血浆中 CRH、P 物质、神经降压素含量明显升高,γ 干扰素和白细胞 4 比值下降,小肠 Occludin 蛋白染色表达呈现弱阳性反应,小肠推进率增加。本实验以湿热蕴结下焦,热毒侵袭膀胱导致急性肾盂肾炎为实验依据,是制备膀胱湿热证动物模型的一次较好尝试。但选用的急性肾盂肾炎模型复制方法并不完全符合中医辨证论治下的膀胱湿热证,且膀胱湿热证在临床上并不都具有高热症状。

4 病证结合湿热证

西医病名加中医证候是现代制备动物模型常见的一种形式,它既有中医基础理论的指导,又结合了西医生理病理理论,有助于人们更深刻的了解疾病发生和发展的全过程,继而发挥中西医结合治疗疾病的辨证优势。临床上湿热证所涉及的疾病很多,病证结合湿热实验占湿热证动物模型实验的 38.6%[58],涉及心血管疾病、肺部疾病、皮肤病、感染性疾病等多方面(表5)。

表5 病证结合湿热证动物模型造模详述

疾病类型

造模对象

造模方法

模型评价

动脉粥样硬化

 

 

 

 

多发性肌炎

 

 

病毒性肺炎

 

 

银屑病

 

登革热

 

痛风性关节炎

自身免疫性

前列腺炎

2 型糖尿病

Wistar大鼠

 

 

SD雄性大鼠

 

豚鼠

 

 

Wistar大鼠

 

BALB/c雌性小鼠

豚鼠

BALB/c小鼠

 

SD雄性大鼠

KM雄性小鼠

 

ICR雄性小鼠

高脂饲料+静注大肠杆菌内毒素2μg·kg-1,每周2次[69]高脂高糖饲料(83.25%普通饲料、1.5%胆固醇、0.25%胆酸钠、10%猪油、5%蔗糖)12周+湿热环境[60]

高脂饲料+湿热环境(5 h/天,共8天)+蒸馏水(2 mL/200g,日1次)+灌服2 mL·g-1大肠杆菌,24 h后加强感染1次(1mL/200g)+项背部皮下注射肌匀浆0.2 mL+弗氏完全佐剂0.1 mL,共8次(8周)[61]

高脂饲料+湿热(3 h/天,隔日1次,共3次)+H1N1滴鼻[62]

高脂饲料+滴鼻50%组织细胞感染量HINI50μL/天/只(隔日1次,共3次)+滴鼻2 h后游泳30 min(共3次)[63]

普通饲料+200g·L-1蜂蜜水+10 mL·kg-1白酒与10 g·kg-1油脂隔日交替灌胃+湿热环境(3h/次,共3次)+5%心得安乳剂涂豚鼠双耳背(日3次,厚度1.0mm,共3周)[64]

普通饲料+12%猪油+8%蜂蜜+湿热环境(2h/天,连续8天)+腹腔与皮下多点注射接种登革2型病毒GZ14株(0.8mL/只,连续3天)[65]

普通饲料+200g·L-1蜂蜜水+0.1 g·kg-1油脂与0.1 mL·kg-152°白酒隔日交替灌胃+湿热环境(8h/天,5天)+右踝关节注50μL25g·L-1浓度尿酸钠溶液到踝关节腔内[66]

高脂饲料+纯净水(日1000 mL)+56°50mL米酒与20%蜂蜜水日交替灌服+湿热环境(4h/天)+皮下注射0.5mL,Wistar大鼠前列腺组织蛋白提纯液,腹腔注射0.5mL弗氏完全佐剂和0.1 mL百白破疫苗(后30d重复注射1次)[67]

高脂饲料3周+腹腔注射链脲佐菌120mg·kg-1[68]

操作性强,重复性好,为“湿热致瘀”导致动脉粥样硬化提供了实验支持,但未列举大鼠体征变化。

操作性强,重复性好,体征还原度高。


操作性强,重复性好,体征还原度高。

 

操作性较强,重复性较好,但模型相应体征缺乏,成功依据不足。

操作性较强,重复性较好,但摘要及结论中提出造模过程加入了湿热因素,造模过程却未见描述。

操作性强,重复性好,体征还原度及出现率高。 

 

操作性强,重复性好,实验指标符合登革热特征,但一般体征与空白组无显著差异。


操作性较强,重复性较好,体征还原度及出现率高。 

操作性强,重复性好,体征还原度及出现率高。

体征还原度及出现率好,重复性好。

4.1 心血管疾病

李华锋[59]等人施加肥甘饮食+大肠杆菌内毒素制备湿热型动脉粥样硬化动物模型,大鼠血脂水平、动脉粥样硬化水平与造模时间、细胞因子NF-κB呈正相关。本研究为“湿热致瘀”导致动脉粥样硬化提供了实验支持,但并没有在实验结果中列举大鼠体征的变化,其造模成功的依据略有不足;柯晓、宋银枝[60]等人施加肥甘饮食+湿热环境制备湿热型动脉粥样硬化大鼠模型,大鼠出现精力不足、活动减少、毛发稀疏暗沉、频繁腹泻等体征。赖名慧[61]将常用的实验性肌炎造模方式+湿热证造模方式结合制备多发性肌炎湿热证动物模型。豚鼠体温升高,皮下出现硬结,皮毛晦暗,精神萎靡,活动量减少,四肢小鼠且呈对称性肌无力,大便溏薄,嗜睡懒动。本实验体征还原度及出现率高,是研究多发性心肌炎的一个较好的模型复制方法。

4.2 肺部疾病

张士金、王伯良[62]等人等施以肥甘饮食+湿热环境+流感病毒甲1型(Hemagglutinin 1 Neuraminidase 1,H1N1)滴鼻制备流感病毒性肺炎湿热证模型,大鼠体温、体重升高,经蒿芩清胆汤治疗症状得到改善。本模型致病条件完善,操作简单,重复性强,但模型大鼠相应体征较缺乏,造模成功的依据略有不足。同样的,毕倩宇[63]等人采用肥甘饮食+H1N1病毒滴鼻+游泳制备,小鼠出现烦躁,呼吸加快,便溏,肛周污秽,饮食减少,倦怠懒动,皮毛晦暗等表现,符合湿热型流感病毒性肺炎表现,但本实验在摘要及结论中提出造模过程加入了湿热因素,造模中却未见描述,笔者认为实验严谨性及结果存在争议。

4.3 皮肤病

王玉芝[64]施加高脂高糖饲料+湿热环境+白酒+涂抹 5% 心得安乳剂制备银屑病湿热型动物模型,豚鼠出现体重减轻,饮食减少,嗜卧懒动,肛温升高,耳背毛发脱落,皮损红肿,覆盖银白色鳞屑,毛细血管扩张等表现。本实验体征还原度及出现率较好,可操作性强,重复性好,且证实了湿热因素可以促进银屑病的发生发展。

4.4 感染性疾病

李玉静[65]等人施加肥甘饮食+湿热环境+登革病毒(Dengue virus,DEN)制备登革病毒感染湿热证动物模型,小鼠血小板计数、肾内髓水通道蛋白 2降低,胃动素、胃泌素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总胆固醇升高。

本实验小鼠实验指标符合登革热特征,但一般体征与空白组无显著差异,这可能与模型动物种类对戈登病毒的非敏感性有关。临床表现是判断疾病类型的重要指标之一,应进一步探讨湿热型戈登病毒感染动物模型,建立符合中医发病机理及临床特征的实验模型。

4.5 风湿与免疫性疾病

郭玉星[66]等人以高脂饲料+湿热环境+踝关节注射50μL尿酸钠溶液制备痛风湿热蕴结动物模型,大鼠出现饮食减少,烦躁,踝关节肿胀,活动不利,毛发枯槁,嗜睡懒动,便溏等表现。本实验体征出现率高,还原度好,重复性强,操作性好,是值得借鉴的痛风湿热型动物模型制备方式。

朱闽[67]等人采用注射大鼠前列腺组织蛋白提纯液、弗氏完全佐剂、百白破疫苗+高脂饲料+湿热环境的方法制备自身免疫性前列腺炎湿热证动物模型,小鼠精神萎靡,饮食量减少,毛发晦暗,便溏,尿黄臭,口唇周围颜色黯淡,舌体肿胀。本实验体征还原度及出现率高,操作简单,重复性强,是值得借鉴的湿热型前列腺炎动物模型制备方式,但仍需对不同品系模型动物进行对照研究,探讨更好的模型制备方式。

4.6 内分泌和代谢疾病

程旸[68]等人采用高脂饲料+腹腔注射链脲佐菌素的方法制备2型糖尿病湿热困脾型小鼠模型,小鼠精神不振,体重增长减缓,活动量减少,皮毛干枯粗糙,饮水次数增加,尿量增多。给予由苍术、黄柏、薏苡仁、黄连组成的四妙颗粒清热燥湿健脾,症状得到改善。“肥者令人热,甘者令人中满,故其气上溢,转为消渴”,本实验符合肥甘饮食导致湿热困脾型糖尿病的中医病因,体征还原度较好,操作性强,重复性好。

5 结果与讨论

5.1 结果

目前,湿热证动物造模在模拟中医发病机理、还原临床表现等方面已较为成熟。在致病因子上,湿热证动物造模经历了从细菌到病毒的过程,并对不同致病因子进行比较发现致病因子的不同会导致模型动物的体征侧重点略有差异,大肠杆菌致病便溏较严重,鼠肝炎病毒致病体重减轻和四肢瘫痪较严重,而与大肠杆菌相比,鼠伤寒沙门氏菌模拟湿热证病因病机更有优势。研究者应将证候与疾病更为紧密的结合,针对不同的疾病选择相应的致病因子,且在致病因子纳入途径上应优先选择与湿热致病传染途径更为相似的灌服法。致病因子的来源应予以明确,不同品牌的药物施以模型动物的作用力略有不同,提示我们不能盲目根据药物剂量的多少进行实验。在湿热环境设置角度,笔者认为应结合当地气候设置对照组与模型组,加大湿热气候对空白组和模型组对比的清晰度,避免在高温多雨的长夏造模。湿温度设置,造模天数长短是影响造模成功的重要因素,湿热证造模温度多控制在30℃-34℃,相对湿度多控制在 90%-95%之间,应对温度与湿度的最优设置值进行对比研究,增加模拟相似度。在饮食角度,应与临床患者饮食习惯相结合,动物造模从来不是单一的实验研究,应时刻与临床疾病关联,对于岭南湿热造模应选用更符合当地人饮食习惯的高蛋白饲料。通过对湿热证动物模型复制体征进行比较可以发现,模型动物以发热(肛温升高)、精神萎靡、皮毛晦暗无光泽、饮食量减少、便溏等多见,但对于尿血、身目黄染、抓挠阴部次数增多等不同证型的湿热证临床症状采用单纯的中医病因造模复制程度差,还原度低,是我们今后需要探究的问题。

5.2 湿热证动物模型现状及优点

经过三十多年的探索,以中医病因学为指导“湿热环境+肥甘饮食+致病因子”的湿热证动物造模不断完善,操作性强,重复性好,能够较好复制人体湿热证的临床表现。在造模方式上,逐渐重视单一因素“外因湿热”、“内因湿热”或致病因子的改变对湿热证造模的影响;在湿热证造模指标上,加入现代科学技术手段检测舌象,利用舌象的病理改变为湿热证动物造模提供评价指标[69-72];在研究范围上更加深入与精细,具有地域特色的岭南湿热证成为近年来湿热证动物造模研究的热点。岭南人对湿热证的研究起步较早,他们以江南地区温病学说为基础,结合自身的区域特点,推陈出新,形成了具有岭南特色的湿热证理论[73]。

广州中医药大学专设温病教研室,应用多学科方法如流行病学、医学地理学等,探讨岭南温病的发病机理[74];在湿热证发病机制上,从血浆内毒素、水液代谢、免疫功能、炎症细胞因子、血脂水平、胃肠激素等多角度进行研究探讨;在反证方剂上,深入探讨中药提取物[17,75]、单味中药[16-20,76]、复方[21-28]、中成药[77-79]等在治疗湿热证时的作用机理,为中药治疗湿热证提供理论依据。

5.3 湿热证动物模型不足及展望

湿热证动物模型目前造模方式较单一,研究人员虽不断探索,但多为在造模过程的变量上进行微小调整,较少考虑其他因素对湿热证的影响,依旧按照“湿热环境+内湿饮食+致病因子”进行造模。脾胃湿热证内因之一为忧思过度,气机郁滞,脾气虚不能化湿从而湿蕴化热,但研究人员在脾胃湿热证造模过程中未考虑情志刺激因素,忽略了不同中医病因对湿热证的影响;在造模评价标准上,判断指标缺乏统一性,以研究人员的临床经验及不同版本的高校医学教材为主,主观性强,这也造成了湿热证造模的发表偏倚判断难度增加,不同文献之间可比性降低等。在湿热证动物造模时,我们应基于病证的临床表现特点,进行微观生化病理指标检测;在研究方向上,扎堆研究现象严重,温病湿热证、脾胃湿热证研究颇多,但对同样临床常见的膀胱湿热证、肝胆湿热证等研究较少。湿热证是一个较大的中医证候,按照不同的分类标准,有湿热温病、脏腑湿热、三焦湿热等,但目前关于三焦湿热的研究颇少,且多为临床治疗经验[80-82];在造模分类上,界限模糊,相似的造模过程得出不同的湿热证型,提示我们对湿热证型划分予以重视,对湿热证造模评价体系予以完善,这也是湿热证动物模型亟需突破的重点问题,也提醒读者要注意未发表的负面实验结果和已发表研究的假阳性结果的发表偏移;在模型符合度上,无法模拟患者的主观感受如“胸部胀闷”“渴不欲饮”等。临床所遇到的疾病以多种因素引起的复杂情形最为常见,疾病是一个动态过程,在发展过程中会出现传变现象。由于个人体质[83]差异性,在面对湿热病邪侵袭时所做出的反应也有所差异,是造模动物所不能复制的,需要进行深入的思考与研究。这也要求研究人员在针对错综复杂的临床证型时,根据中医理论,提取并建立切合临床实际的动物模型。在制模过程中,严格把控施加因子的“度”,把握多因素造模的时间,摸索最佳病证结合点、预防疾病的传变,建立明确的稳定的中医证候动物模型。

参考文献(略)



https://m.sciencenet.cn/blog-279293-1401536.html

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