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CB:中国农大胡永飞组构建整合的鸡肠道微生物组的参考基因和基因组集

已有 1795 次阅读 2021-12-8 15:05 |个人分类:读文献|系统分类:科研笔记

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鸡肠道微生物组的宏基因组组装基因组和基因集助力破译耐药基因组

Metagenome-assembled genomes and gene catalog from the chicken gut microbiome aid in deciphering antibiotic resistomes

Communications Biology [IF: 6.26]

DOI:http://doi.org/10.1038/s42003-021-02827-2

发表日期:2021-11-18

第一作者:Yuqing Feng (封雨晴)1

通讯作者:Yongfei Hu(胡永飞)
(huyongfei@cau.edu.cn)1

合作作者:Yanan Wang(王亚楠),Baoli Zhu(朱宝利),George Fu Gao(高福),Yuming Guo(呙于明)

主要单位:

1中国农业大学(State Key Laboratory of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, 100193 Beijing, China)

摘要

肠道微生物参考基因组和基因集对于深入认识鸡肠道微生物的结构和功能十分必要。通过整合来自10个国家的799份鸡肠道微生物宏基因组样本,本研究组装了123,39个株水平鸡微生物基因组并构建了一个含有1660万个非冗余基因的基因集。所组装的基因组中有893个种和38个属为可能的新种和新属。研究发现鸟乳杆菌和卷曲乳杆菌是鸡肠道中最普遍存在的微生物物种;糖苷水解酶是丰度最高的碳水化合物活性酶。耐药基因组分析结果显示,与欧洲来源的鸡相比,中国来源的鸡样本中耐药基因的丰度较高,但多样性较低;宿主类别对肠道微生物耐药组的影响高于地域差异。该研究建立了目前国际上最大的鸡肠道微生物参考基因组和基因集,并通过耐药组分析证实了该数据集在挖掘鸡肠道微生物功能基因中的重要价值

背景

鸡是人类重要的肉蛋来源,据估计全世界存栏的鸡只数量超过600亿。鸡的肠道内定殖了大量的微生物,这些微生物在营养物质代谢、免疫系统发育、病原微生物清除、饲料有效利用等方面发挥了重要作用。认识鸡肠道微生物的群落结构和功能对促进鸡的健康生长、提高生产效率至关重要。

近年来,宏基因组学研究极大促进了我们对鸡肠道微生物的组成结构、多样性及基因功能的理解和认识。鸡肠道菌群以厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门为主;虽然鸡肠道微生物基因序列与人和猪肠道微生物基因序列有所不同,但是执行的功能却相似。其中,碳水化合物活性酶作为分解植物来源纤维、降解膳食碳水化合物的酶,在鸡及其它动物肠道微生物研究中备受关注。例如,有研究从鸡肠道微生物的155个宏基因组组装的基因组中鉴定出超过8000个碳水化合物活性酶基因;从牛瘤胃的4941个微生物基因组中,发现有442917个基因与碳水化合物代谢有关。除了这些与营养物质代谢有关的基因之外,鸡肠道微生物还被认为是耐药基因的储存库。这些耐药基因可通过水平基因转移进行扩散和传播,对人类健康构成潜在威胁。

虽然高通量测序加深了人们对肠道微生物的了解,但是缺乏完整的肠道微生物参考基因组和基因集是阻碍我们深入认识肠道微生物具体功能的重要因素之一。目前,有关人和动物的多个肠道微生物参考基因集和宏基因组组装基因组的数据集已被建立。在鸡中,有研究通过对中国7个不同农场的495个鸡的样本进行分析并构建了一个包含900万个微生物基因的基因集;我们前期利用从活禽市场采集的130个家禽肠道微生物样本也构建了一个同等基因数量的基因集。在宏基因组组装基因组方面,英国研究者率先利用24个鸡肠道宏基因组数据组装了469个细菌参考基因组;最近,鸡宏基因组组装的参考基因组的数量被扩大到了5595个。

本研究结合前期宏基因组测序数据及其它来自中国和欧洲国家的鸡肠道微生物宏基因组数据,构建了一个整合的鸡肠道微生物参考基因组和基因集合通过多种生物信息学工具和数据库对组装的基因组和基因集进行了注释、分析同时,研究比较了鸡和人肠道微生物的耐药组的差异并分析了宿主和地域对这种差异的影响这些基因组和基因资源的整合对于了解鸡肠道微生物组的结构和功能至关重要

结果

从鸡肠道微生物宏基因组数据中组装获得12339个微生物基因组

Assembly of 12,339 MAGs from chicken gut microbiome sequencing data

研究通过以下流程对来自中国和欧洲的799个鸡肠道微生物宏基因组数据进行分析,获得宏基因组组装基因组并构建基因集(图1)。经过单一样本组装和混合组装,研究得到12339个高质量的株水平非冗余基因组和1978个种水平非冗余基因组(图2a)。其中最主要的细菌门是Firmicutes A,其次是Bacteroidota。通过与已知微生物基因组和已发表的鸡肠道微生物的宏基因组组装基因组进行比较,发现新组装的基因组中有893个种是候选新种、38个属是候选新属。8个种水平古菌基因组中有4个是候选新种,都属于Thermoplasmatota。绝大多数样本的宏基因组数据中有超过85.0%的序列能够比对到株水平基因组,说明这些基因组具有很好的代表性。以1×覆盖度作为阈值,有10657个株水平基因组在小于50个样本中有分布,仅有43个基因组在超过300个样本中有分布(图2b),说明核心微生物数量较少。

图 1 组装、构建、注释和分析基因组和基因集的步骤以及相应的生物信息学工具

Flowchart of the steps and bioinformatic tools applied in assembling, constructing, annotating, and analyzing the reference genomes and microbial gene catalog

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整合了来自十个国家的 799 个鸡肠道微生物组样本的宏基因组测序数据。MAGs(完整性超过 80%,污染低于 10%)分别以 99% 和 95% 的 ANI(平均核苷酸同一性) 聚类到菌株级别和物种级别的基因组箱中。对完整基因进行聚类以生成 1660 万个非冗余基因集。对基因的功能进行了注释,以分析鸡肠道微生物组中的 CAZymes(碳水化合物活性酶)、毒力因子和质粒模式。

接下来,研究建立了一个包含1660万个非冗余基因的鸡肠道微生物基因集(GG-IGC);这一基因集的大小是已报道的鸡微生物基因集(CGM-RGC)的1.8倍。GG-IGC中63.1%的基因是完整的,4987193个基因分属于10665个不同的KOs,而CGM-RGC中2611763个基因分属于10046个不同的KOs。此外,GG-IGC和CGM-RGC中分别有68.2%和77.0%基因能够被eggNOG所注释(图2c)。这些结果表明,所构建的GG-IGC极大扩展了当前鸡肠道微生物基因数量,有助于在今后研究中更好地表征鸡肠道微生物群落特征和功能。此外,鸡肠道微生物基因集中存在大量功能未知的基因,说明鸡肠道中存在众多尚未被认知的微生物,有待深入研究

图 2 从799个鸡肠道微生物宏基因组样本组装得到12339个基因组和1600万个非冗余基因集合

Metagenome-assembled 12,339 reference genomes and 16,565,684 nonredundant genes from 799 chicken gut microbiomes

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a 1970种细菌和8种古菌的进化树。物种分类由GTDB-Tk分析得到,内圈到外圈分别代表了门、新种和新属。外圈柱长度代表每一个物种下菌株的数量;

b 12339个参考基因组在所有样本中的分布;

c 本研究中整合的基因集和已发表的鸡肠道微生物基因集的eggNOG和KEGG注释比较。CGM-RGC为已发表的鸡肠道微生物参考基因集合,GG-IGC为本研究得到的整合基因集。

研究随后着重分析了鸡肠道微生物组中的碳水化合物活性酶基因的构成和分布。从所构建基因集中一共注释得到565262个编码碳水化合物活性酶的相关基因,分属于371个碳水化合物活性酶子类。糖苷水解酶(GH)类在鸡肠道中含量最为丰富,其次是糖基转移酶(GT)和碳水化合物结合模块(CBM)。超过95%的鸡肠道样本中都存在212种碳水化合物活性酶子类酶基因的分布,平均相对丰度范围从9.1×10-7到3.2×10-3不等(图3a),表明碳水化合物活性酶基因广泛分布于鸡肠道微生物中。糖苷水解酶和糖基转移酶类的碳水化合物活性酶基因在鸡肠道微生物中占绝对优势,其中GT2和GH13丰度最高(图3b)。十个国家的鸡肠道微生物中酶基因的含量不同,差异主要体现在糖苷水解酶类基因,如GH13、GH23、GH25、GH1、GH2和GH3(图3c),这些基因与纤维素和淀粉降解密切相关。上述结果提示鸡肠道微生物在碳水化合物代谢中的能力具有个体差异,可能是由于不同国家鸡的品系、饲养条件和饮食差异所导致

图 3 碳水化合物活性酶基因在鸡肠道样本中的分布

Distribution of CAZymes in chicken gut samples

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a 371个碳水化合物活性酶子类酶基因的相对丰度中位数和分布;

b 丰度最高的10个碳水化合物活性酶子类酶基因;

c 10个国家之间差异最显著的40个碳水化合物活性酶子类酶基因。颜色范围代表相对丰度Z值的中位数。

鸡与人肠道微生物耐药组的差异和影响因素

Country-specific chicken gut antibiotic resistomes and comparison with that in humans

研究使用宏基因组组装的基因组和基因集来分别探索鸡肠道微生物耐药组。对宏基因组组装的基因组分析发现,12339个株水平基因组中仅有1388个基因组含有耐药基因,共235种。相对普遍的耐药基因包括lnu(C),mdf(A)和ant(6)-Ia。Escherichia,Romboutsia和Enterooccus三个属包含耐药基因数量最多(图4a)。组装基因组层面的耐药组分析可能低估了耐药基因的数量并存在偏好性,主要由于基因组组装过程对结构复杂的携带耐药基因的可移动遗传元件的低回收率所导致。

图 4 鸡肠道微生物耐药组及宿主和地域的影响

Profiling the antibiotic resistome in the chicken gut microbiome

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a 不同物种分类层级的基因组中耐药基因的数量。从内到外分别代表门水平至属水平。颜色深浅表示属于特定分类群的基因组中耐药基因数量的平均值;

b 不同国家来源样本中耐药基因的相对丰度;

c 不同国家来源的样本中耐药基因的香农指数;

d 微生物与耐药基因之间相关性的普氏分析;

e 质粒与耐药基因之间相关性的普氏分析;

f 普氏分析(d)和(e)中残差的小提琴图;

g 鸡与人肠道微生物组之间共有的耐药基因数量的比例。C[CN]、C[EU]、H[CN]和H[EU]分别表示中国来源鸡肠道微生物样本、欧洲来源鸡肠道微生物样本、中国人肠道微生物样本和欧洲人肠道微生物样本;

h 鸡和人肠道微生物中耐药基因的相对丰度;

h 中国和欧洲来源的鸡和人肠道微生物耐药组的主坐标分析。

随后,研究对构建的基因集进行了耐药组分析。发现来自中国鸡样本的肠道微生物中耐药基因的相对丰度高于意大利、法国、荷兰、德国、英国等(P < 0.05)。但是,中国鸡源样本耐药基因的多样性较低,低于波兰、西班牙、意大利、德国等(P < 0.05,图4b,c)。耐药基因的相对丰度和多样性在英国的样本中均最低(P < 0.05)。鸡肠道微生物耐药组与质粒组成的关系相比微生物组成更为密切[相关性:0.201(微生物)与0.617(质粒),P < 0.001,图4d-e],残差分析进一步证实了这一结果(P < 0.05,图4f)。

进一步,研究对人肠道微生物基因集(990万基因)进行了耐药基因的注释,并比较了人和鸡肠道微生物耐药组的差异。结果表明:1)鸡肠道微生物中耐药基因类型的数量显著高于人(304比179),中国人和鸡肠道微生物中耐药基因的相对丰度高于欧洲来源的人和鸡样本。2)来自同一宿主的肠道样本,无论是鸡还是人,共享的耐药基因数量高于来自不同宿主(中国和欧洲鸡样本中87.8%的耐药基因共享,中国和欧洲人样本中89.4%的耐药基因共享)。3)中国人和鸡样本共享的耐药基因数量略高于欧洲样本(42.3%比40.8%)。4)地域因素对耐药组的影响低于宿主类别的影响(图4g-i)。

结论

通过整合不同国家鸡肠道微生物宏基因组数据,本研究极大扩充了鸡肠道微生物参考基因组的数量和基因集的大小。这些数据为后续鸡肠道微生物的功能研究和物种分类奠定了基础。同时,研究揭示了质粒在塑造肠道微生物耐药组中的作用以及耐药基因的宿主特异性差异研究整合得到的参考基因组和基因集数据存储于中国科学院微生物研究所国家微生物科学数据中心(https://nmdc.cn/icrggc/),供公开获取和下载使用

Reference

Yuqing Feng, Yanan Wang, Baoli Zhu, George Fu Gao, Yuming Guo, Yongfei Hu.Metagenome-assembled genomes and gene catalog from the chicken gut microbiome deciphering antibiotic resistomes. Communications Biology, 2021, 4:1305. http://doi.org/10.1038/s42003-021-02827-2.



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