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《自然—细胞生物学》:中科大姚雪彪/刘行合作团队发现微管动力学调控新机制

已有 2829 次阅读 2022-12-20 17:53 |系统分类:论文交流

细胞是生命活动的最小单元,蛋白质是生命活动的主要执行者。蛋白质的物理化学性质与动态化学修饰是决定细胞命运抉择可塑性的物质基础。细胞的精准分裂有利于纺锤体微管与染色体着丝粒的动态作用,但纺锤体微管如何维系与着丝粒的动态连接机制至今仍不甚清晰。


北京时间2022年12月20日凌晨0时,中国科学技术大学无膜细胞器与细胞动力学教育部重点实验室姚雪彪刘行课题组联合攻关团队在Nature Cell Biology杂志上在线发表了题为“Phase separation of EB1 guides microtubule plus-end dynamics的研究论文。


该研究揭示了液液相分离驱动EB1蛋白形成纳米催化器的物理化学机制,解析了从酵母到人进化上保守的EB1相分离的化学代码,阐明了EB1相分离驱动纺锤体微管正端与染色体动态衔接的物质基础。

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在系统性对微管正端追踪蛋白质机器调控细胞分裂质量新机制解析的过程中,作者利用掠入射-结构光照明(GI-SIM)和晶格结构光照明(Lattice-SIM)等超高分辨率显微成像技术对活细胞实时成像时,发现邻近的微管正末端定位的EB1-GFP 彗星状结构能够发生快速的融合(图1A-B),预示着EB1蛋白存在潜在的相分离能力。借助新近发展的活细胞蛋白相分离检测工具—optoDroplet【1】以及体外相分离实验,作者证实了EB1蛋白具有蛋白质液液相分离的性质(图1C-D)。在探索介导EB1蛋白发生相分离的内在因素时,作者依据结构信息将EB1划分为四个区域(包括一个内在无序区域IDR),发现每个区域的缺失均会削弱其体外相分离的能力。利用核磁共振波谱学分析,表明EB1蛋白的各个区域间均存在弱相互作用力,提示EB1蛋白分子间各区域的多价弱作用驱动其发生液液相分离,因此EB1蛋白完整性对于其蛋白相分离性质至关重要。

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图1 超高分辨率细胞成像表明EB1蛋白具有潜在的蛋白相分离能力。A. COS-7细胞中转染EB1-GFP和mCherry-tubulin质粒,并进行GI-SIM超高分辨率活细胞成像,观察EB1形成的彗星状状结构细胞内的融合现象。B. HeLa细胞中转染EB1-GFP质粒,利用Lattice-SIM进行超快速四维立体活细胞成像,观察EB1形成的彗星状状结构在的融合。C. 利用optoDroplet工具,通过蓝光诱导在COS-7细胞中观察EB1蛋白液滴的形成以及融合。D. 对COS-7细胞中形成的EB1液滴进行荧光漂白恢复实验表明液滴的流动性。

课题组先前的研究表明IDR区域正电荷氨基酸残基的突变能够显著抑制细胞中EB1的微管正端追踪能力【2】,但是功能机制未知。在此项研究中,作者发现这些正电荷氨基酸突变(KR6Q)抑制EB1相分离能力却不影响EB1与其它微管正末端蛋白的相互作用,提示这些正电荷氨基酸残基通过介导EB1相分离调控其微管正末端追踪能力。为了进一步揭示EB1蛋白相分离背后的物理化学规律,作者利用粗粒化模型和CPA模型进行分子建模和理论计算,与生化实验结果一致:KR6Q突变体破坏EB1分子间的相互作用,抑制EB1蛋白相分离能力。

为了解析EB1蛋白相分离对微管正端追踪蛋白质机器动态组装和微管动态性的调控机制,作者首先纯化了基于SxIP基序结合的+TIPs MCAK和TIP150以及基于CAP-Gly基序结合的+TIPs CLIP170和p150Glued等,并在体外观察其共相分离行为,结果只有基于SxIP基序结合的+TIPs能够促进EB1蛋白相分离。为了揭示EB1蛋白相分离的生物学功能,作者将EB1相分离缺失突变体KR6Q转入敲除内源性EB1的HeLa细胞中,通过活细胞表型分析等确认EB1蛋白相分离通过调控纺锤体微管动态性维系细胞更新质量控制和基因组的稳定性。

鉴于EB1蛋白翻译后修饰在细胞分裂过程染色体稳定性维系中的重要性【3】,该研究成果进一步揭示了EB1调控细胞分裂引擎纺锤体可塑性的物理化学机制,为全面理解EB1对细胞分裂质量的调控提供线索。研究团队表示,下一步将继续深入探索EB1蛋白相分离依赖的和相分离非依赖的调控机制,解析基于CAP-Gly基序结合EB1的+TIPs如何与EB1蛋白联动调控微管动态性的机制,为染色体不稳定性介导疾病的精准干预提供科学依据。

无膜细胞器与细胞动力学教育部重点实验室宋晓玉特任副研究员、杨丰瑞博士、博士研究生杨通通丁明瑞博士、博士研究生李林格,武汉大学博士研究生汪勇为本论文的共同第一作者。姚雪彪教授刘行教授为该文的共同通讯作者。武汉大学姜恺教授,中国科学院生物物理研究所李栋研究员,中国科学院分子细胞卓越中心李林研究员,湖南大学袁凯教授,清华大学李丕龙教授,中国科学技术大学项晟祺教授、许超教授、王志凯研究员、符传孩教授、臧建业教授、侯中怀教授和施蕴渝教授等课题组参与了该项研究。该研究得到了科技部、国家自然科学基金委、教育部、中科院、安徽省以及合肥微尺度物质科学国家研究中心的资助。

研究过程中,南方科技大学张明杰教授、北京大学程和平教授、清华大学陈晔光教授、合肥微尺度物质科学国家研究中心罗毅教授及清华大学俞立教授给予了技术支持。

相关论文信息:

https://doi.org/10.1038/s41556-022-01

1. Shin, Y. et al. Spatiotemporal Control of Intracellular Phase Transitions Using Light-Activated optoDroplets. Cell 168, 159-171 e114 (2017).

2. Xia, P. et al. Superresolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol Biol Cell 25, 4166-4173 (2014).

3. Song, X. et al. Dynamic crotonylation of EB1 by TIP60 ensures accurate spindle positioning in mitosis. Nat Chem Biol 17, 1314-1323 (2021).




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