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钾离子通道研究35年

已有 1190 次阅读 2022-8-15 18:09 |系统分类:人物纪事

1987年,两个独立小组采用同样技术克隆出钾离子通道基因,启动了一场研究离子通道的历程。

神经冲动以一种称为动作电位的电信号串的形式在细胞中传递,动作电位产生于离子穿过神经元膜时电压的快速变化。自第一次被提出以来,介导这一过程的跨膜离子通道蛋白已经吸引了科学家半个多世纪。这些通道不仅选择它们喜欢的离子类型-(Na+),钙(Ca2+)或钾(K+) -而且还能感知跨膜电压的变化,并通过调节离子通过其孔道的流动做出反应。1987年,由Mark Tanouye1领导的一个小组,以及由LilyYuh-Nung Jan2领导的另一个小组,在理解电压门控离子通道方面迈出了关键的一步,确定了第一个编码K+通道的基因。他们的工作开启了一场调查海啸的大门,最终确定了大量K+通道的高分辨率结构。

为了了解蛋白质的特性,我们需要确定它的外观和功能。这其中的关键是对蛋白质氨基酸序列的了解,这是由编码它的基因决定的。首先,有必要确定基因及其在基因组中的位置。

1977年,有人提出一个名为Shaker的基因编码了一个K+通道。携带该基因突变的果蝇在麻醉下表现出抖腿现象,而野生型果蝇在使用K+通道阻滞剂时也出现了同样的现象。TanouyeJan团队独立克隆了Shaker,但他们使用了类似的方法,称为染色体步移技术。这项技术涉及克隆基因组DNA的重叠部分,从一段与震动基因座周围区域形成双链的DNA开始。然后,研究小组在果蝇大脑的信使RNA文库中寻找相应的序列,并发现了一个与之前克隆的Na+通道5的预测结构相似的序列。

Na+通道序列编码由4个相似重复序列组成的长多肽,产生准四聚体蛋白,K+通道序列较短,相当于Na+通道中只有一个重复序列。与每个Na+通道重复序列一样,克隆的K+序列编码的蛋白质被预测包含7个跨膜区域(很快被修正为6)。将mRNA注射到青蛙卵中,产生了快速灭活K+电流,与在苍蝇肌肉中记录的类似。K+Na+通道,以及同年发现的Ca2+通道,被认为属于电压依赖性离子通道超家族。

JanTanouye团队慷慨地与其他研究人员分享了他们克隆的DNA,导致该领域的发现激增。一个研究领域的大团体迅速形成,开展严谨、高质量的科学研究。在接下来的几年中,通过识别与Shaker7相似的序列,克隆了大量不同的K+通道编码基因。

很明显,K+通道是一个大家庭。每个基因编码四聚体的一个亚基,来自不同基因的亚基可以混合和匹配(相比于较大的Na+Ca2+通道的固定亚基组成);在此过程中,他们产生了各种类型的K+通道,具有一系列属性。这表明,这些通道在不同的组织和生理需要的不同时间有差异表达。

K+通道的丰富,加上新发现的操纵基因的能力,使该领域取得了惊人的快速进展。到20世纪90年代中期,对K+通道的相当详细的工作机制解释开始出现(参考文献8)

据认为,K+通道由4个亚基对称排列在一个中央水离子传导孔周围,该孔容纳多个离子排成一列(1)。为了更好地理解孔衬里区域,需要重新设计最初提出的结构,添加一个“重入环”,其中最后两个跨膜段之间的环将一部分进入膜中。该循环包括一个进化保守的“签名序列”,负责这些通道对K+9的选择性。研究发现,Shaker蛋白的氨基末端有一个区域负责“球链”通道的快速失活,而羧基末端区域负责较慢的失活过程。第四个带正电的跨膜部分被称为电压传感器,因为它负责调节动作电位期间通道活动的急剧变化。

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1 |从钾离子通道克隆到结构。1987年,两组研究人员首次克隆了编码钾离子通道的DNA 1 - 3。该通道被称为Shaker,被预测包含7个跨膜段(漫画改编自参考文献3的图6)。到1991年,实验分析使研究人员预测,K+通道是围绕在中央水孔8周围的四聚体(这些卡通画改编自参考文献8的图2,仅描述了四个亚基中的两个,以突出离子传导孔)。有人提出通道可以采用封闭、开放或失活的构象,最后一种构象由氨基末端的“球链”结构域赋予,该结构域可以阻断孔道以失活通道。自1998年以来,K+通道在闭合、开放和失活构像中的高分辨率结构验证了这一模型。在这些带状结构中,显示了两个通道亚基(灰色),孔在中心。紫色球体代表孔隙中的K+离子。橙色的丝带代表球链结构域,它堵住了一个打开但不活跃的栅极孔。

 

然而,仍然存在关键问题。研究人员知道蛋白质区域涉及电压感知、失活和选择性,但这些过程的机制仍然是一个谜。需要对这些渠道的架构和细节有直接的了解。

1998年开始,一种被称为x射线晶体学的结构生物学技术开始提供一些答案。离子通道的第一个晶体结构是一个名为KcsA的小K+通道,它是在一个细菌基因组中根据其与K+签名序列的相似性被识别出来的。KcsA是一个仅由孔隙区域组成的最小通道。这可以作为一个稳定的生化样品,在数量上足以生长x射线晶体学所必需的蛋白质晶体的3D有序阵列。 1998年,麦金农博士测出了钾离子通道的立体结构,震惊了所有的科学团体。诺贝尔化学奖评选委员会对此评论:由于他的发现,人们可以“看见”离子是如何通过由不同信号控制开关的通道了。

KcsA结构验证了多年的生物物理研究。最后,研究人员可以“看到”该通道是如何从其氨基酸构建块组合在一起的,并可以可视化结合在孔隙中的K+离子、排列在孔隙中的基团以及蛋白质-离子之间的相互作用。这让我们对离子选择性和缓慢失活有了更深入的了解。在接下来的十年里,细菌和哺乳动物的几种K+通道结构以原子分辨率陆续得到了解决,每一种结构都引发了一系列结构-功能研究和分子动力学模拟。

2013年,低温电子显微镜技术的出现为离子通道结构打开了闸门,使得在不需要结晶的情况下测定高分辨率的蛋白质结构成为可能。现在有可能获得多种构象的离子通道结构(如“球链”失活状态),以及与相互作用的蛋白质,共同纯化或从天然组织分离的复合物。在细胞膜和细胞内细胞器中原位可视化离子通道的梦想现在已经触手可及。 

我们对K+通道基因和结构的了解大大扩展了我们对神经元信号传导的理解。例如,几十年前,研究人员就知道,只有Na+K+通道对各自的离子都有选择性,并且它们的门控被精心安排,使Na+通道打开,允许Na+流入,然后K+通道打开,允许K+流出,神经元的动作电位才可能发生。结构生物学不仅使我们了解这些通道如何实现选择性、感知电压和失活。它还揭示了Na+通道比K+通道具有更快的电压传感器,这就解释了它们为什么能如此精确地确定打开时间。因此,我们最终可以理解和模拟神经元的电反应,打开了调制它们的可能性。

此外,高分辨率结构的大量解析导致了基于结构的药物设计的激增。离子通道故障是导致无数疾病的原因,通道被证实是治疗高血压、焦虑和癫痫等疾病的药物靶点。然而,直到最近,由于缺乏不同构象的结构,以及研究人员通常希望以几个相似的通道中的一个为目标,合理的药物设计一直是困难的。由于高分辨率结构,现在可以将功能状态分配给不同的通道构象。因此,药物可以被设计成针对特定状态下的特定通道,在通道和辅助亚基之间的特定接口。基于结构的虚拟和实验性药物筛选与设计正在如火如荼地进行。

展望未来,我们对离子通道如何组装成大型超分子复合物,以及它们如何与膜相互作用以调节各种形式的信号传递的理解的发展将是令人兴奋的。特别是,观察离子通道是如何沿着神经元投射和朗维叶节点(神经元绝缘鞘的间隙)联系或分离的,应该会对神经冲动在大脑中的传播产生前所未有的见解。

看到Shaker 的克隆产生了如此持久的影响是令人敬畏的。JanTanouye团队分享他们宝贵的震动克隆人的关键决定为几十年的科学成就留下了遗产。

 35 years of channelling potassium ions (jitui.me)



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2 郑永军 张俊鹏

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