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科微学术 | 基于共聚焦荧光成像的单细菌挑选测序同步揭示肠道细菌的分裂模式及种属分类

已有 926 次阅读 2022-12-30 11:28 |系统分类:论文交流

上海交通大学医学院分子医学研究院杨朝勇教授和王炜副研究员团队的文章“Integrated identification of growth pattern and taxon of bacterium in gut microbiota via confocal fluorescence imaging-oriented single-cell sequencing”于2022年9月26日在mLife正式上线。该研究开发了一种基于共聚焦荧光成像的单细菌挑选测序方法，可对共聚焦下呈现特异荧光信息的感兴趣细菌进行直接挑选和测序，获得其分类学信息，实现了对复杂细菌样品的“所见即可知”。这一工作得到了中国科学院长春光学精密机械与物理研究所李备研究员团队的合作支持。

背景介绍

目前单细胞测序技术已被应用于肠道菌群等复杂微生物的研究，但其往往仅能提供细菌的基因组信息，难以将其与显微成像观察到的细菌表型信息进行关联。因此亟需开发一种新的方法，能够将共聚焦荧光成像与DNA测序这两个细菌研究中较常用和基础的技术进行同步利用。

科学发现

1. 方法建立

该研究首先利用能够代谢标记肽聚糖的D型氨基酸荧光探针（FDAA）作为工具，通过使用红绿两种FDAA探针对小鼠进行序贯灌胃，在体标记后获得带有双色荧光的肠道菌群（两种颜色在细菌上的分布可反映其分裂情况）。然后将样品加到带有坐标信息（可进行定位）和特殊涂层（用于激光弹射分选）的芯片上，风干后进行共聚焦成像并记录感兴趣细菌的位置。之后将芯片转移到单细胞分选仪，把相应细菌挑选到无菌管内，破壁后利用MDA进行DNA扩增，用于后续的16S rDNA和全基因组测序分析。作者将这一方法命名为FLCiSS（combining fluorescent probe labeling and confocal imaging with single-cell sorting and sequencing）（图1）。

图1 FLCiSS检测流程示意图

2. 基于FLCiSS鉴定肠道单细菌

根据细菌的标记模式和形态共挑选了210个细菌，最终成功鉴定出其中的59个。图2展示了部分细菌的荧光及分选前后的明场图像，包括Anaerotignum属、 Butyricicoccus属和Lachnospiraceae门的3个细菌，其绿色信号分布于两端 (图2A-C)，提示其可能为二分裂细菌；Flavonifractor属的一个细菌，两种信号在两端的分布不对称（图2D），提示其可能刚完成分裂（一端的红色信号来自母细胞septum上的标记）。此外，对一个具有典型分节丝状菌（SFB or Candidatus arthromitus，图2E）形态的细菌，挑选后测序也鉴定为SFB。

图2 基于FLCiSS获得的代表性肠道单细菌成像及分选前后图

此外，作者还选择了10个已成功进行16S rDNA测序的样本进行全基因组测序，最终成功获得4个细菌的基因组信息（完整度为45.3%-97.8%），说明FLCiSS也可以用于获得较高质量的单细菌基因组。

总结展望

该研究利用分子探针活体标记策略，与共聚焦成像及单细菌分选测序相结合，开发了一种无需体外培养即可同时获得单细菌基因信息和生长分裂表型信息的方法。鉴于这一方法的普适性，其有望成为各类复杂细菌体系研究中一种重要的通用策略。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/mlf2.12041
引用本论文：Gao J, Sun D, Li B, Yang C, Wang W, Huang W. Integrated identification of growth pattern and taxon of bacterium in gut microbiota via confocal fluorescence imaging‐oriented single‐cell sequencing. mLife. 2022.

https://doi.org/10.1002/mlf2.12041

——期刊新媒体部科微学术出品

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