2020年6月5日，波兰卡托维兹西里西亚大学的Marek Marzec和德国莱布尼茨植物遗传和作物研究所的Goetz Hensel在Trends in Plant Science发表了题为“Prime Editing: Game Changer for Modifying Plant Genomes”的文章。

Prime Editing, 最开始由哈佛大学博德研究所David R. Liu实验开发的，可以在不产生DSB或引入供体DNA的情况下实现基因组遗传信息的重新编写。相关研究在2019年10月21号发表在Nature杂志上。Prime Editing将基因组编辑提升到了一个新的水平，这种方法允许引入所有突变类型，包括插入、缺失和12种碱基-碱基转换。这项技术最初在人体细胞中进行研究，主要是期待解决由碱基突变引起的人类遗传病问题。随后仅仅半年时间，中科院遗传发育生物学研究所高彩霞团队首次将此系统应用于植物，相关工作于2020年3月16日发表在Nature Biotechnology 杂志上，Prime Editing 编辑器将引领基因组编辑领域新方向。

靶向基因组修饰是一种强有力的研究工具，可以简单有效地直接靶向修饰基因组序列，从而加快基因功能分析研究。通过引入有利的等位基因，可以加快育种进程。原核生物免疫系统在这一领域的重大突破是其在CRISPR/Cas系统的应用。RNA引导的核酸酶在sgRNA的引导下在基因组特定区域产生DSB。当通过NHEJ DNA修复途径时，在目标序列中可引入插入或缺失(indels)突变。基因组编辑领域的另一个里程碑事件是实现单碱基编辑，包括所有的四个转变:C→T、T→C、A→G和G→A。最近，Anzalone等开发了一个新的系统—Prime Editing,它可以引入indels和所有12个碱基到碱基的转换(包括转换和颠换)，而不引发DNA双链断裂。这是一个真正的游戏改变者！因为以前的技术要么一次只改变一个碱基，要么是需要引入修复模版。通过将具有双重功能的融合蛋白（脱氨酶活性和内切酶活性）和经过修饰的RNA结合起来，Prime Editing将允许编辑启动子区或非编码区，并使等位基因替换更加容易可行。同时，这不需要引入除草剂抗性等选择标记。在这个新方法中，sgRNA被prime editing guide RNA (pegRNA)取代，pegRNA不仅驱动内切酶，还包含引物结合位点(primer binding site, PBS)区域。PBS区域引入可以和逆转录酶(RT)结合序列，并以pegRNA的序列作为模板直接从pegRNA复制信息来引入到目标序列中。这种技术在人类细胞中可以引进12个点突变，实现范围是PAM上游3bp到下雨29 bp，插入达44 bp，缺失达80 bp。值得注意的是，Prime Editing的效率与碱基编辑器相似，但特异性比以往系统更高。特异性提高的原因是以往的CRISPR/Cas系统中，只有一种杂交即sgRNA与靶DNA的杂交。而在Prime Editing系统中，有三种杂交事件:靶DNA和pegRNA的间隔序列之间的杂交;目的DNA与PBS之间的杂交;靶DNA与RT产物之间的杂交。

Prime Editing系统设计

高彩霞课题组首次在植物中对此系统进行了改造，结果表明，在水稻中利用Prime Editing可以产生各种类型的单碱基替换(效率为0.2-8.0%)，插入最多15 nt，缺失最多40 nt。然而，这种系统编辑效率不如基本编辑器。这是第一次在植物中进行Prime Editing，作者提出了提高基因组编辑效率的解决方案。首先，用菜花花叶病毒(RT- camv)的RT或大肠杆菌(RT-retron)的RT代替鼠源白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT）。发现含有RT- camv或RT-retron的载体基因组编辑效率低于M-MLV RT。而采用突变版本的M-MLV RT (D200N/L603W/ T330P/T306K/W313F)，与未突变的M-MLV RT相比，点突变的效率上有1.6 - 5.1倍的提高。因此可以通过融合不同RTs来设计新的系统，进一步提高其效率。此外，pegRNA的设计对编辑效率有很大的影响。在OsCDC48-T1的情况下，引入长度为9-nt RT模版是7-nt版本效率的3倍之多。同时，PBS的长度（6-16 nt）也影响编辑效率。尽管所有设计相同，不同的靶标位点也影响的编辑效率。此外，外界环境也会影响反应，37°C反应条件优于26°C的反应条件。

植物中Prime Editing载体设计

在人类细胞中，未修饰的DNA链上的一个小切口使原始编辑系统的效率提高了三倍。然而，在植物中这个结果是未知的。Lin等没有在植物中检测编辑的特异性。但据推测，与人类细胞类似，由于Prime Editing杂交事件的增多，脱靶机率应该会减少。

Prime Editing是一种新的、强大的植物基因组编辑工具。它提供了几乎无限的可能性，可以有效地引入点突变和小的indels，而不需要引入修复模板。对该系统的进一步改进应着眼于提高编辑效率，主要通过优化不同的RTs和pegRNA设计来实现。为了打破辑窗口的限制，使用具有不同PAM需求的Cas蛋白质将允许编辑目的靶标，以引入所需遗传信息的修改。此外，需要详细分析该技术在植物中的特异性和脱靶性。最后，为了提高基本编辑技术的通用性，需要对引入的indels的大小进行改进，并减少对副产物的编辑。

文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1360138520301904

内容来源：微信公众号：植物科学SCI