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固定细胞的免疫染色

已有 7065 次阅读 2013-6-14 10:33 |个人分类:评论|系统分类:科研笔记|关键词:学者

固定细胞的免疫染色

总体来说,对(d)STORM而言,固定细胞的免疫染色法和普通的免疫荧光实验相同。其主要区别有:

1. 如果是使用TIRF模式成像,要将细胞置于匹配的载玻片上。

2. 染色结束后,一般不将样品置于封片剂(mounting medium)中,而在PBS缓冲液中保存。

3. 基于第二点,为避免长期保存时出现抗体和目标蛋白的分离,一般在染色结束后,可以用多聚甲醛(paraformaldehyde)或戊二醛(glutaraldehyde)进行第二次固定。戊二醛固定时一般要用硼氢化钠(NaBH4)将未参与固定的戊二醛耗尽来减少自发荧光,但在二次固定时,不推荐使用,以避免其对荧光分子的淬灭。

4. 对于初学者,标记细胞骨架的样品是很好的检验数据质量的材料。相对微管结构而言,用phalloidin标记的微丝(F-actin)结构更难被超分辨显微技术解析,其主要原因是phallodin在很小尺度上会和微丝分离开。除了使用戊二醛进行固定外,推荐将样品置于phalloidin溶液中(4度过夜或室温半小时),直至实验开始之前。

5. 对于STORM成像,二抗要使用特制的、同时连有两种荧光分子的抗体。

6. PALM成像,特别是进行分子数的定量实验时,要注意样品避光保存,避免在实验前光转化或光激活现象的发生(造成对实际分子数目的低估)。

活细胞的标记方法

PALM在活细胞成像中使用比(d)STORM广泛。因为目标蛋白基因和光控蛋白基因相连,可以直接在细胞内表达、检测。而(d)STORM使用抗体标记,对活细胞而言,一般只限制于抗体所能到达的细胞膜表面,少数实验可以用显微注射的方法,将和抗体(或小分子药物)相连的荧光分子注入细胞内。另外,一般(d)STORM实验都需要在特殊的缓冲液下进行,这也与活细胞环境不同;不过也有的实验可以利用内源性的谷胱甘肽在细胞液的条件下进行dSTORM实验。

使用遗传标记和dSTORM结合的方法(例如FLAsH tag),可以在活细胞实验中取得更高的分辨率。此外后面章节中会介绍很多标记脂膜的染料也可在活细胞实验中进行dSTORM实验。




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2 戴德昌 郑环泉

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