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室温单分子荧光光谱简介

已有 7246 次阅读 2013-6-16 06:00 |个人分类:评论|系统分类:科研笔记|关键词:学者| 荧光

自从上世纪八十年代末单个荧光分子被成功探测后,室温下进行单分子探测和成像随之吸引了很多小组的研究兴趣。由上一章内容我们知道在低温下分子光谱线宽很窄,吸收截面比室温下要高5-6个数量级,室温下单分子荧光的探测主要问题是提高检测灵敏度。 直到1993Betzig等人利用近场光学显微镜,让我们真正看到了单个的荧光分子119951996FunatsuMacklin分别实现了全反射和共聚焦荧光显微镜进行远场单分子成像,使单分子检测变得更加容易和普适1,2目前由于激光、光学器件以及探测器等技术的发展,单分子荧光光谱已经非常成熟,在单个分子层次的成像和研究也在各个领域广泛开展。

第二节 单分子样品制备

虽然单分子光谱技术已经日趋成熟,但是目前单分子研究对于样品制备仍由许多限制。首先室温下单分子吸收截面较小,吸收光谱范围较宽,因此样品中或基片中的杂质分子很容易被激发光激发,从而造成背景噪音甚至可能会与目标荧光分子混淆,因此单分子样品制备要求尽量降低杂质分子的干扰。 常用的方法有:对基片进行清洗,对制备过程中所使用的溶剂进行纯化处理等,当然尽量减小样品厚度也可以 大大降低杂质分子的影响。一些常用的基片材料如玻璃中常常会有杂质离子,在激光特别是短波长激光激发的情况下会有荧光发射,造成非常严重的背景干扰,这种情况可以通过选用杂质较少的石英盖玻片来降低背景荧光。 与低温单分子荧光相比,在室温下要想实现单分子的分辨不能从光谱上进行分辨,而只能从空间上把分子和分子进行分开,因此在样品制备中就要求荧光分子的浓度非常非常低,在达到衍射极限的光斑下只能存在一个分子。由于荧光分子在光的激发下容易变的不稳定,更容易被氧化。而且各种表面对荧光常常有淬灭作用。为了对荧光分子进行保护,通常室温下单分子样品是将荧光分子分散到透明的介质(通常为聚合物)中, 并且在实验过程中常常需要惰性气体保护。

(一)旋涂法

目前最常用的样品制备方法是旋涂法。具体步骤为:

1. 制备荧光分子溶液

将荧光分子(高纯度)溶解到合适的溶剂中,通过超声或过滤等方法去除不容杂质、聚集体等,确保荧光分子均匀分散形成均一溶液

2. 对溶液进行稀释

对上述溶液进行稀释至nM级别,稀释过程要快,并且最好进行避光保护,因为在稀释的溶液中,荧光分子已经达到单分子量级,很容易发生化学变化,特别是光敏化学氧化。

3. 制备介质溶液

将介质溶解到适当溶剂(最好与上述溶液溶剂相同,如果不同也要相溶)中,制备合适浓度的介质溶液。溶液的浓度根据溶剂的不同和后面旋涂条件的不同以及实验的不同而决定。

4. 溶解到介质

将稀释到荧光分子溶液与介质溶液混合,使荧光分子均匀分散于介质分子中。

5. 旋涂

将基片放于旋涂机上,将上述混合溶液加到基片上,设定旋涂速度和时间,进行旋涂,得到最终的单分子样品。旋涂条件(速度和时间)可以改变最终样品的浓度,图层厚度等参数,根据具体实验做相应调整。

旋涂过程中,由于向心力作用,样品溶液被迅速涂抹在基片上形成液体层,随着旋涂的进行,多余的液体被甩出基片,而留在基片上的溶液随着溶剂的挥发黏度越来越大,最终形成一层掺杂荧光分子的介质膜。膜的厚度与旋涂速度,介质浓度以及溶剂的挥发速度等条件相关。

旋涂法仪器要求低,操作简单,制备样品快速,因此在单分子领域应用最为广泛。

(二)LB

另一种可以用于单分子样品是Langumir-Blodgett膜又称LB膜,其原理是将两亲性分子分散到溶剂表面,形成单分子层,然后通过Langumir-Blodgett法将其转移至基片上,形成单分子样品。


图4.2.1 LB膜法制备单分子样品示意图:图中红色和蓝灰色分别表示两性分子的亲油和亲水端,绿色表示荧光分子,基片表面为亲油性。

具体原理如图4.2.1所示:首先将两亲性分子均匀分散到溶剂表面,形成单分子水平的薄膜,根据相似相融原理,两亲性分子将按同一方向规则排列,将非常低浓度的荧光分子(同样是两亲性)掺杂到该单层膜中。要将该单层膜转移到基片上有两种途径:如果上面所用溶剂是水,单层膜上方为亲油端,下方为亲水端的情况下,可以将表面为亲油性的基片慢慢树直地浸入,同时对单层膜进行挤压,使膜慢慢吸附到基片表面;同样也可以将亲水性表面的基片从溶也中慢慢树直提出,同时对单层膜进行挤压。两种途径效果基本相同,但是单层膜的方向相反,根据实验需要可以选择将亲油端还是亲水端附在基片上。这种方法制备的单分子样品分散到单分子层的膜中,样品厚度达到最小,但是其操作过程稍复杂,且对荧光分子有一定要求,因此使用范围较小。


第三节 单分子荧光成像

单分子荧光成像时单分子光谱技术中最直接也是最基本的,单分子荧光图像不仅可以直观的得到相应的信息,同时也是研究分子荧光的其它性质的前提。通过成像虽然不能观测到单个分子的结构,但是相对独立的荧光光斑可以直接反应出所研究的对象是否在单分子水平,从光斑亮度也可以直观看出分子荧光的强弱。无论哪种荧光显微技术,最基本的功能都是得到单分子荧光图像。从荧光图像上最初得到的信息是单分子的个数,因此可以从图像上对分子进行计数,推测其浓度。从荧光图像得到的另外一个重要信息是分子荧光强度,虽然荧光强度受很多实验条件的影响,但是人们逐渐意识的其重要性,并且通过严格控制实验条件等手段,可以从中得到大量信息。单分子成像最重要的功能是对于荧光标记的目标物体进行结构成像,这一点也是超分辨荧光显微镜发展的前提,目前对蛋白分子,生物组织等通过荧光标记得到超分辨显微成像已被广泛应用,超分辨荧光显微技术将在后面章节详细讲解。

第四节 单分子荧光寿命

在得到单分子荧光图像后,即可以选择其中某单个的荧光分子进行其它性质研究。分子的荧光寿命是分子荧光的重要性质之一,其长短由分子激发态到基态跃迁速率决定,包括辐射跃迁和非辐射跃迁。因此分子荧光寿命的研究可以得到荧光分子光物理机制的信息。单分子荧光寿命测定最普遍的方法是利用脉冲激光器激发,并结合单光子计数探测技术。脉冲激光器可以通过锁模技术(激光脉宽可以达到飞秒量级)或者目前商用的脉冲二极管激光器(一般脉宽为皮秒量级),激光器的脉冲宽度将直接影响寿命测量的时间分辨率,因此在测定分子荧光之前最好对其有粗略估计,选择合适的激光器。当激光脉冲对单分子进行激发后,通过单光子计数装置,可以记录荧光光子与激发光之间的时间间隔,反复激发荧光分子多次后,对激发后不同时间间隔下发射的荧光光子数进行统计,即可得到荧光光子数随延时时间的关系曲线,通过指数拟合可以得到分子的荧光寿命。与溶液中荧光寿命不同的是,受局部环境的影响,不同的分子可能表现出不同的荧光寿命,而且由于受介质影响,单分子的荧光寿命可能会与溶液中的寿命稍有差异,甚至会出现非单指数衰减的过程,这与分子与介质相互作用有关,荧光可能被不同程度的淬灭。单分子荧光对于研究荧光机制、淬灭机制,以及一些相互作用的机制非常有效,而且在Förste能量传递技术中,荧光寿命同样可以作为能量传递效率的探测途径。因此除了对单个特定分子的荧光寿命分析之外,Tinnefeld等实现了荧光寿命成像而可以全局了解样品各个位置的荧光寿命情况3

第五节 闪烁和淬灭

如上一章所述,闪烁是单分子荧光技术的最主要特征之一,也是单分子光谱技术标志性的发现之一。因为溶液样品中,由于观测的是平均效果,即使有的分子短暂处于其他状态而不能发光,综合效果也无法观测到,而对于单个分子,如果分子处于未激活状态,则荧光信号消失,可以非常明显的被观测到。因此闪烁可以被用作检验单个分子的标志。但是也有其他体系如聚集体、聚合物等也被发现有闪烁的现象,所以在确定是否单个分子的时候,需要用其他特征进行佐证。室温下荧光分子闪烁的原因和上一章所讨论基本一样,除了光谱扩散在室温下不再可以造成荧光分子的闪烁,因为光谱的细微移动并不能改变的分子的荧光。淬灭是单分子荧光的另外一个重要特征。室温下荧光分子发生淬灭的几率大大增加,首先室温下的单分子荧光光谱一般在空气中或者惰性气体保护下进行,不可避免分子周围可能有活性分子如氧气,水等,其次室温下荧光分子更容易发生化学反应。因此室温下单分子光谱研究在样品制备以及实验过程中应尽量避免这些因素。

第六节 偏振成像和分析

单分子作为单个偶极子,无论吸收还是荧光发射都具有很好的偏振选择性。因此偏振技术在单分子光谱中的应用也比较广泛。由于单分子荧光技术一般用激光作为激发光,激光通常都是线偏振,因此用二分之一波长玻片可以改变激发光的偏振方向,从而改变对荧光分子的激发效率,通过荧光强度可以探测荧光分子被激发的效率而推出荧光分子的方向。同理由于源自单个分子的荧光也是线偏振的,可以在探测器前置一个偏振片,通过旋转偏振片的角度,来检测荧光的偏振方向,同样可以推测荧光分子的方向。但是由于一般单分子样品中荧光分子的方向是随机分布的,所以各个分子的方向并不相同,而且荧光分子的方向是在三维尺度随机分布,而荧光显微镜的探测仅仅局限在二维尺度下,所以并不能对分子的确切方向进行判断。后来人们通过散焦的方法,得到单分子的荧光强度在散焦情况下分布形状可以判断出荧光分子在三维尺度上的方向。荧光偏振不仅局限与荧光分子的取向,还可以用于研究大分子(比如聚合物等)内能量传递过程。通常整个小分子荧光分子为一个偶极子,分子的吸收和荧光发射源自同一跃迁偶极矩,因此也具有相同的方向。但是对于大分子,特别是聚合物,从严格意义上讲,它依然是单个分子,但却有多个色团,分子内具有不止一个偶极矩,分子的吸收和发射源自两个或多个色团,由于各色团并不完全相同,因此分子内的能量传递也不可避免。偏振技术可以用来研究聚合物多个色团间的能量传递途径和效率。特别是将吸收和发射的偏振性质结合后,可以得到更多的信息。

第七节 单分子荧光光谱应用

单分子荧光光谱最初主要应用于单个染料分子的检测,对于其荧光性质的研究以及与溶液中荧光性质的对比等。后来研究范围逐渐扩展,很快被应用到各个领域,特别是生物科学。由于生物分子,如蛋白,DNA等结构特异性,荧光分子可以很容易的标记到特定的位点上,从而可以运用单分子成像对生物分子进行成像和研究。随着单分子荧光技术的逐渐成熟和发展,单分子在生命科学中的应用越来越广泛。比如共聚焦显微镜可以成功实现3D成像,超分辨单分子荧光显微镜可以得到高分辨分子结构。人们不仅局限于分子结构的成像,而且通过FRET技术可以对生命分子的动力学进行研究,还可以对生命过程的机制进行研究;通过荧光强度研究生物分子构成,进而了解某些疾病的机理;甚至单分子技术还被用于DNA、蛋白测序。目前单个细胞的蛋白测序不久的将来也会实现。

除了生命领域外,单分子荧光技术在材料领域也崭露头角。1995年,Babara等人第一次发现了共轭聚合物同样可以表现出闪烁和淬灭的性质4。由于聚合物一般具有几十甚至上百个色团组成,色团与色团间并不相同,因此人们预期单个的聚合物将表现为多个色团共同作用的结果,即使达到单个聚合物水平后,分子的发光依然应该是多个色团的平均值,而不应展现闪烁或淬灭现象为了解释此现象Babara于是提出了能量漏斗的概念,认为聚合物容易发生分子内的能量传递,使所有色团吸收的能量通过该能量传递的过程到达某个特定的发射位置进行发射,这一观点受到广泛接受5。直到近年来,Scheblykin通过对单个聚合物绝对荧光强度的仔细分析,提出了不同的想法。他们认为这个长链聚合物中,并非所有色团都参与光的吸收和发射,而是大部分都处于被淬灭的暗态,而只有少数几个色团可以有效的吸收和发射荧光6。单分子荧光光谱也在纳米科学中发挥着越来越重要的角色。比如单个量子点、金纳米颗粒和碳纳米颗粒等热门纳米材料也成功研究。


第八节Förster共振能量传递

Förster共振能量传递(FRET)是一种两个色团之间能量传递机制,由德国科学家Theodor Förster而得名。FRET是指当两个色团中的一个被激发到激发态后,可以通过非辐射偶极矩耦合将能量传递给另一个色团的过程。有些人称其为荧光共振能量传递,但是该能量传递过程中并无荧光发射而是非辐射能量传递。FRET的效率由两个色团的光谱重合度以及它们之间的距离和相对方向决定,当其它条件相同时,FRET效率与色团之间距离的六次方呈反比,这使得FRET效率对色团之间的距离非常敏感,特别是很小的距离,因此是在纳米尺度上测量两个色团有力手段。特别是对于生物分子如蛋白质结构和动力学的研究尤为广泛。随着单分子荧光技术的成熟,单分子FRET逐渐成为了研究单个蛋白结构,动力学以及生物过程和生物机制的重要手段。

通过将给体和受体荧光分子分别标记到目标分子的特定位置后,通过研究它们之间FRET过程可以得到两个位置之间的距离以及方向等信息,而借助于实时观测技术还可以进行分子动力学分析。单分子FRET从严格意义上讲是双分子,因为需要同时研究给体和受体两个分子。为了达到较高的FRET效率,通常选择受体分子的吸收光谱与给体分子的荧光光谱最大程度的重合,这样就可以通过滤光片将二者荧光信息区分开来如图所示。单分子FRET研究方法主要由以下几种:

1、 受体分子的荧光强度

通常情况下,在FRET实验中所选用的激发光光只能选择性激发给体分子,而受体分子不能被激发,当没有FRET存在时,可以观测到单个的给体分子。当给体和受体分子间发生FRET后,给体分子将能量传递给受体分子从而使受体分子发射荧光,因此观测受体分子的荧光强度可以直接监测二者间发生了多少FRET。当然由于很多情况前FRET效率并非100%,因此通常可以同时观测都给体和受体的荧光,这种情况下虽然可以知道FRET存在,但并不能得知FRET效率。

2、 给体分子的荧光强度

给体分子将能量传递给受体分子后,自身不再发射荧光,因此监测给体分子的荧光强度同样可以研究二者间的FRET,而且在相同激发光条件下通过对比有无受体两种情况下给体的荧光强度,可以计算二者间的FRET效率。

3、 给体分子的荧光寿命

给体受体间的FRET是非辐射能量传递过程,对于给体来说相当于其激发态多了一条衰减途径,因此激发态寿命会缩短。由于该传递过程基本上不会影响其他衰减途径的速率常数,因此,测量给体分子的荧光寿命是一个非常有效的研究FRET的手段,可以更直接的得到FRET效率。

当然通常FRET研究经常不止用一种方法,而是多种方法同时使用,比如同时实时监测给体和受体的荧光强度以及荧光寿命,由于给体和受体可以很好的从光谱上分开,因此实验上并不困难。




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1 徐大彬

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