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转录组数据的分析
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转录组数据的分析
（1）转录组测序，以两组比较实验为例，实验组为T，对照组为C，每组三个重复，T1，T2，T3，C1，C2，C3。诺禾致源返回的文件为T1_1_clean.fq，T1_2_clean.fq，T2_1_clean.fq，T2_2_clean.fq，T3_1_clean.fq，T3_2_clean.fq，C1_1_clean.fq，C1_2_clean.fq，C2_1_clean.fq，C2_2_clean.fq，C3_1_clean.fq，C3_2_clean.fq。需要注意：如果测序结果中含有接头序列，需要剔除。
（2）分析方法参考文献”Differential gene and transcript expression analysisssss of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks“。
（3）操作系统：乌班图优麒麟
（4）软件安装：在/home/usrname/文件夹（也就是~/）下建立bin文件夹：#mkdir /home/usrname/bin。将这个文件夹添加到系统路径中# export PATH=$PATH:/home/usrname/bin （如不了解此命令，可以到网上查，不要把默认的系统路径删除）。
（5）下载samtools（samtools-0.1.17.tar.bz2，版本可以改变，但我这里没有试过，过高的版本需要配置）；bowtie（bowtie-0.12.7的linux的二进制版本，太高版本需配置参数）；tophat（1.3.2的linux的二进制版本）。解压了bowtie和tophat压缩包后，里面的二进制文件全部拷贝到/home/usrname/bin下。解压samtools后，进入文件夹，# make，然后文件夹里生成可执行文件samtools，将之拷贝到/home/usrname/bin下。
（6）在~文件夹下新建文件夹，比如“RNAseq_XXX”，将诺禾致源返回的clean.fq文件拷贝进去（如果为fq.gz，则# gunzip ./*，将之解压）。
（7）建立基因组索引文件，并下载GTF（General/Gene transfer format）文件。首先，下载基因组序列（注意基因组的版本号与注释文件的版本号要一致）。比如，下载UCSC hg38基因组http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz。可以将基因组文件合并，用cat *.fa > XX.fa，也可以不合并。基因组文件下载完毕之后，# bowtie-build 基因组.fa 基因组名（比如hg19.fa，可以写hg19，此是bowtie生成的基因组文件的前缀）。
GTF文件可以用如下方式下载：
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables，
点击get output。
（8）比对（此步骤耗费很长时间，可多线程并行，但不解决速度问题。我的每个重复耗时一天，则大约一周运行完。）。建立符号链接#ln -s GTF_file_path workingDirectoryPath，#ln -s Bowtie_index_filePath/* workingDirectoryPath。如果不创建符号链接，可能会报错。
# tophat -p 8 -G GTF文件路径 -o TH_输出文件的文件夹 基因组索引位置（所在文件夹/索引前缀） fq文件（可以多个，中间以空格分开）。
这一步运行完之后，会生成日志文件夹、accepted_hits.bam文件、deletions.bed文件、insertions.bed文件、junctions.bed文件、left_kept_reads.info和right_kept_reads.info文件。
（9）运行完以上程序，或每个重复运行完后，执行如下命令：
# culllinks -p 8 -o CL_输出文件夹 TH_输出文件的文件夹/accepted_hits.bam
这步运行完后，会生成四个文件：genes.fpkm_tracking，isoforms.pfkm_tracking，skipped.gtf，transcripts.gtf。
（10）整合转录组注释。
先构建一个文档文件，名为assemblies.txt，内容如下
./CL_输出文件夹1/transcripts.gtf
./CL_输出文件夹2/transcripts.gtf
./CL_输出文件夹3/transcripts.gtf
./CL_输出文件夹4/transcripts.gtf
./CL_输出文件夹5/transcripts.gtf
./CL_输出文件夹6/transcripts.gtf
然后
# cuffmerge -g GTF文件路径 -s 基因组.fa 8 assemblies.txt
漫长的等待后（一个小时）
（11）鉴定差异表达基因。
# cuffdiff -o diff_out -b 基因组.fa -p 8 -L group1Name,group2Name(注意逗号) -u merged_asm/merged.gtf ./TH_输出文件的文件夹1accepted_hits.bam,./TH_输出文件的文件夹2accepted_hits.bam,./TH_输出文件的文件夹3ccepted_hits.bam(注意粉色逗号) （此处有空格，前边是第一组的bam文件，后边是第二组的bam文件）./TH_输出文件的文件夹1accepted_hits.bam,./TH_输出文件的文件夹2accepted_hits.bam,./TH_输出文件的文件夹3ccepted_hits.bam
漫长的等待后（大概24小时），将diff_out文件夹拷贝到windows系统，分析结果。
https://m.sciencenet.cn/blog-331314-1133590.html
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