MGB-Eclipse探针系统是新一代用于定量PCR检测的探针和引物技术。综合Epoch Biosciences MGB技术，Eclipse暗粹灭剂，专利的修饰碱基(Super G, Super A 和Super T)以及MGB Eclipse设计软件（图1）提供易用，高效的实验可能。另外通过扩展其适应性为疑难测序设计探针和引物。使研究者以此开发出新的方法去检测用其它定量PCR化学无法完成的检测。 组成 MGB化合物 修饰化 Super G Super A 和Super T Eclipse暗粹灭剂 MGB Eclipse设计软件 特点和优点 * MGB技术：通过稳定杂交MGB Eclipse探针与模板二聚体，使得设计更短及更高退火温度的探针成为可能，为研究者提供为一些受限区域设计探针及引物的可能性（图2） * 疑难测序方法：通过掺入修饰化Super A Super T和Super G碱基，可克服为富含A、T或G目标区域设计探针和引物的困难，进一步扩展富含疑难序列病原体的检测范围。 * MGB Eclipse设计软件，影响定量PCR探针和引物设计的专利，包括物异性地使用MGB技术和修饰化碱基，可通   图1.MGB重叠探针组成，MGB Eclipse 设计软件将修饰碱基掺入探针和引物中。指示染料(F)位于探针3′端，MGB Eclipse暗粹灭剂位于5′端。 过易用和网络化设计的软件来完成。 * 减低背景，Eclipse暗粹灭剂比常用自体荧光粹灭剂能更好扣减背景，如TAMRA和DABCYL。 * 兼容化学，MGB Eclipse 探针系统可用在任一定量PCR仪上进行定量PCR检测，并可采用任何PCR或定量PCR酶和试剂系统。 * 无探针降解，因为MGB Eclipse 探针无需5′-核酸酶降解将指示染料从粹灭剂上置换下来。因此诸如裂解曲线等后PCR分析就可以进行了。使得研究者可进行差异筛选。

	图2.所示MGB Eclipse探针系统作用原理，每一个PCR循环包含三个步骤，在初始阶段，MGB Eclipse探针由于其疏水性而在变性温度下显现随机螺旋状，指示染料上的荧光由于靠近Eclipse暗粹灭剂而被粹灭。在退火阶段，MGB卷曲回适当的状态从而有利于形成探针，模板二聚体而进行杂交，另外，Eclipse暗粹灭剂与指示染料分开，释放出荧光素，退火之后，MGB探针在引物延伸阶段从模板上解离下来，从而使引物延伸更有效的进行。 图3.B.anthracix和B.ereus差异检测。所用引物和探针序列：引物1：A*G.A*GCT*T*ACT*T*GT*GT*C,引物2：T*T*C ACC AGT*T*T*C TGG ATC,B.anthracix染色体标记探针(左):MGB-AGC GCT* AT*G AT*T*T*AG-TETTM,B.cereus 染色体探针(右):MGB-AGC GCT*ACG AT*T*T*AG-FANTM.深绿是合成对照，黑色为B.anthracis菌株。红色代表B.anthracis阳性样品，黄色、蓝色、洋红为B.anthracis阴性样品，下划线并带“*”的碱基为渗入的Supcr A或Super T.   * 无探针降解，因为MGB Eclipse 探针无需5′-核酸酶降解将指示染料从粹灭剂上置换下来。因此诸如裂解曲线等后PCR分析就可以进行了。使得研究者可进行差异筛选。 疑难序列检测     图为许多已知病原菌的基因组富含AT区域，因此使得为不同的菌体设计所需的探针和引物变得很复杂。MGB Eclipse探针系统提供有效定量PCR化学技术。检测高度毒性的B.anthracis 可依据与之高度相关而相对低毒性的     B.cereus的差异比较。这二株菌的基因组是高度保守的，使得在AT富含区附近设计探针诱发单碱基突变从而将这二株菌分开的可能性降低。然而，当使用Super A和Super T可为AT富含区设计探针和引物从而检测出这二株菌的差异。   图4.单一探针对二株HHV6的裂解(解吸附曲线)分析，MGB Eclipse探针序列:5’-M6B-Q-CGTCACACCCCGAAAT-FAM-3’。经过一个从45℃-85℃温度范围的连续PCR过程后的数据采集。 图5.用MGB Eclipse探针系统进行定量PCR检测HSVI模板的谪定曲线。标准曲线来源于ABI PRISM7700系统，曲线显示每个样品循环倍数(CT)对(LogN)起始拷贝数。 图右侧显示斜率计算值，Y－截距，和相关因子。 物种变异分析     使用裂解曲线及单一探针进行二物种差异分析成为可能。图4.显示单一MGB Eclipse重叠探针和引物被用来检测二株人疱疹6型病毒(HHV6)的差异分析。 灵敏度     MGB Eclipses重叠探针系统十分灵敏，可以使常规DNA模板检测具有很宽的线性范围，具有很好的重复性，如图5所示，MGB重叠探针系统可以检测到少至5个拷贝的疱疹单体病毒(HSV)

 摘要]结核病是造成成人死亡的感染性疾病中最常见的病因。近几年在全球呈死灰复燃的趋势，耐药结核杆菌，特别是耐多药结核杆菌的出现是结核疫情恶化的主要原因之一。因此加强对耐药结核杆菌的检测对指导临床意义重大。MGB探针作为一种新型探针，在实时PCR的基础上对于早期准确地检测出结核杆菌耐药株从而尽早制定正确的治疗方案具有很多优点。本文即是关于MGB探针及其在结核杆菌耐药株检测中的应用方面的综述。



[关键词]探针；利福平；药物耐受性；rpoB基因；利福平耐药决定区（RRDR）



在上个世纪中叶，一个曾经被医学工作者和政府决策者们认为已经濒临死亡的幽灵——结核病，突然又活跃地游荡在世界各地。到上个世纪末，结核病疫情已经在世界范围内恶化，各国死亡率都有回升，特别是随着艾滋病的传播与流行，以及不合理的化疗方案，不规则的用药，导致了耐药菌株的出现，使得结核病的病死率升高[1]。由于传统检测药物敏感性的方法是以细菌培养为基础的，虽然方法可靠，但它有一个最大的弱点是费时，一般从就诊至报告药敏结果需2～3个月。MGB探针作为一种新型的探针[2]，在应用于定量PCR时可以快速，简便地检测出耐药结核杆菌。



1 MGB探针1.1概念



MGB探针是指带有一个小沟结合物基团的DNA探针，它可与单链的靶DNA形成极为稳定的异源双链，同时这种探针相对于通常的探针序列更短一些[3-5]。



1.2结构



MGB探针是在原有设计的寡核苷酸探针（ODN）的基础上在其5′或3′连接上一个基团——二氢环化吲哚卟啉－三肽（DPI3），DPI3可折叠进由探针末端5～6bp核苷酸形成的小沟内[6]。DPI3呈新月行，与B型DNA螺旋的浅深小沟一样螺旋，主要通过范德华力稳定[7]。无论是3′－MGB寡核苷酸探针还是5′－MGB寡核苷酸探针,都比没有MGB的寡核苷酸探针显示了更强的序列特异性。同时5′－MGB寡核苷酸探针能够阻止引物的延伸[3]。



3′-MGB寡核苷酸探针有三个不同的连接键。DPI3-三肽能够以C-末端或N-末端连接到寡核苷酸探针，因此连接键的位置影响到DNA异源双链的结构。



3′－MGB寡核苷酸探针形成异源双链的结构如图：



MGB-ODN：5′-GATTGTAGACATAAC



互补链：3′-AAAGACTAACATCTGTATTG



研究表明，一般情况下，同MGB-ODN形成的错配异源双链其熔点温度比没有MGB的ODN形成的双链熔点温度高，而且由于△Tm（完全匹配的Tm值与错配的Tm值之差）由错配的位置和类型决定，在小沟结合区内形成的错配特别不稳定。比起通常的寡核苷酸探针,MGB寡核苷酸探针更容易辨认在MGB结合区形成的错配。同时分子分析表明，与寡核苷酸探针3′连接的MGB可向探针的5′－末端滑行1－2bp，以便有更好的小沟结合位[2]。



1.3探针杂交特性



MGB连接到12～18mer的寡核苷酸时，能显著增加异源双链的稳定性，Tm值在66～70℃之间，而没有MGB的相同序列Tm值在44～56℃[5]。探针越短，整体异源双链的稳定性越大。有研究表明，一个没有MGB的27mer寡核苷酸探针形成的异源双链的稳定性（Tm＝65℃）与有MGB的12mer寡核苷酸探针（Tm＝66℃）相同，从这12mer的寡核苷酸探针的序列中可以看出，富含A/T的3′－末端附近的MGB配体对稳定性的作用等于在序列的5′－末端另加15个碱基[2]。



MGB探针最惊人的特征是对错配碱基的识别，12merMGB探针配对与错配的Tm值间的差异（△Tm）达20℃，而足够稳定的无MGB的探针△Tm值仅是4～6℃[2]。



MGB探针在荧光定量分析中的优越性体现在：①理想条件下，与模板完全匹配的探针其Tm值应该稍微高于引物延伸的温度，而有单个碱基错配的探针其Tm值应该比引物延伸温度更低一些，MGB探针很容易满足这个条件。②MGB探针另一个显著特征是背景荧光低（在第一个循环的荧光）。由于MGB探针报告基团与淬灭基团的距离较短及在结构上具有其它更有效淬灭荧光的因素[8]，所以背景值低。③MGB探针具有很好的敏感性和定量效果，不存在与高度复杂的DNA非特异性作用的问题。



在荧光定量分析中常用信噪比来衡量探针的优劣。信噪比即是在50个循环时的荧光信号与第一个循环时背景荧光的比值。有许多因素影响到探针的信噪比，但在特异的PCR系统中，完全匹配的探针其信噪比应该尽可能大。一个15mer的MGB探针的信噪比大于6而理想状态下的25mer的非MGB探针其信噪比约1.5。



1.4 MGB探针的设计



①为了满足PCR条件下Tm较高的要求，非MGB探针依据扩增模板G+C含量的不同，其长度变化从14～40mer不等。但MGB探针的长度是12～20mer。



②MGB能够稳定寡核苷酸探针并使它们的Tm值达到62～68℃。MGB连接到富含A+T的探针末端Tm值升高大于连接到富含G+C的探针末端[2]。这有利于探针的设计，特别是在多重PCR分析中极为重要。



③由于MGB能够向探针的5′－末端滑行1～2bp，以便有更好的小沟结合位，故在MGB结合位内或附近的错配更易识别。



近几年来，实时定量的PCR方法已经广泛应用，该方法建立在Taq酶对探针的5′切割分析[9-11]，具有荧光淬灭性质的发夹探针[12]和引物[13]，以杂交为基础的能量共振转移探针[14]，两种链特异性的DNA染料[15]的基础上。这种单管操作的方法免除了PCR反应后的样本处理以及可能的残留物污染，并且具有高通量检测的特征。由于MGB探针比通常的探针更短一些，对单个碱基错配更敏感及低荧光背景等特性，可以广泛应用于SNP检测和等位基因识别。



2利福平的结核杆菌菌株和rpoB基因突变



利福平在上个世纪70年代起应用于临床，它通过与细菌RNA聚合酶β亚基结合，干扰细菌的转录过程，实现杀菌效果。在结核病化疗失败的病例中，耐利福平是一个重要的因素。后来人们发现结核分支杆菌耐利福平与细菌RNA聚合酶的β亚基编码基因rpoB的突变有关。遗传互补法证实了rpoB突变与耐利福平间的因果关系，即将突变的rpoB基因借助结核分支杆菌穿梭质粒导入对利福平敏感的耻垢分支杆菌LR222后，该菌出现了高度耐利福平。rpo基因全长3543个碱基，当其核心区域发生突变时，利福平不能与RNA聚合酶β亚基结合，导致细菌对利福平耐受，因此通过对rpoB突变的检测可以判断细菌对利福平的敏感性。另外由于异烟肼和利福平是临床最常用的药物，有作者报告90%-95%耐利福平株同时也耐异烟肼，因而单独进行利福平敏感性分析也可作为耐多药的筛选指标[16-17]。



Ramaswamy等[18]总结了1993－1998年之间的文献报道，发现96％（315/329）的无流行病学关联的耐利福平临床株在rpoB基因81个碱基的核心区域——利福平耐药决定区（RRDR）有突变，包括点突变或短的插入，缺失突变共35种，其中43％的菌株发生了531位丝氨酸的错义突变；36％的菌株发生了526组氨酸错义突变。



Gonzalez等[19]分别用三种方法：PCR-SSCP[20]，LiPA[21-22]和DNA测序对21株耐利福平菌株进行了检测，有66.7％的菌株531位丝氨酸突变为亮氨酸,14.3％的菌株526位组氨酸突变。总体上96％的耐利福平株存在rpoB基因的突变。



黄海荣等[23]通过对rpoB基因588bp易变区进行DNA序列分析，报道了我国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的特点：193株耐利福平临床分离株中有172株存在rpoB基因核心区域的点突变，突变率为89.1%（172/193）；46株利福平敏感株未检测到RRDR的突变。所有突变集中于81个碱基的核心区域内。突变类型包括39种，涉及了24个碱基，15种氨基酸。有86个耐药菌株的点突变位于11223位碱基，发生了从胞嘧啶向胸腺嘧啶的转换，使531位丝氨酸转换为亮氨酸，占所有菌株的44.6%(86/193)。另一个比较常见的发生突变的氨基酸是位于526位的组氨酸，其突变率是17.1%(33/193),其相应密码子CAC的三个碱基都可发生突变，其中最常见的是第一个胞嘧啶，可转换为腺嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶（分别是2/33,9/33,10/33）。531位和526位氨基酸突变率之和是62.3％，在我国结核分支杆菌与耐利福平有关的突变中最为常见。在研究中未发现有缺失或插入类型的突变，说明在我国细菌产生耐利福平的主要形式是点突变。



基于以上报告及MGB探针的特点，理论上可以设计合成包括所有突变类型的MGB探针。由于MGB探针具有TaqMan探针无法匹敌的对于单个碱基突变的强大辨别力，如果在PCR反应体系加入包含所有突变类型的MGB探针，即能达到检测100％点突变。另外由于MGB探针设计简单，易于操作，可以及时得到结果，同时所需样本量少，可以对临床标本如痰液、胸液、渗出物直接检测，因而对于指导临床用药非常有价值。



3展望目前，国内外暂时还未有应用MGB探针技术检测结核耐药菌株的报道。假如以整体的观点把基因诊断的两大核心技术——PCR技术和杂交技术联合起来考虑，把以玻璃、金属为介质，大量探针点于其上的基因芯片称为固相芯片，则可以把以PCR反应溶液为介质，特异性的MGB探针混于其中的体系称为液相芯片。由于基因芯片尚存在成本过高和一些技术上的难题，故暂时无法普遍应用于临床，但以MGB探针为基础的实时定量PCR技术由于其成本较低、易于操作等优点可以大面积用于临床，为整个社会带来巨大的效益。



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作者单位：510080广州中山医科大学达安基因诊断中心