生物医学突破:在人类细胞完全基因插入现在成为可能

诸平

Researchers at the Broad Institute have improved gene-editing to efficiently insert entire genes into human cells, offering potential for single-gene therapies for diseases like cystic fibrosis. This method combines prime editing with new enzymes to enhance editing efficiency, potentially revolutionizing gene therapy.

据美国哈佛大学-麻省理工学院的博德研究院（Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA）2024年6月13日提供的消息，生物医学突破: 在人类细胞完全基因插入现在成为可能（Biomedicine Breakthrough: Complete Gene Insertion Now Possible in Human Cells）。

这种基因编辑技术使用了初始编辑器以及被称为重组酶(recombinases)的高级酶。这种方法有可能导致对囊性纤维化(cystic fibrosis)等疾病有效的通用基因疗法(universal gene therapies)。

麻省理工学院-哈佛大学的博德研究院的研究人员已经改进了一种基因编辑技术，现在可以有效地插入或替换人类细胞基因组中的整个基因，可能使其适用于治疗用途。

博德研究院核心研究所——默金医疗保健变革技术研究所（Merkin Institute of Transformative Technologies in Healthcare, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA）成员刘大卫（David Liu）的实验室取得的这一进展，有朝一日可能会帮助研究人员开发出一种单基因疗法，用于治疗由数百或数千种不同基因突变之一引起的囊性纤维化等疾病。使用这种新方法，他们将在基因组的原始位置插入一个健康的基因拷贝，而不必使用其他进行较小编辑的基因编辑方法，创建不同的基因疗法来纠正每个突变。

这种新方法结合了引体编辑和新开发的重组酶，前者可以直接进行大范围的编辑，最多可达100或200个碱基对，后者可以有效地在基因组的特定位点插入数千个碱基对的大片段DNA。这个系统被称为eePASSIGE，它可以比其他类似的方法更有效地进行基因大小的编辑，该研究结果于2024年6月10日已经在《自然生物医学工程》（Nature Biomedical Engineering）杂志网站发表——Smriti Pandey, Xin D. Gao, Nicholas A. Krasnow, Amber McElroy, Y. Allen Tao, Jordyn E. Duby, Benjamin J. Steinbeck, Julia McCreary, Sarah E. Pierce, Jakub Tolar, Torsten B. Meissner, Elliot L. Chaikof, Mark J. Osborn, David R. Liu. Efficient site-specific integration of large genes in mammalian cells via continuously evolved recombinases and prime editing. Nature Biomedical Engineering, 2024. DOI: 10.1038/s41551-024-01227-1. Published online: 10 June 2024. https://www.nature.com/articles/s41551-024-01227-1.

参与此项研究的除了博德研究院的研究人员之外，还有来自美国哈佛大学（Harvard University, Cambridge, MA, USA）、美国明尼苏达大学医学院（University of Minnesota Medical School, Minneapolis, MN, USA）以及美国哈佛医学院（Harvard Medical School, Boston, MA, USA）的研究人员。

该研究的通讯作者、理查德·默金教授（Richard Merkin Professor）和默金医疗保健变革技术研究所（Merkin Institute of Transformative Technologies in Healthcare at the Broad）所长、哈佛大学教授和霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）研究员刘大卫说：“据我们所知，这是哺乳动物细胞中可编程靶向基因整合的第一个例子之一，它满足了潜在治疗相关的主要标准。如果我们在培养的人类细胞中观察到的效率可以转化为临床环境，我们期望在这些效率下，许多(如果不是大多数)功能丧失的遗传疾病可以得到改善或拯救。”

刘大卫教授组的研究生斯姆里蒂·潘迪（Smriti Pandey）和博士后研究者高欣（Xin Daniel Gao）是该研究的共同第一作者，该研究还与明尼苏达大学的马克·奥斯本小组（Mark Osborn’s group at the University of Minnesota）和贝斯以色列女执事医疗中心的埃利奥特·查科夫小组（Elliot Chaikof’s group at the Beth Israel Deaconess Medical Center）合作。

斯姆里蒂·潘迪说：“这个系统为细胞治疗提供了很有希望的机会，它可以在给病人治疗疾病之前，在体外精确地将基因插入细胞中，以及其他应用。”

高欣补充说：“看到eePASSIGE的高效率和多功能性是令人兴奋的，它可以使基因组药物成为一个新的类别。我们也希望它能成为整个研究界的科学家用来研究基本生物学问题的工具。”

引体改进（Prime improvements）

许多科学家已经使用引体编辑（prime editing）来有效地对DNA进行长达数十个碱基对的修改，足以纠正绝大多数已知的致病突变。但是，将整个健康基因(碱基对长通常有数千个)引入基因组的原始位置，一直是基因编辑领域的一个长期目标。这不仅有可能治疗许多患者，而不管他们的致病基因发生了哪种突变，而且还可以保存周围的DNA序列，这将增加新安装的基因得到适当调节的可能性，而不是表达太多、太少或在错误的时间。

2021年，刘大卫的实验室报告了实现这一目标的关键一步，并开发了一种称为twinPE的引物编辑方法（prime editing approach），该方法在基因组中安装重组酶着陆点，然后使用天然重组酶(如Bxb1)催化将新DNA插入引物编辑的目标位点。

刘大卫与人共同创立的生物技术公司——引体医疗（Prime Medicine）很快就开始使用这项技术，他们称之为引物编辑辅助位点特异性整合酶基因编辑(prime-editing-assisted site-specific integrase gene editing简称PASSIGE)，来开发遗传性疾病的治疗方法。

PASSIGE只在一小部分细胞中进行编辑，这足以治疗一些(但可能不是大多数)由于失去功能基因而导致的遗传疾病。因此，刘大卫的团队在他们发表在《自然生物医学工程》（Nature Biomedical Engineering）的报告的新工作中，着手提高PASSIGE的编辑效率。他们发现重组酶Bxb1是限制PASSIGE效率的罪魁祸首。然后，他们使用刘大卫团队先前开发的一种名为噬菌体辅助连续进化(phage-assisted continuous evolution简称PACE)的工具，在实验室中快速进化出更有效的Bxb1版本。

由此产生的新进化和工程化的Bxb1变体(evolved and engineered Bxb1 variant简称eeBxb1)改进了eePASSIGE方法，在小鼠和人类细胞中整合平均30%的基因大小的货物，是原始技术的4倍，是最近发表的被称为PASTE的另一种方法的16倍。

刘大卫说：“eePASSIGE系统为研究在我们选择的遗传疾病的细胞和动物模型中，整合健康基因拷贝以治疗功能丧失疾病，提供了一个有希望的基础。我们希望这个系统将被证明是朝着实现靶向基因整合对患者带来益处迈出的重要一步。”

带着这个目标，刘大卫的团队现在正致力于将eePASSIGE与递送系统如工程病毒样颗粒{engineered virus-like particles (eVLPs)}结合起来，这可能会克服传统上限制基因编辑器在体内治疗递送的障碍（hurdles）。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health grants R01 HL160970, U01 AI142756, R01 EB031172, RM1 HG009490, 5R01AR063070-08 and R35 GM118062）、比尔和梅林达·盖茨基金会（Bill and Melinda Gates Foundation）、霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute简称HHMI’s Open Access to Publications policy）、美国国家科学基金研究生研究奖学金计划（National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program）、美国圣鲍德里克基金会（Saint Baldrick’s Foundation）以及小孩第一基金（Kidz 1^st Fund）的资助或支持。

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Abstract

Methods for the targeted integration of genes in mammalian genomes suffer from low programmability, low efficiencies or low specificities. Here we show that phage-assisted continuous evolution enhances prime-editing-assisted site-specific integrase gene editing (PASSIGE), which couples the programmability of prime editing with the ability of recombinases to precisely integrate large DNA cargoes exceeding 10 kilobases. Evolved and engineered Bxb1 recombinase variants (evoBxb1 and eeBxb1) mediated up to 60% donor integration (3.2-fold that of wild-type Bxb1) in human cell lines with pre-installed recombinase landing sites. In single-transfection experiments at safe-harbour and therapeutically relevant sites, PASSIGE with eeBxb1 led to an average targeted-gene-integration efficiencies of 23% (4.2-fold that of wild-type Bxb1). Notably, integration efficiencies exceeded 30% at multiple sites in primary human fibroblasts. PASSIGE with evoBxb1 or eeBxb1 outperformed PASTE (for ‘programmable addition via site-specific targeting elements’, a method that uses prime editors fused to recombinases) on average by 9.1-fold and 16-fold, respectively. PASSIGE with continuously evolved recombinases is an unusually efficient method for the targeted integration of genes in mammalian cells.