一、原理【1】
考马斯亮兰G250在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红的溶液。当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物。反应化合物在465-595nm处有最大光吸收值。化合物深浅与蛋白浓度的高低成正比例关系。故可以检测595nm的光吸收值来计算蛋白含量。

二、Bradford显色液的制备【1】
1）bradford储存液：100ml 95%乙醇，200ml 88%磷酸，350mg 考马斯亮兰G250，室温下长期稳定
2）bradford工作液：425ml 双蒸水，15ml 95%乙醇，30ml 88%磷酸，30ml bradford储存液；waterman 1＃滤纸过滤，保存于室温棕色瓶内。使用前需再过滤。

三、实验材料
     BSA（1mg/mL）， 待测蛋白，待测蛋白所用缓冲液，96孔板，酶标仪
四、BSA标准样品的配制
        样品编号      BSA(ul)   Buffer(ul)
            1                    0               30
            2                    5                 25
            3                    10              20
            4                    15                15
            5                     20                 10
            6                    25                5
            7                      30              0

五、待测样品的准备
       待测样品预先用OD₂₈₀粗测浓度，大致确认浓度后，进行稀释和BSA样品2号、7号在bradford显色液中显色的深浅进行目测比较，确定比较合适的稀释比例。然后制备不同浓度待测蛋白样品2-3个，每个样品10ul，待用。

六、测定方法
       取96孔酶标板，向孔内加入140ul的bradford显色液，再加入蛋白样品3ul，混合均匀。每个BSA及待测蛋白样品需重复2-3个。然后选取酶标仪595nm波长进行扫描读数。
      实验结果用EXCEL进行平均，做出BSA的标准曲线，根据线性方程和稀释后待测蛋白样品的读数，计算出待测蛋白的浓度

【1】蛋白质技术手册，汪家政 范明 主编，科学出版社



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