范琦婧，张林强

1.   文章来源介绍

中国药科大学天然药物国家重点实验室、药物代谢与药代动力学重点实验室郝海平团队于2020年1月13日在Nature Communications上发表题为“SUMOylation inhibitors synergize with FXR agonists in combating liver fibrosis”的文章。报道了联合应用奥贝胆酸（obeticholic acid, OCA）和法尼酯衍生物X受体（FarnesoidX receptor, FXR）类泛素化抑制剂可有效治疗由CCl₄、胆管结扎和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）引起的肝纤维化。

2.   研究背景及科学问题

FXR是治疗NASH和肝纤维化的一个有希望的临床靶点。OCA是一种有效的FXR激动剂。然而，在Ⅲ期临床试验中，OCA的治疗效果有限，其治疗NASH诱导的肝纤维化的有效率只有23%[1]，远没有达到期望值。因此本研究的科学问题是探索新的方法来提高OCA和其他FXR激动剂的临床疗效。

3.  重要技术方法

本研究采用了4种小鼠的肝纤维化模型：CCl₄，胆管结扎（bile duct ligation, BDL）和NASH（HFHC以及MCD饮食饲喂）诱导的肝纤维化模型，以及体外分离HSCs（来源包括小鼠以及人类）。利用Co-IP、ELISA发现并验证FXR的类泛素化现象；利用过表达、敲低、点突变等技术研究类泛素化分子的作用；利用荧光素酶报告实验与Ch-IP的手段检测FXR与Plin1的相互作用；应用RT-PCR和Westernblot以及组织学检测等方法检测mRNA和蛋白的表达水平以及组织的表型。

4.   重要发现

1）预防性而非治疗性的OCA可以抑制肝纤维化

在药物的临床前和临床研究中，一个很大的问题是在大多数临床前动物模型中，FXR激动剂是在肝脏没有明显纤维化变化的阶段以预防性的方式给予，这与人类患者的实际治疗完全不同。本文中，作者用两种肝纤维化模型（CCl₄和BDL）分别以预防方式（用CCl₄和BDL诱导建模时同时给药）以及治疗方式（CCl₄诱导4周后给药以及BDL手术8天后给药）给与相同剂量的OCA，结果发现预防性的OCA具有更好的疗效。同时体外细胞（CCl₄和BDL模型中分离的HSCs）水平实验以及NASH模型实验也验证了这一结论。

2）OCA对静息状态（没有被活化）的HSCs更有效

HSC的活化是肝纤维化的重要标志，而脂滴（lipid droplet, LD）的丢失是HSC活化的重要标志。从对照组与实验组（CCl₄和BDL）模型小鼠中分离HSCs经过OCA处理，发现OCA对对照组HSCs（即没有活化的）的促纤维化基因有很强的抑制作用，且能抑制LD的减少，而OCA对实验组HSCs（即活化的）的抑制作用很弱。

3）在活化的HSCs中类泛素化修饰降低FXR的活性

OCA是FXR激动剂，可以使静息状态的HSCs中Shp（small heterodimer partner） mRNA的表达增加。但在活化的HSCs中，FXR激动剂（OCA、GW4064 和WAY-362450）使Shp mRNA的表达被抑制，这一现象与从健康者和NASH病人体内分离的HSCs中的现象是一致的。这些结果表明活化的HSC中FXR的转录功能是减弱的，但由于FXR的mRNA和蛋白水平几乎没有改变，因此，作者推测应该是存在某种翻译后修饰（post translational modifications,PTMs）影响了FXR的功能。接下来，作者检测了FXR的PTMs，发现在活化的HSCs和纤维化肝脏中，FXR的类泛素化（SUMOylation）修饰增加。此外在NASH小鼠和病人的HSCs中也检测到了类泛素化修饰增加的现象。进一步研究发现，在哺乳动物表达的三种类泛素蛋白（SUMO1，SUMO2/3）中，过表达SUMO1、SUMO2可以增加FXR的类泛素化水平，但只有敲低SUMO1才能抑制FXR的类泛素化。突变FXR的三个类泛素化修饰位点（Lys122, Lys275和Glu277）同样能降低FXR的类泛素化水平，且三个位点同时突变时，FXR几乎不发生类泛素化。上述结果表明，类泛素化修饰是调节FXR活性的一个关键因素。

4）类泛素化抑制剂能恢复FXR的活性与功能

作者发现，使用类泛素化抑制剂（GA和SP）可以抑制活化HSCs中FXR的类泛素化，同时上调Fxr及其目的基因Shp的mRNA水平。将体外分离的HSCs用添加或不添加SP（或GA）同时培养，发现在培养后激活的HSCs中，单独使用OCA不能增加脂质的积累，不能降低促纤维化因子的水平，而SP与OCA联用可以增加脂质的积累，降低促纤维化因子的水平从而抑制HSCs的活化。这说明在活化的HSCs过程中，类泛素化抑制剂能够恢复FXR的活性和功能，从而达到抑制HSCs活化的效果。

5）类泛素化抑制剂与OCA联用能抵抗纤维化

前文中作者在细胞层面研究了类泛素化抑制剂与OCA联用可以抑制HSCs的活化。接下来，作者同时用SP与OCA治疗肝纤维化模型小鼠（CCl₄、BDL和NASH诱导的肝纤维化模型），发现模型小鼠血清ALT、AST水平降低、促纤维化基因的mRNA表达水平降低、ShpmRNA增加，同时该处理还能抑制LD减少、减少细胞外基质、抑制纤维化表型。这些结果表明，联合使用类泛素化抑制剂和FXR激动剂可能是治疗由毒素（CCl₄）、胆汁淤积（BDL）和NASH引起的肝纤维化的一种有效方法。

6）FXR激动剂通过调节Plin1稳定LD

根据上述实验结果，作者提出问题：类泛素化抑制剂是怎么恢复FXR的功能进而与FXR激动剂一起抑制HSCs的活化与肝纤维化？对此，作者猜测，由于LD的丢失是HSC活化的重要标志，FXR激动剂可能通过稳定LD来抑制HSCs的活化。为了验证这一猜测，作者体外培养HSC-T6细胞并将ROH和FAs添加到培养基中，结果发现该处理增加了细胞中的脂质并促进了LD的形成，同时与纤维化相关基因的mRNA水平降低、α-SMA减少，这提示抑制LD的丢失可能有利于抑制HSCs的活化。由于LD的分解是由于LD相关蛋白的减少导致的，因此作者分析了Plin家族成员的mRNA水平，发现只有Plin1可以响应FXR激动剂的处理，且表达上调。在从Fxr^-/-小鼠分离的HSCs中， Plin1的mRNA水平是降低的，LD的量是减少的，但促纤维化基因的mRNA水平表现出明显增加。过表达Plin1可以稳定LD的含量，抑制促纤维化基因的表达，进而抑制HSCs的活化；反之，干扰Plin1时结果正好相反。此外，作者用荧光素酶报告实验与Ch-IP实验证实FXR能与Plin1的启动子区结合，从而调节Plin1的表达，且两者的结合能响应OCA的处理。这些结果提示Plin1在LD的稳定及抑制HSCs活化方面具有重要作用，且其表达受到FXR的调节。

7）FXR的类泛素化修饰抑制Plin1的表达

在静息状态的HSCs中，使用OCA能上调Plin1的表达，当HSCs中过表达SUMO1时，Plin1则不能响应OCA的调节；相反，SP能使活化的HSCs恢复这一响应。从肝纤维化模型小鼠（CCl₄，BDL和NASH诱导的肝纤维化模型）中分离HSCs，将其同时用SP与OCA处理，作者发现该处理可以增加Plin1的表达。这些结果说明抑制FXR的类泛素化修饰和促进FXR转录功能能够上调Plin1的表达，从而导致下游的一系列效应。

5. 对领域贡献

首先，该研究发现FXR类泛素化修饰水平的增加可以活化HSCs，这是限制OCA及其他FXR激动剂发挥作用的关键因素。其次，FXR类泛素化抑制剂与OCA联用增强了OCA治疗CCl₄、BDL和NASH诱导的肝纤维化中的疗效。最后，作者找到了Plin1，发现其作为FXR的靶基因，具有稳定LD进而抑制HSCs活化的重要作用。

6.   存在问题及分析

NASH及肝纤维化越来越对人类健康产生巨大威胁，本研究发现FXR类泛素化抑制剂与OCA联用增强了OCA治疗CCl₄、BDL和NASH诱导的肝纤维化中的疗效，但同样是临床前的研究，其在临床上的具体作用和效果有待进一步研究，这也是药物研究与临床应用存在的巨大的鸿沟。另一个问题是，本研究仅在肝纤维化中做了实验探究，FXR类泛素化抑制剂与OCA联用对NASH其他方面（脂肪变性、炎症等）的具体疗效是怎样的？甚至对肝纤维化后期的肝硬化甚至是肝癌中是否也有相应的作用呢？这些问题还需要进一步的研究。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-14138-6#Abs1

参考文献

Wang, H., et al., Noncanonicalfarnesoid X receptor signaling inhibits apoptosis and impedes liver fibrosis. EBioMedicine, 2018. 37: 322-333.

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