写在前面

     2020年2月7日上午11时，华南农业大学针对新型冠状病毒肺炎疫情研究攻关情况举行了新闻发布会。华南农业大学、岭南现代农业科学与技术广东省实验室教授沈永义、肖立华等科研人员，通过联合攻关，在新型冠状病毒潜在中间宿主的溯源上取得突破。他们的最新研究表明，穿山甲为新型冠状病毒的潜在中间宿主。

     由于相关论文并未发表或提交到预印本杂志，更多的细节无从知晓。本文章通过解读2019年10月24日发表的一篇介绍穿山甲与冠状病毒相关的一篇文章，来提供一些更详细且可能相关的信息。

摘要

穿山甲是一种亟须保护的濒危动物。识别和编目穿山甲携带的病毒是评估潜在病原体范围和帮助保护的一种合理方法。本研究为了解马来亚穿山甲的病毒群落以及马来亚穿山甲与其他宿主间优势致病性病毒的分子流行病学提供了依据。通过从头拼接的方法构建的contigs数目共62,508个，BLAST搜索发现其中3600个(≥300 nt)与病毒序列相关，其中68个contigs与已知病毒序列高度相似，主要的病毒为仙台病毒和冠状病毒。这是关于穿山甲病毒多样性的第一份报告，扩展了我们对濒危物种病毒组的理解，并提供了对病毒整体多样性的洞察，这些病毒可能直接或间接地跨种传播到其他哺乳动物。

前言

     马来亚穿山甲(Manis javanica)是一种典型的哺乳类动物，是世界上仅有的八种穿山甲之一。其中四种来自亚洲M. javanica, M. pentadactyla, M. crassicaudata and M. culionensis)，其余四种主要来自非洲(M. tricuspis, M. tetradactyla, M. gigantea and M. temminckii)。与其他胎盘哺乳动物不同，穿山甲皮肤上覆盖着大量重叠的角化鳞片。其肉质美味和药用价值使其成为世界上偷猎和贩运最多的哺乳动物。这就是为什么所有八种穿山甲都包括在《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)中。由于这些濒危物种的生存状况和野生种群数量的持续下降，中国已经采取了协调一致的措施来保护和拯救圈养的这些物种。同时，健康状况不佳、免疫力低下也是穿山甲抢救面临的重要问题。已有报道从穿山甲身上获得了副流感病毒5的完整基因组序列，暗示穿山甲除了面临人类的伤害，还面临传染病的风险。近年来，大量的病毒宏基因组学研究发现了人、猪、牛、蝙蝠、猫、马、鸡等动物携带的致病病毒，其中一些成功地分离出了新的病毒株。然而，我们对穿山甲等珍稀濒危陆生脊椎动物的疾病及其病因仍知之甚少。

病毒是一种只在活细胞内进行复制的传染媒介，有能力感染多种宿主。关于确定病毒感染性、致病性和对宿主微生物群影响的最佳方法，病毒学学界进行了大量讨论。病毒学家使用多种方法来了解感染、复制、致病性，以及最近病毒基因组的进化。环境样品中核酸的无偏测序在发现和鉴定各种微生物方面具有巨大的潜力。我们将这种技术称为宏基因组学，或随机、不可知或鸟枪法高通量测序。从理论上讲，宏基因组学技术使样品中所有微生物的鉴定和基因组鉴定成为可能。随着新一代测序(NGS)方法的引入，这种方法越来越受欢迎。与以前的测序技术相比，新一代测序方法可以在更短的时间内以更低的成本提供更多的数据。虽然最初主要应用于细菌多样性分析，但样品制备方案的修改也允许对病毒基因组进行表征。科研人员已经抓住机会，扩大了我们在病毒发现和生物多样性表征领域的知识。

2019年3月24日，广东省野生动物救助中心从海关缉私局接收了21只活马来亚穿山甲;大多数个体健康状况不佳，身体布满了皮疹，其中包括成年和亚成年个体。所有这些马来亚穿山甲都是由广东野生动物救助中心救助的，但经过广泛的抢救，有16只穿山甲死亡。死亡穿山甲以肺肿大为主，肺内含泡状液体，有肺纤维化症状，少数死亡穿山甲肝脾肿大。我们从11具马来穿山甲尸体收集了21个有明显症状的肺、淋巴和脾脏器官样本，通过病毒宏基因组技术来发现病毒多样性和潜在病毒病因的分子流行病学。本研究对穿山甲疾病的研究及后续的救援工作具有一定的参考价值。

结果

1. 病毒宏基因组

三对广东省野生动物救援中心提供的11只死亡马来亚穿山甲身上收集肺、淋巴和脾脏共21份样本，对其进行深度测序，共获得227.32 GB的原始数据，其中有233587条reads与NCBI的NR数据库中的病毒序列高度相似，共注释到了28个病毒家族，其中丰度最高的是疱疹病毒科和副粘病毒科（图1）。

使用MEGAHIT 1.0版本根据overlap关系对clean reads进行组装，一共获得62508个contigs，将这些contigs使用BLAST的方式进行病毒鉴定，共确认68个已知病毒，其中DNA病毒占20.59%而RNA病毒占79.41%。而有3532个contigs通过分析被划为疑似病毒，其中DNA病毒占66.53%而RNA病毒占33.47%,。在带有病毒注释的congtigs中选取丰度前30的进行热图绘制，发现大部分为副粘病毒科、黄病毒科和伪病毒科（图2）。

2. 仙台病毒

    在11只马来亚穿山甲中有6只发现了仙台病毒，推测此病毒在穿山甲身上为普遍存在，其中从个体19的肺组织中成功组装出长度为13232 bp的病毒序列，占仙台病毒基因组总长（15384 bp）的86%，具有高度一致性，而其他注释为仙台病毒的contigs长度范围为：608~7027 bp。从ViPR数据库下载了人源、鼠源和猴源的仙台病毒全序列与组装得到的13232 bp长的仙台病毒序列进行进化树分析，发现马来亚穿山甲体内的仙台病毒与人源的仙台病毒相似度最高，与鼠源的仙台病毒相似度最低。

3. 冠状病毒

在11只马来亚穿山甲中有2只（07和08号个体）体内发现了冠状病毒科的成员。在这些穿山甲标本中，产生了更长的contigs，长度范围为503~2330 bp。虽然发现的冠状病毒种类较多，但其中SARS-CoV分布最广、丰度最高。从ViPR数据库下载来自不同宿主的Alphacoronavirus，Betacoronavirus，Gammacoronavirus和Deltacoronaviruses的全基因组序列。与本项目中鉴定到的16个冠状病毒序列一并进行进化树分析（图3），系统发育分析表明冠状病毒contigs与冠状病毒属间存在多种关系。

结论

    我们发现马来亚穿山甲的病毒多样性很高，仙台病毒和冠状病毒可能是导致它们死亡的主要病原体。仙台病毒表现出马来亚穿山甲与人类分离株的密切关系，而冠状病毒序列表现出高度的物种多样性。为了更好地阐明它们的致病作用，还需要进一步的研究来比较这些病毒在健康和患病穿山甲个体中的发病率。这是我国首次对穿山甲病毒多样性进行宏基因组研究。这项研究扩展了我们对濒危物种病毒多样性的理解，以及直接或间接跨越到其他哺乳动物的能力。Reference

1. Ping Liu, Wu Chen and Jin-Ping Chen, Viral Metagenomics Revealed Sendai Virus and Coronavirus Infection of Malayan Pangolins (Manis javanica), Viruses 2019, 11, 979; doi:10.3390/v11110979