雷特综合症(Rett syndrome)治疗的新靶标

诸平

雷特综合症（Rett syndrome）简介

雷特综合症（Rett syndrome）是一种类似于孤独症（但是又不同于孤独症）的神经系统疾病。1966年，奥地利医生安德里亚斯·雷特（Andreas Rett）首次对其进行了描述。它是一种复杂的神经紊乱综合征，之后便以其姓氏雷特来命名此病并沿用至今。雷特综合征是一种严重影响儿童精神运动发育的疾病，发病率为1/10000～1/15000，主要发生在女孩身上。临床特征为女孩起病，呈进行性智力下降，孤独症行为，手的失用，刻板动作及共济失调。患有这种疾病的大多数患者都会有多种严重的残疾，并且一生都依赖他人的照顾。6个月到18个月大的患有此病的儿童都会表现出智力迟钝，不停的扭曲他们的手，会感到焦虑的情绪，而且常常会出现行动和呼气困难。虽然这种疾病的严重程度和发作时间因人而异，但雷特综合征只有一个起因，那就是，一个叫做MeCP2的单基因发生了突变。

虽然雷特综合症的发病率为1/10 000～1/15 000，而且仅仅累计女孩，多数为散发病例，部分病例（约0.5%～1%）有家族史，且同卵双胎发病具有高度一致性，因此被认为是遗传性疾病。但是，对于该病的遗传方式及病因至今尚不清楚，不过近年来在神经病理、神经生化及遗传学方面已经取得了一些新进展。

神经病理及神经放射学研究

神经病理及神经放射学研究认为：（1）患者存在包括大脑和小脑在内的普遍脑萎缩及普遍的大脑皮层锥形细胞树突数目减少，树突、突触形成不良；（2）全脑神经元细胞的体积减小，无活动性神经变性的证据，无明显神经元数目减少；（3）前脑胆碱能神经元数目减少，此区域是大脑皮层胆碱能神经元的主要区域；（4）基底节神经元细胞内黑色素减少，此区域神经元数目是否减少报道不一，但有细胞死亡的证据，未见到神经变性的表现；（5）单光子发射计算机化断层显像（single photon emission computed tomography简称SPECT）显示，2～3岁雷特综合症患儿的脑血流灌注类型相当于2～3个月的正常婴儿，病理结果示脑异常的程度与死亡时症状的严重性密切相关。

遗传学研究

雷特综合症确切的遗传方式至今尚不清楚。因雷特综合症主要累及女性，过去较为普遍的观点为X连锁显性遗传，男性胚胎致死，并引入X染色体非随机失活的假设。但近来的研究不支持雷特综合症致病基因位于X染色体，双胎X染色体失活类型及单亲双体的研究提供了进一步的证据。Migeon研究了三对单卵双胎患雷特综合症的女孩，两对有雷特综合症一致性，一对无雷特综合症一致性。结果显示，X染色体非随机失活发生于单卵双胎儿，但并不与雷特综合症类型相关。另外，患雷特综合症的单卵双胎绝大多数（11/12）的一致性表型，从未在其他已知为X连锁突变疾病的女性双胎中观察到，此亦为雷特综合症是否为X连锁的一个争论点。X染色体非随机失活在非X连锁疾病中也有报道。尽管如此，仍不能完全否认X染色体在雷特综合症中的作用。Bühler等提出假设，认为雷特综合症是一个常染色体上的位点与一个X染色体上的位点共同作用的结果。Anvret等在上述假设的基础上，选择了染色体11p14-pter区域进行研究，因为此区域包括了神经元生长发育的重要基因。包括酪氨酸羟化酶、脑衍生神经营养因子、多巴胺D4受体和类胰岛素生长因子2。在其所研究的家系中，对这个区域的基因进行探测未发现有序列异常。但作者认为雷特综合症因两个位点共同作用致病的可能性大。这两个位点可能一个位于常染色体上，一个位于X染色体上，也可能在2个位点均位于常染色体上。

有关婴儿早期脑细胞程序化死亡的异常是否可以解释雷特综合症患者的神经病理变化的问题也作了进一步研究。bcl-2在细胞凋亡中起重要作用，故对其位于22号染色体上的基因进行了分析，6个患者的bcl-2基因的检测未发现有序列异常。

Naidu等认为雷特综合症母系遗传的特点提示应对其细胞质中唯一的遗传物质线粒体DNA进行分析，特别是在雷特综合症患者发现了肌活检肌纤维线粒体结构和多个呼吸链酶功能的异常。但近来两项应用脑磁共振分光成像的研究，并未发现线粒体异常。也有报道，在黑质区，一些神经元的线粒体内基质被圆形包涵体所填充，在皮质和小脑神经元的线粒体基质内有电子致密颗粒状包涵体。与其他线粒体病一样，雷特综合症患者也有乳酸酸中毒和脑脊液乳酸、丙酮酸水平升高，与氧化还原状态的改变相一致，但有作者认为这是由于呼吸异常造成的。Naidu等应用SSCP及DAN测序的方法对22个tRNA基因进行了分析，未发现异常，也未发现线粒体DNA有明显的重排。Hass等对导致其他线粒体病的几个线粒体DNA突变热点（线粒体DNA第3243、8344、8993位点）及4977 bp的“共同缺失”进行了检测，也未见异常。Lewis等对雷特综合症患儿线粒体DNA上编码22个tRNA的基因进行检测，发现1例患儿编码tRNA～tRNA及tRNA～tRNA的区域线粒体DNA异常，2例患儿编码tRNA区域的线粒体DNA异常。此后，他又对2例雷特综合症患儿血标本及3例患儿死后的脑组织标本进行研究，发现其中1例患儿存在tRNA10463位点T→C的点突变，此位点位于高度保守区且正常对照中未发现此突变。除线粒体DNA外，核DNA亦可引起线粒体异常，染色体Xp21-22包含编码线粒体丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因，所以从线粒体异常的角度也应列为候选基因，但目前对此区域的研究尚未发现异常；皮肤成纤维细胞的丙酮酸脱氢酶定量测定，水平亦正常。所以对于线粒体DNA和与线粒体结构和功能异常相关的核DNA的分析还有待进一步研究。

生化研究

生化研究证实：（1）雷特综合症患儿在新皮层、海马、丘脑和基底节，胆碱乙酰基转移酶（ChAT）的活性显著降低，与神经病理发现的在前脑的胆碱能神经元减少一致。另外，研究发现，脑脊液神经生长因子的水平下降。神经生长因子是前脑胆碱能神经元发育所必须的。这些资料表明，胆碱能神经元功能缺陷可能为初始因素，可能引起一些其他的缺陷如锥体外系功能障碍。另外，前脑胆碱能神经元有显著的性别差异的易损性，与这些神经元上的雌激素受体的不同分布有关，如果胆碱能神经元功能缺陷确为雷特综合症发病的初始因素，此点可对患者的性别比例差异做出解释。（2）在尸解组织和脑脊液中生物胺水平变化报道不一。（3）在丘脑中，β-内啡肽水平升高，脑脊液中谷氨酸水平升高。总之，临床、生化和神经病理资料表明，雷特综合症是一种神经发育性疾病，可能为婴儿早期细胞凋亡（Apoptosis）的异常或一些神经营养因子的缺乏，在生后最初几年影响最严重，因为此时正是树突增殖高峰和突触形成时期。

MECP2与雷特综合症

雷特综合症的发现，是2个表现出相同而不寻常行为的女孩，在维也纳儿科医生安德烈亚斯·雷特（Andreas Rett）候诊室碰巧在一起等候就诊。因此，奥地利儿科医生安德烈亚斯·雷特在1966年首次对其进行了描述，1988年是吴希如首先报道了中国的雷特综合症病例，1999年Ruthie E. Amir等人确定位于染色体Xq28的MECP2基因是雷特综合症的致病基因。详见Ruthie E. Amir, Ignatia B. Vanden Veyver, Mimi Wan, Charles Q. Tran, Uta Francke, Huda Y. Zoghbi. Rett syndromeis caused by mutations on X–linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics, 1999, 23(2): 185-188.发现在甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)中的突变引起雷特综合症和其他神经发育障碍，已经唤起人们关注神经元功能中后天修饰的重要性。

寻找到某种疾病的致病突变是理解疾病的里程碑，但这往往只是理解疾病的第一步。而雷特综合症的情况更加复杂，因为该疾病中的突变基因控制着一系列其他基因。雷特综合症属于孤独症谱系障碍，是主要影响女孩的单基因神经性疾病。2013年6月，英国爱丁堡大学（University of Edinburgh）与美国哈佛医学院（Harvard Medical School）的科学家们阐明了 MECP2 基因突变引发雷特综合症的关键步骤，相关研究论文刊登在了《自然》（Nature）和《自然-神经科学》（Nature Neuroscience）杂志上。尽管MECP2蛋白早在1992年就已经被科学家发现，之后科学家通过雷特综合症小鼠模型展示，即使在疾病晚期，受损的大脑细胞也能恢复功能，这表明雷特综合症是可以治愈的。不过，此前人们还不了解雷特蛋白的功能。为此，科学家们开始检测雷特综合症患者体内的突变，希望鉴定MECP2蛋白中的关键区域。他们在错义突变的基础上，明确了2个关键区域。一是甲基结合域MBD，即MECP2 与甲基化DNA结合的位点，MECP2通过这一结合调控下游基因的表达。二是MECP2与 NCoR/SMRT结合的区域，该区域被研究人员称为NID（NCoR/SMRT Interaction Domain）， NCoR/SMRT是负责关闭基因的多蛋白复合体。

研究人员对6500多名健康者的基因组进行研究，发现与雷特综合症刚好相反，健康人的MBD和NID中不存在任何形式的突变。这一结果进一步证明了MBD和NID的重要性。NID中最频繁的雷特突变发生在306号氨基酸。研究人员将这一突变引入小鼠模型，发现该突变影响了MECP2和NCoR/SMRT蛋白的相互作用，使小鼠表现出类似雷特综合症的症状。由此研究人员认为，此前人们只知道MECP2结合在基因组的甲基化位点；而现在发现，MECP2的功能依赖于将NCoR/SMRT带到DNA上的能力。而刊登在《自然》（Nature）上的另一项研究成果，针对的则是与306号氨基酸非常接近的308号氨基酸。研究人员指出，感知输入会使308位点添加磷酸基团，改变MECP2蛋白与NCoR/SMRT的相互作用，从而影响下游的蛋白表达。研究人员构建了308位点发生突变的小鼠，使其无法在该处添加磷酸基团，他们发现原本受MECP2控制的基因发生了调节异常。研究人员表示，突变小鼠的大脑重量减少，运动系统异常，容易发生癫痫，这些都与雷特综合症的症状相符。研究显示， 308位点的修饰，对于MECP2的正常功能很关键，这一位点的异常可能引起雷特综合症。因此，研究人员指出，MECP2是否添加磷酸基团依赖于神经元的活性。在童年时期，感知输入会使MECP2上的多个位点发生修饰，包括308位点。而这些修饰对大脑的正常发育非常重要。故研究人员认为，要开发有效的治疗药物，就得先理解MECP2的功能，以及MECP2 突变的致病机制。而这两项研究表明，在雷特综合症的背后，存在着MECP2-NCoR相互作用的异常，这是一个重要的进步。

Ruthie E. Amir等人于1999年首先公布雷特综合症与MECP2基因突变连锁。已证实40%～80%的典型雷特综合症患儿存在该基因突变，潘虹等人在中国典型雷特综合症患儿中也发现近60%存在MECP2基因突变。但雷特综合症家系和非典型雷特综合症患儿该基因突变的检出率相对较低，分别为20%～29%和10%～50%。MECP2基因全长112 756 bp，包括4个外显子，人与小鼠相比，在3’非翻译区有8个保守序列，可能与转录稳定和转录后调节有关。cDNA全长1 533 bp。由于3’-非翻译区多聚腺苷酸位点的不同，有3种转录本:1.9, 7.5, 10 kb。不同转录本的表达与功能特点尚不完全清楚。

甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG binding protein 2, MeCP2)含486个氨基酸，主要有2个功能区:甲基化CpG结合区(methyl-CpGbinding domain, MBD)和转录抑制区(transcription  repressiondomain, TRD), 2个核定位信号(nuclearlocalization signal)，一个位于转录抑制区内，另一个位于MBD和TRD之间。C末端有进化保守的多聚组氨酸和多聚脯氨酸区，可能与MeCP2蛋白与核小体核心结构的相互作用有关。MeCP2蛋白通过MBD与DNA上单一对称的甲基化CpG结合，TRD募集Sin3A，组蛋白去乙酰化酶组成共抑制复合体，使核小体中H3,H4组蛋白去乙酰化，染色质压缩而不能转录。

MeCP2蛋白是甲基化结合蛋白家族中的主要成员之一，作为一种转录抑制因子，它在DNA甲基化调节基因转录过程中起着重要的作用。典型雷特综合症表现为一些体细胞生长障碍，但以神经系统异常为主。MeCP2蛋白是一种高丰度的染色质结合蛋白，广泛表达，但MECP2基因突变却仅引起神经系统特异的发育性疾病。利用基因敲除技术造成小鼠MECP2基因完全缺失或选择性脑组织缺失，均可出现与人类雷特综合症类似的表型，并且突出表现为中枢神经系统异常。这提示发育中的脑比其他组织更依赖MeCP2蛋白的转录抑制作用，推测致病机制为MECP2基因突变导致蛋白结构和功能异常，使胚胎发育时期应当转录静止的基因继续转录，而这种“转录噪音”对神经系统的生长和发育具有致病作用。但是，哪些基因表达受MeCP2蛋白的调控尚不清楚。更多信息请浏览:张玉稚，潘虹，包新华，吴希如. Rett综合征与MECP2基因.国外医学儿科学分册，2004，31（3）：157-159.以及Rodney C. Samaco, Jeffrey L. Neul. Complexities of Rett Syndrome and MeCP2. The Journal of Neuroscience, 2011, 31(22): 7951-7959.

PTP1B与雷特综合症等疾病的相关性

据美国化学会《化学与工程新闻》（C&EN）周刊网站2015年7月30日报道，美国冷泉港实验室（Cold Spring HarborLaboratory简称CSHL)、美国布朗大学（Brown University）分子药理学、生理学以及生物技术系，分子生物学、细胞生物学以及生物化学系的研究人员合作，开发出一种可以抑制磷酸酶的抑制剂，应用于雷特综合症的老鼠模型，发现可以改善其疾病症状。因此，研究者认为这种酶（PTP1B）有可能会成为治疗雷特综合症的靶标。

PTP1B是蛋白酪氨酸磷酸酶1B（ProteinTyrosine Phosphatase-1B，PTP-1B）,是美国华盛顿大学的NicholasK. Tonk等人1988年, 首次在人的胎盘细胞中分离和纯化后得到的第一个37kDa的蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）。PTP1B也被称为蛋白酪氨酸磷酸酯酶非受体1型（Tyrosine-protein phosphatasenon-receptor type 1简称PTPN1）。PTP1B是一种胞内PTP（蛋白质络氨酸磷酸酶，protein tyrosine phosphatase)，位于内质网，在人体的各种组织中都有表达；其与蛋白酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases简称PTK）共同维持着酪氨酸蛋白磷酸化的平衡，参与细胞的信号转导，调节细胞的生长、分化、代谢、基因转录和免疫应答等。

蛋白质酪氨酸磷酸化是细胞代谢,信号传导及细胞周期调控的重要调节步骤，PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，该家族40余种磷酸酶都具有一个约240个氨基酸组成的同源序列，位于酶催化活性部位，以跨膜受体样蛋白和胞内酶形式存在，催化蛋白质酪氨酸去磷酸化反应。PTP1B通过对胰岛素受体激酶（Insulinreceptor kinase简称IRK）或者IRK活性片段的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用对胰岛素信号传导进行负调节。越来越多的证据表明PTP1B在调节胰岛素敏感性和能量代谢的过程中均起着重要作用,通过抑制PTP1B可增加胰岛素和瘦蛋白的活性。

PTP1B属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族，专一水解芳香族磷酸，如磷酸化酪氨酸（phosphotyrosyl，pTyr）残基上磷酸根的酶，通过对胰岛素受体或其底物上的酪氨酸残基去磷酸化作用，对胰岛素信号转导进行负调节，组织细胞中PTP1B过表达都会降低PTK的活性，使胰岛素受体无法与胰岛素结合，进而引起胰岛素抵抗，最终导致2型糖尿病。近10余年来，以PTP1B为抗2型糖尿病和肥胖症的新靶点的研究很多。王辰等人2004年对于PTP1B与2型糖尿病及肥胖的相关研究进展曾经有专门的论述，详见王辰，王沥，杨泽.蛋白质酪氨酸磷酸酶PTP1B与2型糖尿病及肥胖的关系.遗传, 2004, 26(6): 941-946。8年之后，上海药物研究所郭跃伟(Yue-wei GUO)等人，对于近10年的大约300种对PTP1B活性具有抑制作用的次代谢物的相关研究进行了概述，同时对这些抑制剂的构效关系和选择性进行了分析论述，还讨论了其他蛋白磷酸酯酶以及几种PTP1B抑制剂的潜在医药应用远景。详见Cheng-shi JIANG, Lin-fu LIANG, Yue-wei GUO. Natural products possessing protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibitory activity found in the last decades. Acta Pharmacologica Sinica，2012, 33: 1217–1245; doi: 10.1038/aps.2012.90.另外印度旁遮普大学（Panjab University）的Thareja S和ISF药学院（ISF College of Pharmacy）的研究人员合作，对于PTP1B抑制剂也有综述报道，详见：Thareja S, Aggarwal S, Bhardwaj T R, Kumar M. Proteintyrosine phosphatase 1B inhibitors: a molecular level legitimate approach for the management of diabetes mellitus. Med Res Rev, 2012, 32(3): 459–517. doi:10.1002/med.20219. 下面图1是PTP1B磷酸酯酶活性的2步机理

        雷特综合症是由基因突变引起的,代码甲基-CpG-结合蛋白2(MECP2)。在细胞中这种蛋白质调节许多其他基因的表达,MECP2基因已成为联系基因型与人类神经发育性疾病的重要转录抑制因子。研究MECP2基因的下游靶基因及其功能，将为揭开雷特综合症发病机制的谜团会提供重要帮助。但是，由于MECP2涉及面广，使科学家寻找可能的药物靶点研究进展不尽人意。

  但美国冷泉港实验室（Cold Spring HarborLaboratory）的尼古拉斯·唐克斯（Nicholas K. Tonks）和他的同事们，通过MECP2构成的网络搜索并未发现PTP1B。尼古拉斯·唐克斯几十年来一直在从事酶研究，以此作为治疗2种代谢疾病即糖尿病和肥胖的可能靶标。Navasona Krishnan是尼古拉斯·唐克斯实验室的一名研究助理,聆听了一场关于雷特综合症与代谢异常的讲演之后，建议尼古拉斯·唐克斯等人应该考虑以雷特综合症为靶标的特定酶。

尼古拉斯·唐克斯等人，2015年7月27日在《临床研究杂志》（The Journal of Clinical Investigation）网站发表了他们的最新研究成果——Navasona Krishnan, Keerthi Krishnan, Christopher R. Connors, Meng S. Choy, Rebecca Page, Wolfgang Peti, Linda Van Aelst, Stephen D. Shea, Nicholas K. Tonks. PTP1B inhibition suggests a therapeutic strategy for Rett syndrome(点击可以免费下载原文). The Journal of Clinical Investigation, 2015, 125(8): doi:10.1172/JCI80323.在这项新研究中,研究小组将PTP1B与MECP2连接在一起:他们发现基因工程化使小鼠缺乏MECP2基因，会使其大脑中PTP1B的水平增加。这些经过基因改造的小鼠显示出雷特综合症患者所具有的症状。接下来,科学家们表明,两个小分子PTP1B抑制剂使小鼠的症状得到改善,包括社会行为不足和运动技能。

美国凯斯西储大学医学院（Case Western Reserve University School of Medicine）的神经学家David M. Katz说,这些发现是新颖而令人兴奋的。他指出,PTP1B与已知的Rett综合症被中断的信号通路相互作用,所以，此结果提供了另一个来修复重要途径的工具。

美国阿拉巴马大学医学院的神经病学家艾伦·珀西（Alan K. Percy）认为，这篇研究论文提出了一个值得进一步研究的有趣策略。研究人员应该对Rett综合症其他模型中的PTP1B进行进一步深入研究,包括在患者体内发现的已知的MECP2突变动物的研究,证实该酶在雷特综合症疾病中扮演的角色。“我猜想，这篇论文的发表，可能会一石激起千层浪,”艾伦·珀西说。

http://www.rettsyndrome.org/file/2014/2014-RettsyndromeOrg-Impact-report.pdf