上篇介绍了为什么要做目标区间重测序，遗传学的应用，优势和翼和的专利技术Hi-Reseq。具体内容见：

目标区间重测序—PostGWAS研究之利器 （上篇）

在跟客户的交流中，有以下几个问题经常被客户问，这里总结了一下，与大家共同探讨一下。

是可以做目标区间重测序分析的，因为这是两种不同的分析模式，目标区间重测序可以发现目标区间内所有的变异，属于直接分析；而SNP分析只是选择了几个TagSNP进行与疾病的相关性分析，属于间接分析。已经发表了SNP与疾病的相关性，再进行目标区间重测序分析反而更有可能获得阳性结果，因为TagSNP与疾病的相关性表明在其附近存在着真正的致病位点，通过Hi-Reseq更加有可能发现casual SNP。

Ø 取样方案1***

病人的小家系和同胞为最佳取样方案，最好样本量可以达到200以上，可分析家系内病人和正常人之间的变异位点，也可分析病人与病人间共有的突变，对变异的遗传结构进行分析。

Ø 取样方案2**

在病人流动性比较大的医院，如上海地区的医院同时取病例组和对照组，可以分析在人群中的单倍型结构。

Ø 取样方案3*

若研究的疾病为罕见疾病，可只取病例组样本进行靶向重测序，将千人基因组计划中汉族人群的数据作为对照，进行变异分析。

当Hi-Reseq目标区间仅关注全部外显子区和外显子内含子的剪接位点时，无法检测到由于基因剂量效应导致的疾病与基因突变的相关性。最佳方案是在进行靶向重测序时，将启动子区，5’-UTR和3’-UTR都作为目标区间进行重测序分析，对转录因子结合位点（TFBS）、miRNA剪接位点等进行注释，进一步补充变异信息，从而对基因与疾病的相关性以及基因的致病位点有更加全面系统的认识。

这不是绝对的，原因有3个。第一，分析的方法。Hi-Reseq同样会得到目标区间内各变异在各样本的基因分型，基因与疾病/性状的关联不是使用相关性分析，而是在于发现序列变异对蛋白氨基酸的影响，例如对蛋白表达和结构的影响；第二，群体大小。分析的群体必须是大队列样本，如果在大规模样本中仍然没有发现有功能的变异，这个结果也是有意义的；第三，目标基因。选择的目标基因通常为公认的疾病相关的关键基因，而在大队列样本序列分析中未发现功能变异，这有可能排除了该基因与疾病的相关性。当然如果要证明这个结论，需要更多实验进行验证才行。总之，采用合适的分析方法、正确的目标基因，在大队列样本中进行目标区间重测序研究，结果是阴性依然是有意义的。

以一篇文章为例：Salomon MP, Li WLS, Edlund CK et al. (2016) GWASeq: targeted re-sequencing follow up to GWAS. BMC Genomics, 17:176 doi:10.1186/s12864-016-2459-y

技术路线

由于文章中区间大于5.8MB，所以采用芯片捕获的方式进行目标区间重测序；区间在5-200kb的，选择我们的Hi-Reseq更合适哦！

捕获、测序、mapping、SNP calling获得了目标区间内的SNP信息后，依据SNP质量对样本进行质控，选择数据质量高的样本进行后续关联分析。

Common SNP关联分析，筛选MAF>0.005的SNP位点，使用Plink软件进行逻辑回归关联分析，并将性别、疾病诊断的年龄等作为协方差纳入分析模型。然后，使用R软件的P.adjust程序包进行FDR纠正，剔除假阳性关联。结果表明，作者在6个目标区间内定位到10个变异与疾病显著关联，其中8个是新发现的疾病相关变异。

作者还对11个目标区间的测序覆盖度（box plot）和所有变异位点的关联结果质量（QQ plot）进行了统计分析。

Rare SNP关联分析，使用R软件SKAT程序包，检测了common和rare两类变异的混合效应。本文中，将注释为UTR、外显子、内含子、已知基因附近1kb、两个已知疾病关联基因间的间隔区的变异总计307个变异位点进行关联分析，FDR矫正P值。结果表明，定位到2个变异集与疾病显著关联。这两个显著关联变异集分别是C11orfS3的3’端UTR区和ATF1基因的5’端UTR区。

通过这篇文章主要结果的概述，您是否get到目标区间重测序的魅力所在了呢？翼和Hi-Reseq通过目标区间序列分析，可发现目标区间内所有变异的类型、分布（包括已知和未知的变异），计算变异与疾病的相关性。无论是common还是rare变异都有相应的统计分析方法研究其与疾病的相关性呢！比全基因组重测序、全外显子测序目的更明确、更灵活、结果更可靠、SNP质量更好、性价比更高！

别犹豫啦！快来联系我们开启自己的PostGWAS探索之旅吧！

翼和技术优势

上海翼和生物目标区段重测序服务采用翼和自主研发的多重PCR技术，克服扩增效率不均一问题，保证每个扩增子间拷贝数差异控制在平均深度的5-10倍（利用ABI7900定量PCR检测多重PCR产物，根据CT值判读产物浓度，确保产物间的均一性），90%扩增子reads数大于15，不浪费测序通量，也可根据客户需求，加大测序深度。

翼和特色

本公司自主研发的发夹修饰引物应用于超高重PCR建库+第二代测序技术，提高了多重PCR扩增体系对目标区间的捕获效率和均一性扩增，在候选基因大规模人群验证和发现人群中的序列变异方面非常有优势。我们利用该技术，已与各类合作研究人员完成了上百次候选基因的重测序项目。Hi-Reseq大大降低了大队列样本中序列分析的成本，使得疾病和数量性状的遗传学研究从GWAS统计学相关性的间接分析过渡到了序列分析的直接分析阶段。

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