脑科学的曙光——精准光遗传技术

浙江大学斯科教授团队受邀撰写综述“精准光遗传学的关键技术及进展”被选为《激光与光电子学进展》第8期封面论文。文章从技术原理、光路构建和系统优化等对精准光遗传学研究进行分析和讨论，同时讨论了技术局限问题和可能的解决方案，并展望了精准光遗传学技术的未来发展方向和应用场景。

封面解读：封面下方的神经元群展现了小鼠大脑的微观情况，精准光遗传学技术激活指定神经元，控制小鼠产生相关行为。精准光遗传学是一种研究神经集群与行为或病理相关性的有力工具，极大地推动了脑科学的发展，为未来的智能时代开拓道路。

封面文章链接：王一帆, 郑瑶, 朱玥, 徐晓滨, 龚薇, 斯科. 精准光遗传学的关键技术及进展[J]. 激光与光电子学进展, 2022, 59(8): 0800001

一、背景

光遗传学采用光学手段对大脑神经活动进行调控。然而由于光在生物组织中的非侵入穿透深度极其有限，传统光遗传学一般采用损伤性植入光纤的方式，导致光刺激的空间精度无法保证。

精准光遗传学具有单细胞精度的神经调控能力和亚细胞精度的神经元集群活动实时检测能力，这些功能的实现依赖具备深穿透能力、高时空分辨率的光学系统。精准光遗传学的出现，为神经科学的研究开辟了新的研究方向，为神经环路与神经性疾病研究乃至脑科学领域开辟了全新的研究范式。

二、基本原理

光遗传学是一种整合了光学和遗传学技术，通过遗传学手段改造光敏感蛋白靶向神经元，并通过光学手段改变这些光敏感蛋白功能，进而影响神经活动。在研究大脑中精细神经元集群功能时对空间尺度要求非常高，比如行为活动与哪个脑区的哪些神经元直接关联，是否存在足以影响特定行为的神经集群，以及神经元或神经元集群之间信息传递的时序是怎样的，等等，这些问题的探究需要将光调控的空间范围缩小到单个神经元。

在真空中，光可以很容易地实现近衍射极限的精准聚焦。然而，由于不透明的脑组织中存在脂肪组织、纤维组织以及其他软组织，因此光束在中传播过程中存在散射。

高时空分辨率光学系统使用散射补偿技术或者长波光源克服组织散射，可以实现在生物组织内部近衍射极限的聚焦，这种单细胞分辨水平的光遗传学被称之为精准光遗传学。在过去的几年中，出现了两类用于精准光遗传学研究的光学系统，分别为精准光聚焦单光子光遗传学系统和双光子光遗传学系统。

2.1 精准光聚焦单光子光遗传学系统

单光子光遗传学系统为短波光束激发，在进行大脑神经活动研究中受脑组织的散射影响严重，它的精准聚焦依赖散射补偿技术。

散射补偿技术包含传输矩阵、相位共轭技术和机器学习辅助的波前校正技术等。它们先对由样品的各向异性散射造成的扭曲波前（图1（b））进行探测，再利用有源光学器件引入共轭的相位进行波前补偿，在样本上形成衍射极限聚焦光斑（图1（c））。

图1 精准光聚焦单光子光遗传学系统原理示意图。(a) 理想的显微镜聚焦； (b) 生物样本组织散射影响光束聚焦；(c) 补偿像差，恢复衍射极限焦点

多种单光子光遗传学工具经过不断优化，目前可以实现传统组织近毫米深度的衍射极限聚焦。

但是单光子光刺激的两个限制：样本组织对连续光的散射和单光子光刺激焦点的低轴向分辨率。目前，全息技术与单光子光遗传学系统的结合可以克服以上两种限制，实现选择性的在体单细胞光激活，且基于DOPC的TRUE系统已经实现了使用532 nm的光在800 μm急性脑片中空间分辨率提高四倍的神经元光激活，这些可以充分证明基于传输矩阵、相位共轭技术或者机器学习辅助的波前校正技术有望帮助单光子光遗传学系统实现单细胞精度的神经元光调控。

2.2 双光子光遗传学系统

双光子激发（2PE）具有高轴向分辨率和对散射的强鲁棒性的固有属性，因此双光子（2P）光遗传学能够提供非侵入式的精准神经元靶向，对于探究单个或2-3个神经元在环路中作用具有相当强大的作用。在双光子光遗传学研究进程中，出现了两类针对单细胞光刺激的光靶向策略，通常被称为串行扫描激发方法和并行图案化刺激方法（图2）。

图2 神经元的双光子光刺激靶向策略。（a）基于双光子扫描显微系统的多细胞双光子光激活；（b）基于并行图案照明的多细胞双光子光激活

双光子串行扫描系统一般由扫描单元、望远镜系统和物镜组成（图3（a））。

光聚焦为一个微米尺度的高斯光斑，当扫描单元工作时，该光斑在样品面上迅速移动。通常使用的扫描元件有两类：电流计扫描器和声光偏转器。标准电流计扫描器和共振扫描振镜的结合使用可以提供在体三维光活化和神经活动观测，用于研究神经集群的活动和功能。声光偏转器可以对光束进行无惯性扫描，响应时间短于电流计扫描器，然而声光偏转器的最大偏转角仅有0.3°~ 3.5°，因此只适用于小体积范围扫描，通常用于快速三维钙成像。

图3 双光子光遗传学系统示意图。（a）扫描光路图；（b）基于SLM的双光子扫描并行图案化光刺激系统图

基于全息的双光子多点照明可以实现光刺激的并行化，光束经过空间光调制器相位调制，在像面上形成多个靶点，以用于刺激多个细胞，同时集成共振扫描系统进行神经活动的观测（图3（b））。并行照明的相位调制依靠于三种技术：计算机生成全息术（CGH），广义相衬对比或者扩展高斯光束照明。

三、应用

精准单光子光激活和钙成像结合的挑战在于激活光敏蛋白和激发钙指示剂荧光的光波长存在光谱重叠。为了解决上述问题，一些红移的钙荧光指示剂被开发出来，它们可以与蓝光激活的光敏蛋白结合使用。单光子光激活与钙成像的成功结合已经成功应用在线虫、清醒小鼠等模式动物的神经环路功能研究。

双光子光遗传学由于光谱分离、精准靶向等优势，已逐渐从验证活体光激活进入到神经元集群功能研究层面。目前在斑马鱼摆尾行为控制、小鼠大脑视觉皮层神经集群功能研究和小鼠社交与进食研究等行为研究中均取得了突破性进展，双光子光遗传学技术的发展为神经集群的功能和可塑性的研究奠定了基础。

四、讨论

精准光遗传学已经成为神经元集群功能研究最重要的技术手段，为脑科学的探索开辟了全新的研究方向。纵观精准光遗传学的发展历程，未来可能在以下几个方面取得重大突破：

1）更深层脑组织神经元的读取和操控，有赖于更长波长响应和激活的、更加灵敏的光敏蛋白和离子指示剂；

2）观测和调控的神经元数量的提升，目前已有研究者将同时钙指示剂荧光观测的神经元数量提高到了百万量级，如果未来能够结合能力匹配的光调控量级，将为大规模神经元集群的研究提供巨大推力；

3）高级哺乳动物甚至是灵长类动物的精准光遗传学研究，更大的脑容量不仅对光遗传学系统提出了更高的要求，也对模式动物的行为学与神经科学的建模研究提出了更高难度的挑战；

4）模式动物复杂活动场景的精准光遗传学研究，当前的研究设备还局限在模式动物头部严格固定的精准光遗传学实验，伴随着微型化设备的开发和迭代，在可以预见的数年内，头戴式精准光遗传学系统设备将被开发出来并广泛应用，极大拓展模式动物的行为学研究范围。

精准光遗传学是一个集合了多学科的研究方式，伴随着脑科学发展的国家需求与前沿突破，未来将有更多的学科参与其中，全面推动系统开发与工具、设备研制，为神经科学的研究开辟广阔的天地。

作者简介：

斯科，浙江大学教授、博导，主要研究方向为生物光子学，包括脑功能信息的光学获取（深穿透光学成像技术和系统）、脑功能精准光学调控（非侵入精准光遗传学等）和医学人工智能。入选海外高层次人才引进计划，浙江大学脑科学与脑医学学院副院长、教育部脑与脑际融合前沿科学中心副主任、卫健委医学神经生物学重点实验室副主任、科技部光电科技国际联合研究中心副主任。担任中国激光杂志社青编委、《激光与光电子学进展》编委。担任中国光学学会生物医学光子学专业委员会副秘书长、中国生物医学工程学会生物医学光子学分会委员、中国仪器仪表学会显微仪器分会理事、浙江省神经科学学会系统与行为分会副主任、浙江省光学学会理事等。在Nature Photonics、PNAS、Theranostics等发表学术论文50余篇。累计专利转让3000多万元。主持多项国家自然科学基金会重点项目、面上项目等。