分离到一种位于原核生物-真核生物“交界”的古菌

Isolation of an archaeon at the prokaryote–eukaryote interface

Nature [IF:42.778]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-019-1916-6

发表日期：2020-01-15

第一作者：Hiroyuki Imachi^1,11 and Masaru K. Nobu^2,11

通讯作者：Hiroyuki Imachi
(imachi@jamstec.go.jp)^1,11 and Masaru K. Nobu(m.nobu@aist.go.jp)^2,11

合作作者: Nozomi Nakahara, Yuki Morono, Miyuki Ogawara,Yoshihiro Takaki, Yoshinori Takano, Katsuyuki Uematsu, Tetsuro Ikuta,  Motoo Ito, Yohei Matsui,Masayuki Miyazaki,Kazuyoshi Murata,Yumi Saito,Sanae Sakai,Chihong Song,Eiji Tasumi,Yuko Yamanaka,Takashi Yamaguchi,Yoichi Kamagata,Hideyuki Tamaki,Ken Takai

主要单位：

¹日本海洋与地球科学技术局(Institute for Extra-cutting-edge Science and Technology Avant-garde Research (X-star), Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), Yokosuka, Japan)

²日本国立先进工业科学技术研究所(Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba, Japan)

摘要

关于真核起源的说法一直以来都备受争议，最近的研究认为真核生物起源于一个被称为“阿斯加德”的古菌，科学家在这类古菌基因组中发现了类似真核的基因组特征，但由于实验室中一直没有分离到这类古菌，相关生理代谢功能无法研究，从古菌到真核到底是如何进化的仍不清楚。来自日本的一个研究团队报道了一株历时十二年从深海底泥中分离到的阿斯加德古菌的纯培养物，起名为“普罗米修斯”菌MK-D1，MK-D1是一株严格厌氧、生长及其缓慢，直径约550 nm的球菌，可以与其他菌株共生降解多种氨基酸。MK-D1的细胞中没有发现细胞器结构，取而代之的是从细胞膜上分化出形态复杂而奇特的长长的“触手”，如封面所示。作者结合阿斯加德古菌的纯培养、基因组和生活方式等特征提出了一种关于真核起源的假说模型，“纠缠—吞噬—内生”模型。

封面

背景

在2015年5月的Narure杂志上，荷兰的一个团队从深海热液口的宏基因组数据拼出了一个在进化距离上与真核十分接近的新古菌门，取名为“洛基”。两年以后，同一个团队又在Nature上发表了一篇文章，这次他们从其他环境中拼出了三个与洛基古菌具有亲缘关系的古菌门，分别取名“奥丁”、“索尔”和“海姆达尔”，都是北欧神话中众神的名字，并将它们归属到阿斯加德古菌超门中，北欧神话中众神居住的地方。他们结合阿斯加德基因组的特征推测出阿斯加德古菌和另外一种细菌形成了一种内共生关系，这个内共生体是原始真核细胞的线粒体。这项研究有利的印证了之前关于真核起源的内共生假说，于2020年1月份正式发表在Nature上，被称为是“微生物生态上的登月事件”。

其实在阿斯加德古菌被发现之前，该团队就已经开始在深海寻找真核生物的祖先了，他们搭建了一个模拟深海厌氧甲烷喷口的反应器来富集一份深海底泥样本，用了五年半的时间才看到生命迹象，这份富集样品中包含了阿斯加德超门的洛基、海姆达尔和奥丁古菌，此外还有部分还有脱硫弧菌和产甲烷古菌。为了进一步富集，他们从反应器中取样用仅含有基础盐和四种抗生素的CA培养基又培养了一年多才看到混浊。随后作者通过qPCR技术定量了其中的洛基古菌MK-D1，发现MK-D1生长及其缓慢，需要14-25天才仅能翻一倍(图1a)，而且无论怎样调整温度、培养基成分和浓度都不能增加其生长。无奈作者还是保留了CA培养基继续传代，到第八次传代时环境中仅有大概15%的MK-D1，当到第11次传代时已经完全去掉了脱硫弧菌，作者通过进一步的分离培养最终获得了MK-D1的纯培养物，他们以在希腊神话中用泥巴创造了人类的普罗米修斯给MK-D1命名Prometheoarchaeum syntrophicum。

图 1 培养的 Lokiarchaeota 菌株 MK-D1 的生长曲线和显微照片

a MK-D1 在单独添加酪蛋白氨基酸 (CA) 的厌氧培养基中的生长曲线； 含有 20 种氨基酸的酪蛋白氨基酸 (AAs) 和奶粉 (PM)； 或蛋白胨和奶粉。 还显示了用 10 倍和 100 倍稀释的酪蛋白氨基酸、20 种氨基酸和奶粉喂养的培养物的结果；

b,c 8 (b) 和 11 (c)次传代 转移后富集培养物细胞的荧光图像，用 DAPI(紫色)染色，并与靶向 MK-D1(绿色)和细菌(红色)的核苷酸探针杂交；

d 来自富集培养物的细胞在 11 次传代转移后与靶向MK-D1(绿色)和产甲烷菌(红色)的核苷酸探针杂交的荧光图像。 FISH 实验进行了3次，结果相似；

e MK-D1 和产甲烷菌的高度纯化共培养物的扫描电镜(SEM)图像。 白色箭头表示产甲烷菌细胞。 我们观察到四种不同的与产甲烷菌的共培养物。n = 40 个记录图像的代表；

比例尺，10 μm (b, c) 和 5 μm (d, e)。

MK-D1是一株直径约为550 nm的球菌(图2a,b)，表面有大量的胞外聚合物，正在分裂的MK-D1细胞表面有一圈小气泡，细胞内含有明显的细胞器结构，细胞膜可分出囊泡结构以及像触手一样的突出物。

图 2 MK-D1的显微特征和脂质组成

a-c MK-D1 的 SEM 图像。 单细胞 (a)、被 EPS 样材料覆盖的聚集细胞 (b) 和带有气泡极性链的分裂细胞 (c)；

d MK-D1 的冷冻电子断层扫描图像。 右上角的插图显示了矩形区域的放大图，以显示细胞的包膜结构；

e 附着在 MK-D1 细胞上和周围的大膜囊泡的冷冻电镜图像；

f MK-D1 细胞和膜囊泡的超薄切片。 右下角的插图显示了膜囊泡的放大视图；

g,h 产生长分枝 (g) 和直 (h) 膜突起的 MK-D1 细胞的 SEM 图像；

i 带有突起的 MK-D1 细胞的超薄切片；

j 从高度纯化的 MK-D1 培养物中提取的脂质的气相色谱-质谱 (GC-MS) 总离子色谱图；

比例尺，1 μm (b、c、g、h)、500 nm (a、d、e、i) 和 200 nm (f)；a-c、g、h、SEM 图像代表 n = 122 个记录图像，这些图像是从四个培养样品的四个独立观察中获得的。d、e、Cryo-EM 图像代表 n = 14 个记录图像，这些图像来自两个培养样本的两个独立观察。f, i, 超薄切片图像代表 n = 131 个记录图像，这些图像来自六个培养样品的六个独立观察。图中白色箭头表示大的膜泡。脂质组成实验重复两次，结果相似。

作者通过宏基因组分析推测阿斯加德古菌具有共生降解10种氨基酸和多肽能力，于是作者在甲烷菌属MO-MB1和MK-D1的共培养物中添加了¹³C和¹⁵N标记的氨基酸，图3b-e中的丝状的菌为MO-MB1，球状的菌为MK-D1，他们发现被标记的N存在且仅存在于MK-D1细胞中，另外还有¹³C标记的甲烷和二氧化碳的变化是依赖于MO-MB1的，并且添加高浓度的氢或甲酸盐会极大的抑制MK-D1的生长，这说明MK-D1确实有降解氨基酸的能力并将分解产生的氢和甲酸盐转移给了MO-MB1。作者对MK-D1的纯培养物进行了全基因组分析，发现MK-D1可通过水解或氧化含氧酸产生酰基辅酶A生成ATP，且MK-D1仅含有一种脱氢酶和一种甲酸脱氢酶，分别介导氢和甲酸盐的产生。

图 3 MK-D1 的互养氨基酸利用

a 基于基因组的 MK-D1 的代谢重建。显示了已识别(彩色或黑色)和未识别(灰色)的代谢途径。对于已识别的途径，每个步骤(实线)或过程(虚线)都标有氧化(红色)、还原(蓝色)、产生 ATP(橙色)或消耗 ATP(紫色)。波浪箭头表示化合物的交换：甲酸盐、H2、氨基酸、维生素 B12、生物素、硫辛酸盐和焦磷酸硫胺素 (TPP)，预计这些化合物会被配对的卤代硫弧菌和/或产甲烷菌代谢或合成。生物合成途径以黄色背景表示。指示了宏转录组学检测的氨基酸分解代谢途径(氨基酸上方的黑点)。DHDH，4,5-二羟基-2,6-二氧己酸酯； DHDG, 2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸; DHDG6P，3-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸6-磷酸； Ac-CoA，乙酰-CoA； 尿，尿酸盐； Fo-Glu，甲酰谷氨酸； CH3=H4F，亚甲基四氢叶酸； CH≡H4F，亚甲基四氢叶酸； Fo-H4F，甲酰四氢叶酸； 2OB，2-氧代丁酸酯； 丙-CoA，丙酰-CoA； ACAC，乙酰乙酸酯； GB-CoA，γ-氨基-丁酰-CoA； But-CoA，丁酰-CoA； Fd，铁氧还蛋白； XSH/X-S-S-X，硫醇/二硫键； TCA，三羧酸循环； PPP，戊糖-磷酸途径；

b-e 用¹³C-和¹⁵N-标记的氨基酸混合物培养的高度纯化的MK-D1的NanoSIMS 分析；

b SYBR Green I 染色细胞的绿色荧光显微照片。聚集体是 MK-D1，丝状细胞是甲烷杆菌属菌株 MO-MB1(由于细胞膜的高刚性和低渗透性，荧光可能很弱)；

c ¹²C(青色)的 NanoSIMS 离子图像；

d 12C15N/12C14N(品红色)的 NanoSIMS 离子图像；

e b–d 的叠加图像；

d，颜色条表示以¹⁵N/¹⁴N表示的15N相对丰度。比例尺5 μm。NanoSIMS分析由于其缓慢的生长速度和低细胞密度而没有重复进行。然而，为了确保重现性，我们使用了两种不同类型的 MK-D1 高纯度培养物。n = 8
个记录图像的代表。

作者利用MK-D1的单基因组构建了系统发育树(图4a)，可以看出MK-D1和真核生物的进化距离十分接近，且在MK-D1基因组中和转录组中发现了80种真核细胞的信号蛋白，其中包括肌动蛋白、凝溶胶蛋白、泛素蛋白、内涵体分选复合物III、LC7结合域蛋白和小GTP结合域蛋白等，作者还比较了MK-D1和其他阿斯加德古菌超门的基因组(图4b)，发现它们大部分都含有氨基酸降解的途径、介导共生菌种间电子转移相关的酶以及发酵产生丙酸盐或丁酸盐的途径。

图 4 MK-D1 的系统发育和 Asgard 古菌的分解代谢特征

a MK-D1 的最大似然树(100 次bootstrap复制)和基于在三个域中保守的 31 种核糖体蛋白选择培养的古细菌、真核生物和细菌。还显示了关键分支点的Bootstrap值。 我们使用了 14,024 个对齐点来构建树。

b 显示了个体基因组中氨基酸降解、电子代谢、发酵、C1
代谢、硫代谢和有氧呼吸的存在与否(完整路径，完整循环；大部分完整的路径，半循环)。对于氨基酸代谢，专门用于分解代谢或降解的途径以粗体显示。甘氨酸代谢通过丙酮酸(上)或甲酸(下)。丁酸代谢是可逆的(发酵或β-氧化)；然而，丁酰辅酶A脱氢酶往往与基因组中的EtfAB相关，表明形成了用于丁酸发酵的电子混淆复合物。通过甲基丙二酰辅酶A脱羧酶、生物素羧基载体蛋白和丙酮酸羧化酶的存在确定丙酸。丙酸代谢也是可逆的； 然而，Asgard 古细菌中没有任何成员编码用于互养降解的完整基因集。醇脱氢酶可以具有不同的底物特异性。

基于以上发现，作者提出了一种真核起源的模型，纠缠—吞噬—内生模型(图5)。起初阿斯加德的“老祖宗”靠着与硫酸盐还原菌的协同作用生活在无氧的深海中，阿斯加德古菌将氨基酸降解为短链脂肪酸和H₂供给硫酸盐还原菌，同时硫酸盐还原菌能够清除抑制阿斯加德古菌生长的氢，随着地球上的氧浓度不断升高，阿斯加德古菌不得不寻找能够清除氧并提供ATP的内共生体，它们伸出长长的”触手“将有机营养的好氧菌包裹住，将好氧细菌吞噬形成一个共生体，形成原始的核膜，被吞噬后的好氧菌进行好氧呼吸清除对阿斯加德古菌有毒的氧，同时通过阿斯加德古菌降解氨基酸产生的含氧酸获得能量，随后内共生体中发展出ADP/ATP载体，形成最原始的线粒体，然后经过长期的演变形成现在的真核细胞。

图 5 提出的真核发生假设模型

a 互养/发酵宿主古菌可能通过与H₂清除(或间接o₂清除)的SRB相互作用，将氨基酸降解为短链脂肪酸和H₂；

b 宿主可能进一步与兼性好氧的有机营养伙伴相互作用，该伙伴可以清除有毒的 O₂(未来的线粒体；红色)。与 SRB 的持续互动可能是有益的，但不一定是必要的； 虚线箭头表示相互作用；

c 宿主外部结构可能与需氧伙伴相互作用(例如，机械或生物融合 50)以增强物理相互作用并进一步吞噬伙伴以同时发展内共生和原始类核结合膜；

d 在被吞噬后，寄主和共生体可以继续进行b中所示的相互作用，作为一种原始的内共生类型；

e 内共生体开发 ADP/ATP 载体 (AAC)(ATP转运的初始方向尚不清楚)；

f 宿主通过将分解代谢和 ATP 生成委托给内共生体并建立共生体到宿主 的ATP 通道来使伙伴共生内源化。

结论与展望

作者分离培养了一株与真核生物进化距离十分接近、具有奇特的代谢和细胞形态特征的阿斯加德古菌，并结合基因组分析提出了一个解释真核起源的假说模型，纠缠—吞噬—内生模型。下一步仍需要对MK-D1、其他阿斯加德古菌及相近真核生物进行更深入的研究，基因是如何随着漫长的时间转移的，内共生体中第一个线粒体和内膜系统是如何生成的等问题值得进一步的研究和讨论，这些研究对帮助理解真核细胞形成的意义重大。

编绎：中科院微生物所 李秀桐

责编：马腾飞 南京农业大学

审核：刘永鑫 中科院遗传发育所

Reference

Hiroyuki Imachi,Masaru K. Nobu,Nozomi Nakahara,Yuki Morono,Miyuki Ogawara ,Yoshihiro Takaki,Yoshinori Takano,Katsuyuki Uematsu,Tetsuro Ikuta,Motoo Ito,Yohei Matsui,Masayuki Miyazaki,Kazuyoshi Murata,Yumi Saito,Sanae Sakai,Chihong Song,Eiji Tasumi, Yuko Yamanaka,Takashi Yamaguchi,Yoichi Kamagata,Hideyuki Tamaki,Ken Takai.Isolation of an archaeon at the prokaryote–eukaryote interface.Nature 577,519–525 (2020).https://doi.org/10.1038/s41586-019-1916-6

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