土壤中硫利用和微生物化学计量的底物控制：¹³C、¹⁵N、¹⁴C 和 ³⁵S 四重标记的结果

Substrate control of sulphur utilisation and microbial stoichiometry in soil: Results of 13C, 15N, 14C, and 35S quad labelling

The ISME Journal [IF: 10.302]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41396-021-00999-7

发表日期：2021-05-11

第一作者: Qingxu Ma^1,2

通讯作者：Lianghuan Wu(finm@zju.edu.cn)¹

合作作者:Yakov Kuzyakov,Yakov Kuzyakov, Sheng Tang, David R. Chadwick, Yuan Wen, Paul W. Hill, Andy Macdonald, Tida Ge, Linlin Si, Davey L. Jones

主要单位：

¹浙江大学环境与资源学院(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Agricultural Resources and Environment, Ministry of Education Key Lab of Environmental Remediation and Ecosystem Health, College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou, China)

²英国班戈大学自然科学学院(School of Natural Sciences, Bangor University, Gwynedd, UK)

翻译：张丽燕

摘要

由于在收获期间减少了硫酸盐基肥料的施用以及连续的硫回收,全球植物的硫(S)缺乏正在增加。本研究对含硫(S)的氨基酸半胱氨酸和甲硫氨酸进行了¹³C，¹⁵N，¹⁴C和³⁵S四重标记，以追踪土壤中硫(S)循环和微生物硫(S)转化。结果表明，土壤微生物在数分钟内吸收了施用的半胱氨酸和甲硫氨酸，数小时内释放了硫酸根(SO₄^2-)，在数天内重新利用了硫酸根(SO₄^2-)。氨基酸结构决定了初始微生物利用率和硫酸根(SO₄^2-)释放量。甲硫氨酸(Met)释放的硫酸根(SO₄^2-)比半胱氨酸(Cys)少2.5倍。微生物量中甲硫氨酸比半胱氨酸保留了更多的碳和硫。微生物将半胱氨酸分解为丙酮酸和硫化氢，而将甲硫氨酸转化为α-酮丁酸和S-CH₃。4天后，半胱氨酸衍生硫酸根(SO₄^2-)吸收和甲硫氨酸衍生二氧化碳(CO₂)释放平衡了半胱氨酸和甲硫氨酸衍生的C、N、S的微生物化学计量。微生物C:N:S的动态变化表现为C的快速利用和损失，N水平稳定和S积累。因此，土壤微生物对有机硫的短期利用取决于氨基酸结构，而对有机硫的长期利用取决于微生物的化学计量特性。

引言

硫(S)是一种重要的植物常量营养素。它在辅酶A、叶绿素、生物素、硫胺素和谷胱甘肽(GSH)的生物合成中起着关键作用。植物S缺乏症在世界范围内已有报道，这是由于过去30-40年间大气中二氧化硫排放量的减少、低硫/高氮/高磷肥料的施用、粪肥或秸秆对土壤硫的返还减少，以及高产作物对土壤硫的大量需求和去除。除石膏土和其他土壤外，有机S占土壤总S的90%。有机S必须先转化为无机硫酸根(SO₄^2-)，才能被根系吸收。以氨基酸为主的微量有机S被根系直接吸收。尽管植物S缺乏症的发生率越来越高，但地下S的生物地球化学循环尚未完全阐明。因此，迫切需要一种预测和控制土壤有机硫矿化和资源化的策略。

半胱氨酸(Cys)是所有光自养和化学自养生物中协调S、C和N同化的中心代谢产物。它是硫（S）同化的终末代谢物，也是甲硫氨酸/蛋氨酸(Met)、谷胱甘肽(GSH)等硫（S）代谢物生物合成的起点。甲硫氨酸是微生物产生挥发性有机硫化合物的前体，如甲硫醇、二甲基硫化物和二甲基二硫化物。甲硫氨酸产生的硫酸根(SO₄^2-)通常可以忽略不计。微生物使用甲硫氨酸而不是半胱氨酸构建蛋白质的效率更高，因为前者释放的硫酸根(SO₄^2-)最少。然而，利用含硫氨基酸的微生物类群及其相关的调控机制尚未清楚。

土壤有机质(SOM)中的S主要以含S氨基酸Cys和Met的形式存在，来源于粪便、动物残体、死亡植物和微生物。蛋白质在细胞外被蛋白酶分解成短肽和单个氨基酸。这些物质是植物根系和微生物的高度生物可利用的氮(N)和硫(S)来源。微生物完全从土壤溶液中去除半胱氨酸和甲硫氨酸，并在几分钟到数小时内矿化它们。部分碳、氮和硫作为微生物生物量(MB)被固定。然而，人们对短期(几分钟到几小时)的碳、氮和硫循环或微生物分解小有机分子的机制知之甚少。微生物从周围环境中吸收元素，并在其生物量中保持相对稳定的浓度。这种现象被称为化学计量内稳态。有机质分解和养分循环速率可能是底物与微生物生物量之间化学计量不平衡的函数。元素循环包括土壤微生物响应化学计量失衡恢复C:N:S稳态，以及化学计量平衡对有机质分解的影响。作物残茬C:N:S比值在550:8-13:1-2之间。对于细菌和真菌，C:N:S比值分别为38:9.5:1和105:11:1。当C:N或C:S比值下降到一定阈值以下时，净氮(N)和硫(S)矿化发生，补充的氮(N)和硫(S)被释放以维持微生物生物量化学计量。基质和分解者之间的化学计量失衡强烈影响微生物生理和微生物介导的生物地球化学。

在景观、植物-土壤生态系统、土壤剖面和微生物热点的尺度上，碳、氮和磷的循环过程在氮、磷添加和极端温度的影响下被解耦。然而，关于基于特定含S底物(如氨基酸)存在的微尺度解耦机制知之甚少。一定数量的甲硫氨酸和半胱氨酸是合成代谢微生物生物合成所必需的。它们被矿化分解为硫酸根(SO₄^2-)。如果甲硫氨酸和半胱氨酸主要固定在微生物生物量蛋白中，那么C、N、S会偶联。否则，由于微生物营养需求不平衡，C-N-S解耦就会发生。半胱氨酸和甲硫氨酸构成了低分子量的有机硫的大部分。他们的C:N:S质量比是38:9.5:1和105:11:1。他们巨大的氮和硫比例使得他们在微生物矿化过程中对碳、氮和硫的利用调查中很有用。它们也适用于检查维持微生物C:N:S化学计量学的调节机制。阐明有机硫的分解与土壤元素循环之间的关系，有助于解释土壤硫循环的生物化学、生物学和演化过程。

农家肥、堆肥(FYM)增加土壤有机碳含量和生物活性。相比之下，矿物肥能提供足够的氮(N)、磷(P)和硫(S)，但不能提供碳(C)。肥料输入通过改变有机碳和添加养分直接影响地下生物地球化学过程。它还通过调节生物活动间接影响地下生物地球化学过程。表层和底土在养分和元素含量、微生物生物量和群落结构、土壤碳年龄、生物有效性可及性和有机质分解速率方面存在差异。选择长期施用农家肥(FYM)或矿物肥的土壤，阐明有机硫的分解机理。所有土壤类型相同，暴露在相同的气候条件下。但两者在有机质含量和微生物生物量方面存在较大差异。我们的研究目标是：(1)确定土壤半胱氨酸和甲硫氨酸分解的关键过程；(2)确定半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)的分解是否对C、N和S的利用产生耦合或解耦，并诱导化学计量学调节的分解。(3)确定半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)是否在少量微生物存在的土壤溶液中迅速分解，和(4)验证长期施肥是否会影响这一过程。我们假设微生物在摄取半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)后通过释放NH₄⁺和SO₄^2-来平衡它们的C:N:S比值。因此，土壤中外源碳(C)、硫(S)含量会影响这一释放。为了验证这一假设，我们对半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)进行了四种标记(¹³C, ¹⁵N, ¹⁴C和³⁵S)。

主要结果

含硫蛋白和氨基酸的分解

Decomposition of S-containing amino acids and protein

Cys和Met在土壤中快速分解(t½<1min;**图1和图2**)，并迅速固定到MB中(³⁵S-MB:在2分钟内Cys为31%，Met为67%)。微生物吸收3 h后，37%的Cys和15%的Met以SO₄^2-的形式释放。释放的SO₄^2-被重新合并到MB中。Cys和Met的³⁵S-MB活性水平分别为61%和70%。15 min内，Cys和Met分别释放了28%和34%的NH₄⁺。随着时间的推移，NH4+产量下降，部分NH₄⁺被氧化成NO₃¹。该蛋白在低浓度下快速分解(t½<8min)，而近一半的S蛋白在48 h内转化为SO42−。在微生物生物量（MB）中固定化后，Cys和Met在固定化≤9h时的微生物C、N和S的化学计量值差异显著(P < 0.05)。相比之下，他们在96小时后相似。随着培养的进行，Met以CO2形式释放的C总量与Cys相似。短期内，半胱氨酸(Cys)释放的SO₄^2--S高于甲硫氨酸(Met)。因此，微生物生物量(MB)中保留的S相对较少。然而，在96h时释放的SO₄^2-被重新利用，Cys和Met的³⁵S-MB含量相似。根据¹³C-PLFA分析，利用Cys和Met的微生物群落无法区分。然而，从Met中提取的¹³C标记PLFA是Cys的3倍多。

图1 土壤中半胱氨酸和甲硫氨酸C、N 和S的转化

CO₂释放，C和S同化为微生物生物量，添加氨基酸后在指定时间利用¹⁴C-、³⁵S-、或 ¹⁵N 标记的半胱氨酸 (A) 和蛋氨酸 (B) 检测NH₄⁺,NO₃^- 和SO₄^2-的产生。

图2 土壤中的蛋白质中硫、半胱氨酸 (Cys) 和蛋氨酸 (Met)的简化循环机制

完整的 Cys 和 Met 在几分钟内几乎完全被微生物 (MO) 同化，这些微生物也可以利用蛋白质S。一些固定在 MO 中的 S 以 SO₄^2- 的形式释放，然后被 MO 重新利用以进行生长。蛋白质被芳基硫酸酯酶分解为Cys和Met，然后被MO利用。

有机硫在土壤溶液中的分解

Organic S decomposition in the soil solution

Cys和Met在土壤溶液中迅速矿化。提取的土壤溶液中微生物密度低于土壤本身。因此，17.3%的¹⁴C-Cys和43.3%的¹⁴C-Met在15分钟后分解(图4)。对于³⁵S, 5.5%的Cys和16.0%的Met转化为SO₄^2-。这一分解速率明显低于¹⁴C-Cys、¹⁴C-Met、³⁵S-Cys和³⁵S-Met在土壤中的分解速率。土壤溶液中Cys和Met的分解速率在≤15 min时较高，但在15 min ~ 24 h时显著降低。表层土壤Cys和Met的分解速率相对较快，且高施肥量时分解速率较快。

图4 土壤中的蛋白质中硫、半胱氨酸 (Cys) 和蛋氨酸 (Met)的简化循环机制

显示了土壤溶液中剩余的 ¹⁴C 或 ³⁵S 以及由 Cys 和 Met 产生的 ³⁵SO₄^2-。 有3个处理和2个土壤深度(n = 6)。 显示了每个土壤深度每个处理四个重复的平均值 ± SE。

讨论

含硫蛋白和氨基酸的分解

S-containing protein and amino acid decomposition

植物源性35s蛋白和氨基酸在土壤中的分解半衰期分别为<8min和<1min。因此，蛋白质和氨基酸的快速分解和高生物利用度对有机硫矿化至关重要。蛋白质和氨基酸矿化以及SO₄^2-释放和再利用分三步进行。(1)蛋白质和氨基酸被微生物生物量(MB)迅速吸收。蛋白质以氨基酸和肽的形式被水解和同化为微生物生物量(MB)。在MB中，35S-Cys和35S-Met在15min后分别保留了34.8%和68.8%，而S蛋白在MB中保留了20% (图2)。(2)微生物生物量(MB)中的S以SO42−的形式释放。添加蛋白质2 d后S释放率为50%，添加Cys 3 h后S释放率为37%，添加Met 24 h后S释放率为15%。土壤氮循环是由基质与基质间碳氮不平衡调节的。本研究结果表明，高硫基质吸收后微生物SO₄^2-释放以及基质与微生物之间的不平衡在土壤S循环中起着关键作用。SO₄^2-释放的强度可能取决于基质的性质，因为Met释放了相对少量的S。(3)释放的SO₄^2-被微生物重新吸收和再利用。微生物生物量(MB-S)在添加蛋白4 d后达到最高浓度。Cys和Met的35S-MB含量在孵化结束时最高。因此，SO₄^2-对微生物具有很高的生物有效性。

当C需求驱动微生物Cys和Met分解时，容易获得的C源，如葡萄糖，会减少这些氨基酸对¹⁴C的吸收和¹⁴CO₂的释放。在添加葡萄糖后，施用有机N(l-三丙氨酸)和P(葡萄糖-6-磷酸)可以降低¹⁴C的吸收。因此，C需求驱动有机N和P的分解。然而，高浓度的C或S对Cys或Met产生的¹⁴C的吸收影响很小。因此，微生物可以迅速获得这些氨基酸，而不管土壤元素状况如何。此外，添加S没有显著改变Cys或Met C的矿化。因此，土壤S供给满足了微生物的需求。在0.5h时，与未添加S相比，添加S使Cys和Met的SO₄^2-释放量分别增加了6倍和12倍。高硫添加降低了微生物对硫的需求，大部分硫以SO₄^2-的形式释放。添加C可能通过增加微生物生长和硫的需求来提高SO₄^2-的再利用。添加硫后，Cys和Met释放了相对大量的³⁵SO₄^2-，因为大量未标记的Na₂SO₄减少了微生物对硫的需求。氮素供应对上述过程没有明显影响，可能是因为现有土壤氮素储量足够。微生物对Cys和Met的吸收速率不受C或S状态的影响，但受C和S代谢和SO₄^2-再利用的显著影响。因此，含S氨基酸在土壤中快速分解，无机S生物有效性影响SO₄^2-的释放。

来自Cys和Met分解的微生物C或S的需求

C和S的添加显著影响有机质S的分解，但对MB吸收C和S的影响有限。添加C增加了Cys和Met的¹⁴CO₂释放量(Cys:从52%增加到67%;满足:从59%到69%;但同时降低了MB中的¹⁴C含量。N和S的添加对豆科植物C代谢和³⁵S吸收的影响最小。添加S后，Cys和Met的SO₄^2-释放量分别提高了193%和363%。

C, N和S通过分解和化学计量平衡与Cys和Met解耦的机理

对由Cys和Met衍生的C、N和S进行了分解解耦评估(图3）。根据化学计量学理论，Met应该比Cys释放更多的CO₂和更少的SO₄^2-，因为Met有相对较高的C:S比率。土壤微生物有效利用Met产生的碳和硫。我们观察到，15min后，MB中保留了46%和52%的¹⁴C和35%和69%的³⁵S，而Cys和Met分别释放了21%和10%的³⁵SO₄^2-。因此，Met缓慢释放SO₄^2-，而不是快速释放CO₂。由于Cys和Met的无机N(NH₄⁺和NO₃^-)产量分别为38%和40%，因此半胱氨酸和甲硫氨酸可以作为N源比较。相比之下，土壤微生物利用了来自丙氨酸的40% N，并在5 min内转化为NH₄⁺。Cys和Met的值类似。从C、N、S的化学计量学来看，微生物在吸收Cys和Met后，对N的需求高于对S的需求，释放SO₄^2-的比例高于NH₄⁺。然而，我们的结果并没有证实这些预期。有机S分解部分支持基于SO₄^2-和NH₄⁺生产水平的化学计量理论。然而，在加入Cys和Met后<9 h，实际释放的相对N和S量与预期的化学计量不符。因此，该模型并不完全适用于某些基质的短期分解。SOM质量比化学计量学对微生物利用率的影响更大。土壤微生物利用特定的机制来维持不同基质吸收后的化学计量平衡。在MB中固定化后，由于微生物C和S利用效率的变化，Cys和Met在添加后<9 h的微生物化学计量学上存在差异(*P* < 0.05)。0.25h时，Cys的C:N:S比值为52:63:35,Met的C:N:S比值为47:59:69。9 h时，Cys的C:N:S比值为15:77:32,Met的C:N:S比值为15:73:62。这些差异导致了CO2和SO42−产量的短期差异。然而，在96小时没有化学计量上的差异。那时(96小时)，Cys得出的C:N:S比率为13:82:61，而Met得出的C:N:S比率为9:82:70。Cys最初释放CO₂的速度比Met快，但随着孵育的进行，Met和Cys的累积CO₂-C释放速率相当。短期内，Cys释放的SO₄^2--S高于Met。因此，微生物生物量(MB)中的S保留率很低。释放的SO₄^2-被重新利用，在96 h时Cys和Met的³⁵S-MB含量相似。微生物通过它们的元素需求来平衡化学计量。这一机制解释了土壤和微生物生物量(MB)基质水平元素失衡。MB的相对元素含量随C、N、S底物含量的变化呈稳态调节曲线。因此，微生物具有统一的元素同化机制。

图3 土壤微生物 C、N 和 S 化学计量对半胱氨酸 (Cys) 和甲硫氨酸 (Met) 添加后的响应

分别为添加0.25H(A)，1h(B)，9h(C)和24h 后的微生物C、N和S的化学计量的变化。蓝色和粉色箭头表示土壤 中Cys 和 Met 微生物转化途径的集合群。尽管它们最初存在差异，但在 96 小时后 Cys 和 Met 的 C:N:S 化学计量呈收敛趋势。

土壤及土壤溶液中氨基酸的分解机理

Amino acid decomposition mechanisms in soil and soil solution

所涉及的微生物群落和代谢途径可能解释了Cys和Met分解速率的相对差异。土壤微生物元素化学计量学的变化与土壤微生物群落的变化有关。后者是对农业管理惯例的修改造成的。微生物群落动态可以缓解化学计量学的限制，并使系统以一种无法仅适用化学计量理论预测的方式进行。然而，我们的¹³C-PLFA分析显示，利用Cys的微生物群落和同化Met的微生物群落之间没有这种差异。然而，在PLFA中固定的Met-C比Cys-C多3倍。¹³C-PLFA含量与¹⁴C-MB一致，表明Met-C的大部分被集成到微生物生物量(MB)中。因此，不同微生物群落对Cys和Met的代谢而不是Cys和Met的同化影响了微生物对其衍生元素的利用。当基质被微生物细胞同化时，其原始的分子结构决定了将从基质中衍生出的生物分子。基质质量是控制C矿化和同化到微生物生物量(MB)中的主要因素。葡萄糖的利用率接近80%，而草酸的利用率仅为20%。早期的连续取样研究表明，矿化是Cys的关键，而非Met。即使在相对较高的Met摄取速率下，也只有少量的SO₄^2-被释放。在大肠杆菌中，由3-磷酸甘油酸或丙酮酸/半胱氨酸/草酰乙酸生物合成Cys和Met的机制分别消耗24.7和34.3个高能磷酸键。Met分解比Cys分解释放更多的能量。前者诱导微生物C和S同化。Cys中的还原性硫基团(硫醇，-SH)具有强亲核性。因此，Cys很容易转化为SO₄^2-。结果表明，L-Cys脱硫酶将Cys分解为丙酮酸、NH₄⁺和H₂S，丙酮酸分解为CO₂, H₂S氧化为SO₄^2-。Met被分解成α-酮丁酸、甲硫醇(HS-CH3)和NH₄⁺，并可能被代谢成β-硫甲基丙胺、S腺苷甲硫氨酸或α-酮-γ-硫甲基丁酸。但由于Met释放的NH4+水平较高，后一种过程的活性水平一定较低。然而，这一结论仅仅是基于我们目前的分析。因此，需要采用位置特异性同位素标记结合特异性代谢物检测的方法。该分析将为微生物代谢过程中Cys和Met的转化以及土壤元素循环中底物控制的形态变化提供验证数据。土壤中Cys的SO₄^2-释放量大于Met（图6）。因此，在分解过程中，聚集在聚集体和附着在矿物表面的微生物占优势。在土壤溶液中，Cys分解释放SO₄^2-慢于Met分解。Met中较高的C含量可能促进土壤溶液中相对较高的酶活性、C循环和微生物生长。因此，Met分解释放相对较多的CO₂-C，进而与较高的SO₄^2-释放速率相关。高肥料施用量引起的分解速度快可能是受MB和酶活性增加以及S含量降低的刺激。因此，含S氨基酸在土壤和土壤溶液中均可迅速分解。一般来说，微生物在Met吸收和代谢方面是非常有效的。

图6 土壤中的蛋白质中硫、半胱氨酸 (Cys) 和蛋氨酸 (Met)的简化循环机制

Cys和Met快速分解，但基础代谢不同，在土壤中Cys和Met快速同化为土壤微生物生物量(MB)。大量的C以CO₂的形式，而S以SO₄^2-的形式从Cys中释放，被微生物吸收的3h后，37%的Cys和仅15%的Met分解为SO₄^2-，进而同化成微生物生物量。此过程中分别有61%和70%的³⁵S-MB来自Cys和Met。15min内，Cys和Met分别释放28%和34%NH₄⁺。NH₄⁺的产生随时间下降，并部分转化成NO₃^-。Cys中还原的的硫醇(-SH)是亲核基团，因此，Cys很易转化成SO₄^2-。L-半胱氨酸脱硫酶将 Cys 分解为丙酮酸、NH₄⁺ 和 H₂S，丙酮酸分解为 CO2，H₂S 氧化为 SO₄^2-。Met分解为α-酮丁酸、甲硫醇 (HS-CH3) 和 NH₄⁺。Met 分解释放了相对更多的 CO₂-C，土壤溶液中的 SO₄^2- 比 Cys 多

结论

硫(S)循环包括微生物在几分钟内从土壤溶液中摄取Cys和Met，这些氨基酸在细胞内矿化，SO₄^2-在几小时内释放，SO₄^2-在几天内再摄取和再利用。Cys比Met释放更多的CO₂和SO₄^2-，这是因为这些氨基酸之间的代谢途径不同，而不是利用它们的微生物群落的组成不同。Cys和Met的分子结构决定了它们的短期利用。Cys最初分解为丙酮酸，而Met最初转化为α-酮丁酸和-S-CH3。这些差异解释了Cys和Met在微生物化学计量学上的差异。由于C在呼吸作用下不断丢失，以¹³C/¹⁴C、¹⁵N和³⁵S计算的Cys和Met的微生物C:N:S比值在0.25 h后分别为52:63:35和47:59:69，而在4 d后分别变为13:82:61 和9:82:70。因此，土壤微生物对有机硫的短期利用取决于氨基酸结构，而中期利用取决于微生物控制的化学计量学。

材料方法

实验场地和处理

2018年6月1日，在英国贝德福德郡沃本实验农场的一项长期有机施肥试验中，从选定的处理中收集了被归类为垄作(美国土壤分类)或砂壤土质地的棕砂。这项试验始于1964年，目的是评估矿物肥和有机肥对作物生产和土壤肥力的影响。土壤采集自以下处理：(1)仅相当于农家肥(FYM)的矿物肥料(N、P和K)，在25-50吨每公顷每年 (NM, 28年)，(2)施用农家肥(FYM)10吨每公顷每年施用16年(MM)，(3)施用农家肥(FYM)在25-50吨每公顷每年施用 28年(HM)。所有处理均为4个重复。自2003年以来，所有地块都实行5期轮作，包括冬黑麦、春大麦、冬豆、冬小麦和饲用玉米。NM和MM分别接受20\83和36kg每公顷矿质磷、钾和硫肥料。对于NM的处理，1964-2018年，全N、全P和全S(有机和无机)投入分别为2.46、1.77和0.96 吨/每公顷。HM的总C、N、P和S输入量分别为112.5、5.80、1.26和1.22 吨/每公顷。对MM而言，C、N、P和S的总投入分别为14.1、2.63、1.69和1.00 吨/每公顷。关于施肥处理的详细信息以前曾报道过。表土(0-23 cm耕层)和底土(23-38 cm深度)一式四份，用5mm筛网筛去石头、根系等有机质，4℃保存，待后续分析。土壤理化性状在Table S1中。

植物的蛋白质分解

为获得35s标记的蛋白质，用Na₂³⁵SO₄水培玉米植株，30d后收获根和芽，组织切成小块，在-80℃下冷冻，并按组织与水的比例1:2粉碎。为避免蛋白质分解的干扰，不使用提取液(如Tris-HCl)。组织悬液在4000 ×g, 20℃离心15分钟。回收上清液并预冷(-20℃)加入丙酮，形成最终的1:0.5上清液:丙酮的比例。4℃孵育12 h, 10000 × g 4℃离心15 min。沉积物用丙酮洗涤几次，抽真空15分钟去除残留的丙酮。沉积物中含有提取的植物蛋白。硫含量采用电感耦合等离子体发射光谱法测定(ICP-OES;Varian 710 ES, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)。
在20°C下，将0.5 mL 50μM S-蛋白(6kbq mL-l)滴入0 ~ 23 cm和23 ~ 38 cm处/每个NM、MM和HM样地采集的5 g田间湿土样品表面，测量³⁵S -蛋白矿化。每个处理制备4个重复。每个样品由6个分析单元组成，即在添加蛋白质后的0.25、1、2、4、6和12天进行测量。在每一个时间节点，每个重复一个分析单元中的35S用25 mL 0.01 M CaCl₂提取。由于砂土具有相对较低的吸收率，取各时间点土壤样品中总蛋白³⁵S含量与CaClsub/>2提取的³⁵S的差值为MB中固定的³⁵S数量(³⁵SMB = ³⁵Stotal−³⁵SCaCl₂)。对于CaCl₂提取，每毫升提取液中加入0.5 mL纯化水或1m BaCl₂，以预沉淀³⁵SO₄^2-。在18000 × g、20℃条件下离心5 min。水处理和BaCl₂处理之间35S活性的差异对应于来自标记蛋白的35SO42−数量(³⁵SSO₄^2- = ³⁵SCaCl₂+H₂O−³⁵SCaCl₂+BaCl₂)。土壤浸出物中总³⁵S少于³⁵S- SO₄^2-假定为土壤溶液中³⁵
S-蛋白的残留量(³⁵
Sleft = ³⁵
SCaCl₂−³⁵SSO₄^2-)。

含S的氨基酸分解

为了追踪不同土壤处理中C、N和S的时间转化，用¹⁴C-、¹⁴S-或¹⁵N标记的Cys或Met检测了土壤溶液中完整的Cys或Met, CO2释放，C、N和S被微生物生物量(MB)同化，以及产生的NH4+、NO3−和SO₄^2-)。通过13C-PLFA(磷脂衍生脂肪酸)分析，确定了同化Cys和 Met的微生物群落。

为了追踪C和S的转化，0.5 mL的50μM ¹⁴C-或³⁵S标记的Cys (¹⁴C: 20.6 kBq mL−l;³⁵S: 50.4 kBq mL−l)或Met (¹⁴C: 21.8 kBq mL−l;₄S: 51.8 kBq mL−l)添加到0-23 cm和23-38 cm处/每个NM、MM和HM样地的5 g田间湿土样品中。4个重复，10个时间点。从土壤中释放的¹⁴CO₂被捕获在土壤上方的一个包含1ml 1m NaOH的捕捉器中。土壤中剩下的¹⁴C或³⁵S提取用25毫升的0.5M  K2SO4或0.01M氯化钙在2分钟,5分钟,15分钟,0.5 h, 1 h, 3 h, 9 h, 24小时、48小时、96 h后在标记的半胱氨酸或甲硫氨酸添加到土壤样本。<3 h的孵育时间被认为是短期(h)，而24-96 h的孵育时间被认为是中期(d)。用0.01 M CaCl₂提取₄S-SO₄^2-)，并按之前方法检测。³⁵S活性的差异对应于标记的Cys和Met产生的SO₄^2-的数量(³⁵SSO₄^2-) = ³⁵SCaCl₂+H₄O−³⁵SCaCl₂+BaCl₂)。取0.01 M CaCl₂提取的土壤溶液中添加的总³⁵S与³⁵S- SO₄^2-的差值作为³⁵S- cys或³⁵S- met (³⁵Sleft = ³⁵SCaCl₂−³⁵SSO₄^2-)的残留土壤。将总³⁵S与从土壤溶液中提取的³⁵S之间的差异作为固定在MB中的³⁵S的数量(³⁵SMB = ³⁵totalal - 3³⁵SCaCl₂)。¹⁴C总活度减去土壤残留¹⁴C加上¹⁴CO₂的释放量作为¹⁴C在MB中的固定量(14CMB = ¹⁴C_total−¹⁴C_K2SO4−¹⁴C_CO2)。每个样品与4毫升Scintisafe 3闪烁混合液(Fisher Scientific, Loughborough, UK)混合，用配有自动猝灭校正的Wallac 1404液体闪烁计数器测定¹⁴C或35S活性(Wallac EG&G, Milton Keynes, UK)。用15N标记法检测Cys和Met的N转运。总之，2 mL 50μM 99.8%原子¹³C、¹⁵N双标记Cys和Met添加到每20 g在0-23和23-38 cm处采集的NM,MM和HM田间湿样中。每个土壤样品分别用80ml K2SO4提取0.25、1、9、24和96 h，在18000 × g、20℃条件下离心5min, NO3−和NH4+通过微量检测评价。采用扩散法测定土壤中NH₄⁺和NO₃−¹⁵N同位素比值。土壤溶液经过冻干(Labconco, Kansas City, MO, USA)，并用元素分析-同位素比质谱仪检测其15N 丰度。将总15N与从土壤溶液中提取的15N之间的差异作为固定在MB中的15N的数量(¹⁵NMB = ¹⁵N_total−¹⁵N_K2SO4)。3小时后，将13C 、15N双标记的Cys或Met添加到土壤样品中，如前所述提取、分离和纯化PLFAs。3 h后，Cys和Met的C被部分固定到PLFA中。每个PLFA中13C原子丰度采用气相色谱燃烧同位素比质谱检测 (GC-C-IRMS; Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, USA) 。环丙基和单不饱和脂肪酸是革兰氏阴性菌(G−)的指标。16:1 w7c, 17:1 w8c, 17:0 cyclo w7c, 18:2 w6c, 18:1 w9c, 18:1  w7c, 18:1 w5c, 和 19:0 cyclo w7c 展示13C标记的指标。

Iso-和顺支链脂肪酸(14:0 Iso, 15:0 Iso, 15:0 anteiso, 16:0 Iso, 17:0 Iso, 17:0 anteiso)是革兰氏阳性(G+)菌的指标。10Me-branched PLFAs (16:0 10-methyl, 17:0 10-methyl, 18:1 w7c 10-methyl, 18:0 10-methyl)作为放线菌的生物标志物。广泛存在于各种微生物中的饱和直链脂肪酸(15:0、16:0和18:0)被用作通用PLFAs。15:0 DMA是一个厌氧菌指标。18:1 w9c是农业土壤中G−细菌和森林土壤中真菌的指示物，在这里是G−的指示物。

有机硫在土壤溶液中的分解

评估土壤溶液中有机S分解,5克新鲜土样来自NM,MM和HM 的0-23cm和23-38 cm深度提取20毫升净化无菌水,在180 g×5分钟振荡,离心机在18000 g×20°C 5分钟。取上清液，土壤样品用10ml净化无菌水提取两次。结合上清液，18000 × g, 20°C离心5 min，每一上清液中加入50μM 14C-或35s标记的Cys或Met 0.5 mL，分别在0.25、0.5、1、3、9、24、48、48、96 h后，测定溶液中剩余的14C或35S以及生成的³⁵SO₄^2-(³⁵SSO₄^2- = ³⁵SH₂O−³⁵SH₂O+BaCl₂)。18000 × g离心后，土壤溶液中保留0.1-0.2%的微生物DNA。MB由土壤样品和溶液中的DNA含量表示，并根据制造商的说明用FastDNA SPIN试剂盒(MP Biomedicals, Irvine, CA, USA)提取。用NanoDrop sd -1000紫外-可见分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)测定DNA浓度。

Cys和Met分解过程中微生物C或S需求量的测定

为了估计C、N和S改良土壤后含S的氨基酸矿化，将5 g田间潮湿的土壤放在50 mL的离心管中，加入0.5 mL 50μM的¹⁴C-或35是标记的Cys或Met，并补充C、N或S。由于所有处理的Cys和Met分解速率相似，且与土壤深度和肥料施用量无关，因此只使用HM表土。土壤样品以2 mg g−1 C为葡萄糖，0.1 mg g−1 N为NH₄NO₃, 0.1 mg g−1 S为Na₂SO₄，溶解在50μM的¹⁴C或³⁵s标记的Cys或Met中。以50μm¹⁴C-或³⁵S标记的Cys或Met为对照。初始土壤C:N:S比值为13.1:2.2:1.0。添加C、N、S后，其比值分别为57.2:2.2:1.0、13.1:4.4:1.0、4.1:0.7:1.0。如前所述，在0.5 h、1 h、3 h、6 h、9 h、24 h、48 h和96 h时，测量溶液中¹⁴CO₂、¹⁴C- mb、³⁵S-MB、³⁵S-SO₄^2-、¹⁴C-和³⁵S-Cys、¹⁴C-和³⁵S-Met的含量。改良后，用熏蒸法测定微生物生物量C(MB-C)。

数据分析

底物矿化通常是双相的，用一个双过程，双一级动力学衰变模型描述：
f = （a1× exp -k1t）+ （a2 ×exp-k2t）
其中f为土壤中残留的¹⁴C-Cys或Met(占总添加量的%);a1和a2是被划分为主(池1;分解代谢的过程;微生物释放¹⁴CO₂)和较慢的次生(池2;生物质生产) 矿化率(%)。K1和k2分别为池1和池2的指数系数;t是时间h。池1或池2的半衰期(t½，h)计算如下： T1/2¼=ln (2) /k1
对SAS v. 8.2 (SAS Institute Inc.， Cary, NC, USA)进行正态性和同质性方差分析残差检验后，进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，然后进行Tukey ‘s post-hoc检验(P < 0.05)。指数衰减方程用SigmaPlot v. 10.0 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)计算。利用CANOCO v. 5.0(Microcomputer Power，Ithaca, NY, USA)对13C标记的PLFA指标数据进行主成分分析，确定施肥和土壤活性微生物群落的影响。用Origin v. 8.1 (OriginLab，北安普顿，MA, USA)绘制图像。

Reference

Qingxu Ma,Yakov Kuzyakov,Yakov Kuzyakov, Sheng Tang, David R. Chadwick, Yuan Wen, Paul W. Hill, Andy Macdonald, Tida Ge, Linlin Si, Davey L. Jones,Lianghuan Wu. Substrate control of sulphur utilisation and microbial stoichiometry in soil: Results of 13C, 15N, 14C, and 35S quad labelling. The ISME Journal(2021). https://doi.org/10.1038/s41396-021-00999-7