植物根际促生菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FZB42通过产生杆菌溶素(Bacilysin)控制由大豆疫霉引起的大豆疫病

The Plant-Beneficial Rhizobacterium Bacillus velezensis FZB42 Controls the Soybean Pathogen Phytophthora sojae Due to Bacilysin Production

Applied and Environmental Microbiology [IF: 4.792]

DOI：https://doi.org/10.1128/AEM.01601-21

发表日期：2021-11-10

第一作者: Xingshan Han(韩星闪)¹, Dongxia Shen(沈东霞)¹

通讯作者：Ben Fan(樊奔)(fanben2000@gmail.com)¹

合作作者: Qin Xiong, Beihua Bao, Wenbo Zhang, Tingting Dai, Yinjuan Zhao, Rainer Borriss

主要单位：

¹南京林业大学林学院(Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, College of Forestry,Nanjing Forestry University, 210037, Nanjing, China)

摘要

由卵菌类大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起的大豆根腐病是一种威胁中国大豆生产的严重土传病害。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FZB42 是革兰氏阳性植物根际促生细菌的模型菌株，能够产生多种抗生素。。在这项研究中，我们证明贝莱斯芽孢杆菌FZB42能有效地拮抗大豆疫霉菌(P. sojae)，然后研究了抑制的潜在机制。在合成抗真菌活性的脂肽类[杆菌溶素D(bacilysinD)和丰原素(fengycin)]和抗菌活性的聚酮类((杆菌素(bacillaene)、 艰难梭菌素(difficidin)和巨乳素(macrolactin))方面存在缺陷的FZB42突变体中，其对大豆疫霉菌(P. sojae)的拮抗作用并不受损；相反，缺乏杆菌溶素(bacilysin)生物合成的突变体完全丧失了对大豆疫霉菌(P. sojae)的拮抗活性，表明杆菌溶素(bacilysin)是造成这种活性的原因。通过分离的杆菌溶素纯品也证实了这个推论。杆菌溶素以前被证明主要对原核生物细菌而不是真核生物具有拮抗作用。在这里，我们发现杆菌溶素可以严重破坏大豆疫霉菌(P. sojae)的菌丝结构并导致其细胞内内容物的损失。我们发明了一种装置，允许大豆疫霉菌和贝莱斯芽孢杆菌FZB42在营养琼脂上相互作用。以这种方式，通过转录组学研究了FZB42对大豆疫霉菌的影响。FZB42显著抑制了与生长、大分子生物合成、致病性和核糖体有关的大豆疫霉菌(P. sojae)基因的表达。其中，果胶裂解酶的基因下调最明显。此外，我们还发现，杆菌溶素能有效地防止大豆芽孢杆菌的感染，并能拮抗不同的疫霉属(Phytophthora)物种，如棕榈疫霉菌(P. palmivora)、甜瓜疫霉菌(P. melonis)、辣椒疫霉(P. capsici)、荔枝疫霉(P. litchi)以及最重要的马铃薯晚疫病菌(P. infestans)。

重要性

疫霉菌(Phytophthora spp.)是广泛的真核植物病原体，通常是极其有害的。疫霉菌(Phytophthora)可以感染许多种对农业和林业重要的植物，因此会造成大量的经济损失。而由于之前对疫霉属常见真菌病原的认识不够，对疫霉属的生物防治研究有限。这项研究表明，贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42)可以拮抗各种疫霉菌(Phytophthora，并防止大豆幼苗被大豆疫霉菌(P. sojae)感染。由FZB42产生的抗生素，即以前已知的具有抗菌效果的杆菌溶素(bacilysin)，是对疫霉菌(Phytophthora)，并防止大豆幼苗被大豆疫霉菌(P. sojae)的抑制作用的原因。我们进一步表明，一些疫霉菌(Phytophthora)，并防止大豆幼苗被大豆疫霉菌(P. sojae)基因和途径可能成为未来生物防治研究的目标。因此，我们的数据为开发防治大豆根腐病和其他由疫霉引起的植物病害的新工具提供了依据。

结果

贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 可有效抑制大豆疫霉和其他疫霉菌的生长

首先在琼脂平板上测试了贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 对大豆疫霉菌(P. sojae)生长的影响。大豆疫霉菌(P. sojae) 生长在 V8 培养基琼脂上，而 FZB42 生长在被牛津杯限制的 Landy 培养基琼脂中，其底部与 V8 琼脂融合(图 1a)。通过这种方式，两种微生物得到了不同的培养基的支持。 此外，FZB42 的生长由牛津杯控制，因此其菌落形状和大小不会影响抑菌圈的测量以进行定量比较。结果表明，对照中大豆菌丝在 7 天内到达板边(~ 90 mm)，而在处理中接种 FZB42 后 2-3 天，其生长速度下降。 在接下来的几天里，大豆疫霉菌(P. sojae) 菌落的大小没有变化，平均直径保持在约 34 毫米。这表明FZB42可以产生抑制大豆疫霉菌(P. sojae) 生长的扩散代谢物。 统计分析表明，由于 FZB42 的存在，平板中大豆疫霉菌(P. sojae) 的平均菌落大小可以减少 66.8%(图 1b)。

图1 贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42)在接种7天后对不同疫霉菌生长的抑制作用

a 疫霉的生长从板的中心开始，而 贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 的生长限制在牛津杯中，其底部与疫霉的固体培养基相连，允许两种培养基接触。 将无菌培养基添加到牛津杯中作为对照(+培养基)，而将 FZB42 接种在牛津杯中作为处理；

b 贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) (n=3) 对不同疫霉属物种的抑制作用。**：p* <0.001

为了确定贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42)
的抑制作用是否可以推广，我们以与上述相同的方式测试了其他疫霉属物种，包括棕榈疫霉菌(P. palmivora)、甜瓜疫霉菌(P. melonis)、辣椒疫霉(P. capsici)、荔枝疫霉(P. litchi)和马铃薯晚疫病菌(P. infestans)。在对照组中，所有致病菌株都长满了琼脂培养皿的整个表面，而在 FZB42 存在下它们的菌落明显更小(图 1a)。FZB42明显降低了疫霉菌株的生长速度。 接种后两天，棕榈疫霉菌(P. palmivora) 和 马铃薯晚疫病菌(P. infestans) 的生长几乎停止。马铃薯晚疫病菌(P. infestans) 是受 FZB42 影响最大的物种，15 天后平均菌落大小为 11.30 mm，对应抑制率为 93.7%，其次是 棕榈疫霉菌(P. palmivora)，抑制率为 77.3%（图 1b）。从结果中，我们得出结论，贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 不仅可以抑制大豆疫霉菌(P. sojae) 的生长，还可以抑制其他疫霉属物种的生长。

FZB42对大豆疫霉菌(P. sojae) 的抑制作用依赖于杆菌溶素

贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 可以产生超过 10 种抗菌化合物，这可能是其对大豆疫霉菌(P. sojae)的抑制作用的原因。为了查明是何种化合物，我们使用上述方法测试了 10 个在这些化合物合成中存在缺陷的突变体(表1)的抑制作用。结果显示，八种突变体(AK1、AK2、CH1、CH3、CH6、CH7、CH8 和 CH12)表现出与野生型相当的抑制作用（图2）。值得注意的是，sfp 突变菌株 CH3 不能合成任何聚酮化合物和脂肽抗生素，但仍然能够抑制大豆疫霉菌(P. sojae) 的生长。相比之下，RS6和RS31都不能合成脂肽、聚酮化合物和杆菌溶素，没有表现出任何抑制作用。菌株RS6是通过敲除CH3的bacA(用于杆菌溶素(bacilysin)生物合成蛋白BacA)构建的，而RS31是通过敲除RS6的pznC(植物唑菌素合成所需的)获得的。由于 CH3 抑制了大豆疫霉菌(P. sojae)的生长，但 RS6 和 RS31 没有，我们得出结论，RS6 和 RS31 中都不存在的抗生素杆菌溶素(bacilysin)是抑制大豆疫霉菌(P. sojae)生长的活性化合物。 为了证实这一点，我们从 CH3 中制备了 HPLC 纯化的杆菌溶素(bacilysin)，结果表明杆菌溶素(bacilysin)确实可以抑制大豆疫霉菌(P. sojae)(图3)。

表1 使用的细菌和卵菌菌株和 PCR 引物

图2 贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42)不同突变体对大豆疫霉菌(P. sojae)P6497的抑制作用

(a-i)表示 P. sojae 受到攻击时的菌落大小和(j)的统计量。(a) PA medium (CK), (b) AK1 (∆ bmyA), (c) AK2 (∆ fenA), (d) CH1 (∆ srfAA), (e) CH2 (∆fenA and srfAA ), (f) CH3 (∆ sfp), (g) CH6 (∆ bae), (h) CH7 (∆ mln), (i) CH8 (∆ dfn), (j) CH12 (∆ mln and dfn), (k) RS6 (∆ sfp and bac), and (l) RS31 (∆ RBAM_007460).  在面板 j 中，上面带有不同字母(a 或 b)的平均值存在显着差异(p <0.001)。

图3 制备的杆菌溶素的 HPLC-MS 分析及其对大豆假单胞菌的拮抗活性

a 由 CH3 制备的杆菌溶素的 HPLC 分析。杆菌溶素的保留时间为 4.75 分钟。 杆菌溶素的结构显示在杆菌溶素峰的左侧；

b 杆菌溶素的质谱分析及其对大豆假单胞菌的拮抗作用。 在平板上，将 30 μl 杆菌溶素溶液 (200 μg/ml) 填充到大豆疫霉菌(P. sojae)假单胞菌菌落左侧和右侧的孔中，同时将无菌纯水填充到大豆疫霉菌(P. sojae)假单胞菌菌落上方和下方的孔中。

显微镜观察显示，杆菌溶素(bacilysin)可以破坏大豆疫霉菌(P. sojae)菌丝

为了理解杆菌溶素抑制大豆大豆菌生长的机制，我们首先比较了用两种突变体 CH3 (Δsfp) 和 RS6 (Δsfp 和 Δbac) 的上清液处理的大豆大豆菌丝的形态。虽然在 RS6 上清液中浸泡 2 小时的菌丝看起来无色、透明和光滑，类似于用 PA 培养基处理的菌丝(图4a和b)，但用 CH3 上清液处理 2 小时的菌丝被伊文思蓝染色不均匀地染成蓝色(图 4c)。伊文思蓝能够穿透破裂或不稳定的膜。这一结果表明，杆菌溶素(bacilysin)可导致大豆疫霉菌(P. sojae)菌菌丝死亡，从而使伊文思蓝通过受损的膜进入其细胞。

图4 通过光学显微镜 、发射电子显微镜和扫描电子显微镜观察到的含有杆菌溶素的上清液对大豆疫霉菌(P. sojae)显微形态的影响

通过光学显微镜 (a-c)、发射电子显微镜 (d-j) 和扫描电子显微镜 (k-p) 观察到的含有杆菌溶素的上清液对P. sojae显微形态的影响。

用 PA 培养基 (CK) (a, d, h, k)、RS6 上清液 (b, e, i, l) 和 CH3 上清液 (c, f, j, m-p) 处理大豆疫霉菌(P. sojae)菌丝体 2 小时。

扫描电子显微镜显示，用 PA 培养基处理的大豆疫霉菌(P. sojae) 菌丝(图4d和g)和来自杆菌溶素(bacilysin)缺陷型 RS6 的上清液(图4e和h)保持光滑和健康。然而，在用含有杆菌溶素(bacilysin)的 CH3 上清液处理后，几乎没有观察到完整的菌丝。 相反，大多数菌丝显示出塌陷、凹陷或扭曲的表面(图4f和i)。 在 2400 倍的放大倍数下，可以清楚地观察到破碎的菌丝失去细胞内容物(图4f和i)。

透射电子显微镜显示，用 PA 培养基(图 4j)和 RS6 上清液(图 4k)处理后，大豆疫霉菌(P. sojae)的细胞壁和细胞器看起来完好无损。然而，在用 CH3 上清液处理后，观察到破碎的细胞壁(图 4m和n)。由于细胞破裂导致的细胞内容物外渗应该是 SEM 显示的塌陷结构的原因。 值得注意的是，在一些完整的细胞内，出现了具有均匀内容的大液泡，但细胞器几乎消失了(图4l和o)，可能是由于细胞内容物的降解。

扫描电镜和透射电镜结果均显示大豆菌丝的细胞结构严重受损，这可以解释它们的死亡状态，如光学显微镜所示。基于这些显微观察，我们提出杆菌溶素(bacilysin)能够损大豆疫霉菌(P. sojae)菌丝，从而导致其死亡。

杆菌溶素(bacilysin) 保护大豆芽免受大豆疫霉菌(P. sojae)的感染

将大豆芽孢杆菌 P6497 游动孢子接种到大豆芽（大豆幼苗下胚轴）的表面上，观察 36 小时内的病斑形成情况。 对照组用无菌PA培养基或经过滤的RS6上清液预处理的芽苗在接种36小时后出现明显的褐色病斑(图5a和b)。相比之下，用过滤的 CH3 上清液预处理的豆芽在更小的区域内仅显示出轻微的黄色(图5c)。 统计计算显示，对照组(PA 和 RS6)的病变大小显着大于(p < 0.01)用含有 CH3 上清液的杆菌溶素(bacilysin)处理的组(图 5j)。

图5 含有杆菌溶素的上清液对大豆芽孢杆菌感染病斑形成的影响

芽苗在用大豆假单胞菌感染之前用 PA 培养基(a、d、g)、RS6 上清液(b、e、h)和 CH3 上清液(c、f、i)处理。代表性图像是在感染后 36 小时 (a-c)、72 小时 (d-f) 和 7 天 (g-i) 拍摄的。
箭头表示大豆大豆游动孢子接种的位置。 (j) 含有杆菌溶素的上清液对大豆芽孢杆菌感染的大豆芽病斑形成的抑制作用统计(n=5)。 ：p < 0.05，**：p < 0.01，**：p <0.001。

72小时后，用PA或RS6预处理的大豆芽中的病斑增加并变得更加变色(图5d和e)。 相比之下，用CH3预处理的芽苗上的病斑没有明显变化，仍然局限在原来的区域。用 CH3 处理的芽看起来健康而洁白，并继续生长，子叶略微拉伸，并带有数十个新形成的须根(图5f)。 定量分析表明，用 CH3 处理的芽的病变大小明显小于用 PA 或 RS6 处理的(p < 0.01)(图5j)

到第7天，用PA或RS6预处理的芽根变成深棕色或完全黑色，其子叶被部分感染(图5g和h)。 相比之下，CH3 组的芽健康，有大量新的侧根。原始病变区域开始消退，表明感染已治愈(图5i)。 综合所有结果，我们得出结论，含有杆菌溶素(bacilysin)的FZB42培养物可以有效保护大豆芽免受大豆芽孢杆菌的感染。

当 FZB42 存在时大豆疫霉菌(P. sojae) 的转录组受到影响

由于大豆疫霉菌(P. sojae)和 FZB42 在土壤中的相互作用主要发生在固体表面上，我们设计了一种基于筛分的装置来模拟这种情况。在该装置中，将大豆疫霉菌(P. sojae)菌在 V8 培养基琼脂一侧预培养 5 天，直径达到 60-70 mm，然后将 FZB42 铺在landy培养基琼脂的另一侧。两侧用 500 目筛子隔开，允许交换代谢物。 该设备使我们能够在更真实和均匀的条件下研究两种微生物的相互作用。接种 FZB42 后，大豆大豆菌的生长在 48 小时内几乎停止，而没有 FZB42 的对照中的大豆大豆菌菌丝继续生长到盒子的边缘。处理组和对照组之间的大豆疫霉菌(P. sojae)形态没有明显差异，这表明 FZB42 抑制大豆疫霉菌(P. sojae)的生长而不是改变发育反应，很可能是通过产生可以扩散穿过琼脂层和筛子的代谢物。

分离在上述装置上生长的三种处理(PS42_1、PS42_2 和 PS42_3)和三种对照(PSCK_1、PSCK_2 和 PSCK_3)的大豆疫霉菌(P. sojae)总 RNA 用于 Illumina HiSeq 测序。每组中的干净读取(通过过滤读取)的数量从 5,072,091,304 到 8,893,846,008 不等， GC 含量在 32.9 %和 49.2% 之间。分析表明，所有测序数据质量良好(Q20 ≥ 93%)。读数被映射到 JGI 数据库中的 大豆疫霉菌(P. sojae) P6497 的基因组。 在 PSCK_1 样品中检测到细菌基因，表明可能存在细菌污染，因此被排除在分析之外。

下调基因(2,691)的数量是上调基因(642)的三倍以上，表明 FZB42 基本上抑制了P. sojae基因的表达。差异表达基因(DEGs)的基因本体(GO)功能注释显示，1840个基因，占总数的55.19%，参与了生物过程(BPs)； 1,257 (37.7%) 个 DEGs 涉及细胞成分 (CCs)； 并且只有 237 个(7.11%)基因参与分子功能(MF)(图 6a)。有趣的是，在 BP
组内的发育过程、多生物过程、繁殖和信号传导的亚组中只有下调基因，但没有上调基因(图6a)，这表明当面对 FZB42 时这些过程受到抑制。

图6 受贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 攻击时大豆疫霉菌(P. sojae) DEGs 的 GO 注释和富集分析

a 当受到贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 攻击时，大豆疫霉菌(P. sojae) DEG 的 GO 注释分析。 顶部 x 轴表示注释到 GO 术语的基因数量占 GO 注释基因总数的百分比，而底部 x 轴表示注释到 GO 术语的基因数量；

b 维恩图显示了四个最丰富的 GO 术语(生长、细胞大分子生物合成过程、质膜和胞质核糖体)中 DEG 数量之间的关系；

c 丰富了 DEG 的 KEGG 途径。 点的大小与 DEG 的数量成正比。从蓝色到红色的色谱代表不同的 p 值。

GO富集分析显示，BP和CC组分别显着富集了162和109个DEG。 生长 (GO:0040007) 和细胞大分子生物合成过程 (GO:0034645) 是 BP 中两个最丰富的亚组，而质膜 (GO:0005886) 和胞质核糖体 (GO:0022626) 是 CC 中两个最丰富的亚组。结果表明FZB42可以显着影响大豆疫霉菌(P. sojae)的生理功能和代谢。四个亚组中有很大一部分基因重叠，其中大部分是核糖体蛋白或线粒体核糖体蛋白(图6b)，例如小亚基核糖体蛋白 S4、S12 和 S13 和大亚基 核糖体蛋白 L3、L5 和 L6。
该结果意味着核糖体蛋白以及因此的翻译过程是被 FZB42 抑制的重要靶标。

此外，我们对 DEG 进行了 KEGG 通路富集分析(图 6c)。 这些基因被映射到 267 个 KEGG 途径，但当以 p < 0.05 作为阈值时，仅在 mRNA 监测途径中显着富集(图6c)。mRNA监测通路是一种质量控制机制，检测并降解异常mRNA，以保证mRNA分子的保真度和质量。 更具体地说，参与新合成的前 mRNA 的 3’ 末端加工机制的切割和多聚腺苷酸化特异性因子 (CPSF) 的基因在表达上发生了显着改变。 mRNA 监测途径中许多基因的下调意味着大豆大豆 mRNA 合成的质量控制机制可能存在功能障碍。

qPCR验证了大豆疫霉菌(P. sojae)致病相关基因的下调

为了检查转录组结果的可靠性，我们选择了九个感兴趣的基因进行 qPCR 验证。 这些基因的表达或上调与大豆疫霉菌(P. sojae)假单胞菌或其他霉菌引起的致病过程有关(表2)。贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 降低了这些基因的表达(图7)，表明FZB42 可以拮抗大豆疫霉菌(P. sojae)菌的致病过程。 PL 在病原真菌入侵植物中起重要作用。值得注意的是，PL(ps_517348)基因的抑制在所有差异表达基因中最高(倍数变化> 60)。此外，还有另外四个 PL 基因和四个推定的 PL 基因被下调。 如此多的 PL 或推定的 PL 基因的强烈下调表明 FZB42 可能能够直接阻碍大豆疫霉菌(P. sojae)对宿主植物的入侵，而所有致病性相关基因都得到证实，表明在 FZB42 处理后大豆疫霉菌(P. sojae)的致病性水平降低。

表2 从转录组数据中选择差异表达的目的基因用于 qPCR 验证

图7 转录组测序检测到的大豆疫霉菌(P. sojae)的 qPCR 验证

ps_517348为果胶酸裂解酶，ps_261658为囊泡GABA转运蛋白(VGAT)，ps_342517为葡聚糖1,3-β-葡萄糖苷酶，ps_332170为糖苷水解酶家族5蛋白(GHF5)，ps_560589为CMGC/MAPK蛋白激酶(CMGC/MAPK)，ps_566381 为热休克转录因子(HSF)，ps_520549 钙调蛋白，ps_545326 为液泡钙离子转运蛋白，ps_344539 为 MFS 转运蛋白。 肌动蛋白基因用作内部对照。

讨论

由于能够产生耐热的内生孢子和广谱的抗菌次级代谢物，贝莱斯芽孢杆菌已成为商业化最成功的生物防治剂的细菌物种。然而，它对疫霉的作用仍然很大程度上未知。在本研究中，我们使用了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) 的代表性菌株 FZB42 来研究其与疫霉菌的关系。我们的研究结果表明，FZB42 对大豆疫霉菌(P. sojae) 具有拮抗活性，并且该活性主要由二肽抗生素杆菌溶素(bacilysin)介导。杆菌溶素(bacilysin)会破坏大豆疫霉菌(P. sojae)菌丝体，影响其细胞完整性并导致菌丝死亡。 FZB42
抑制大量疫霉基因的表达，其中许多基因与植物感染有关。FZB42的应用可以保护豆芽免受疫霉菌的感染。 我们还表明，FZB42 可以在实验室中有效抑制不同种类疫霉的生长，这表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株对疫霉病具有良好的生物防治潜力。

迄今为止，已知 FZB42 能够产生 13 种抗菌化合物，包括三种聚酮化合物(杆菌素(bacilleane), 艰难梭菌素(difficidin),和大环乳素 (macrolactin))、几种脂肽(表面素(surfactin), 杆菌霉素 D(bacilomycin D),和 丰原素(fengycin))和细菌素(淀粉环素(amylocyclicin)和植物唑菌素(plantazolicin))。这些化合物可以拮抗从真菌到细菌的多种植物病原体的生长。杆菌溶素(Bacilysin)
是由 FZB42 生产的另一种抗生素，是一种相当简单的二肽，仅由一种L-丙氨酸和一种称为抗辣椒素的不寻常氨基酸组成。在以前的研究中，发现杆菌溶素(Bacilysin)可以抑制各种细菌，因为它抑制葡糖胺合成酶，从而干扰细菌肽聚糖的生物合成。与以甲壳素为主要细胞壁成分的真真菌相比，卵菌的细胞壁主要由葡聚糖组成，例如β-(1→3)-d-葡聚糖、β-(1→6)-d-葡聚糖和纤维素； 卵菌的细胞壁中仅存在少量几丁质。杆菌溶素(Bacilysin)抑制疫霉菌生长的原因可能是因为它使用与干扰细菌肽聚糖生物合成类似的机制来干扰葡聚糖的生物合成。最近显示，在 22 种芽孢杆菌中。PCR检杆菌溶素(Bacilysin)相关基因阳性菌株，14株对致病疫霉非常有效；也就是说，杆菌溶素(Bacilysin)生物合成基因与芽孢杆菌菌株对致病疫霉的强烈拮抗作用相关。这显然与这里的结果一致。本报告中进行的温室试验和田间试验表明，他们的芽孢杆菌菌株显着降低了晚疫病的严重程度，证明了产生芽孢杆菌蛋白酶的细菌在保护植物免受卵菌病原体侵害方面的前景广阔。

尽管我们显示了杆菌溶素(Bacilysin)对P. sojae 的抑制作用，但我们无法排除抑制疫霉菌感染的其他机制。例如，大豆疫霉菌(P. sojae) 转录组数据显示，超过 3,000 个基因在 FZB42 的转录中发生了改变，这可能并不都与杆菌溶素(Bacilysin)有关。

在转录组数据中发现的调控基因中，最具吸引力的是果胶酸裂解酶。果胶是植物细胞壁中所含的基本结构多糖。在感染植物的过程中，疫霉菌分泌果胶裂解酶以降解植物细胞壁并协助自身进入植物细胞。共有 8 个果胶酸裂合酶基因的下调具有高倍数变化表明 FZB42的保护作用的另一个机制，即它可能直接降低大豆疫霉菌(P. sojae)对寄主植物的致病性。类似地，糖苷水解酶家族 5 蛋白 (GHF5) 的 5 个基因被下调，这些基因是疫霉细胞壁的重要成分并参与植物感染。目前尚不清楚杆菌溶素是否参与该作用。

另外两个编码有丝分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 和 cAMP 依赖性蛋白激酶 (PKA) 的调节基因也值得注意。两种酶都在卵母细胞减数分裂途径和信号转导中发挥关键作用。 这两个基因的下调表明大豆大豆增殖的受损状态。 MAPK 在所有真核生物中高度保守。大豆疫霉菌(P. sojae) 中有 14 个 MAPK 基因，其中 PsSAK1 参与调节大豆疫霉菌(P. sojae) 细胞完整性、游动孢子形成、菌丝生长和致病性。 一般而言，大豆疫霉的 MAPKs 在其生长发育和感染周期中发挥着重要作用 。PKA 也是一种高度保守的调节剂，其靶点涉及各种酶/蛋白质或转录调节剂以响应各种压力。 PKA亚基的丢失可导致烟曲霉的孢子存活率和菌丝延伸减少。

其他与大豆疫霉菌(P. sojae)致病性相关的调控基因包括热激因子 (HSF)、细胞壁蛋白 GP42、GABA 转运蛋白和 MFS 转运蛋白。HSF 普遍存在于动物、植物、真菌和其他生物体中，是响应各种压力(如热休克、氧化应激和化学刺激)的信号通路的最终组成部分。HSF1 可以调节热休克蛋白的表达并修复由外部压力引起的细胞内蛋白损伤。据报道，大豆大豆 PsHSF1在植物防御过程中参与了对活性氧施加的氧化应激的反应。大豆疫霉菌(P. sojae)细胞壁蛋白 GP42 是一种 Ca2+ 依赖性谷氨酰胺转氨酶 (TGase)。其 C 末端的短肽 (EPE-13)
高度保守，能够在植物中触发模式触发免疫 (PTI)，已被证明可激活欧芹和马铃薯的防御反应。 赖斯等人。提出使用 GP42 作为靶点来开发可以抑制卵菌生长并降低其致病性的新药剂。在这里，四个 GP42 基因的表达被 FZB42 下调 16 倍，表明一种或多种 FZB42 代谢物可以抑制 GP42 表达，这支持了干扰 GP42 表达是一个不错的选择的想法。

总之，上述基因表达的降低清楚地表明在贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 存在下大豆黄杆菌的致病性降低。连同 FZB42 可以抑制由于产生杆菌溶素(Bacilysin)而导致大豆黄杆菌生长的证据，本研究有利于使用贝莱斯芽孢杆菌 FZB42(Bacillus velezensis FZB42) 和其他能够产生杆菌溶素(Bacilysin)的芽孢杆菌菌株来生物防治由疫霉引起的大豆和其他植物的植物病害。然而，尽管本研究阐明了贝莱斯芽孢杆菌对疫霉菌抑制作用的主要机制，但仍有许多问题没有得到解答。 例如，根据转录组数据，我们怀疑bacilysin可能不是影响疫霉生长和致病性的唯一因素。 在这方面，我们才刚刚开始了解它们的相互作用和未来可能的应用。

第一作者

韩星闪，南京林业大学生物与环境学院微生物学硕士研究生；沈东霞，南京林业大学生物与环境学院微生物学硕士研究生。

通讯作者

樊奔，博士，教授，博士生导师  毕业于德国柏林洪堡大学生物系，主要从事微生物遗传学、“植物—微生物”分子互作、森林微生物资源开发等相关方向的研究；主持国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、江苏省高校自然科学研究重大项目等科研项目多项；获得粱希林业科学技术奖一等奖1项，发表SCI论文合计被引用1000余次；江苏省“333”工程培养对象，SCI二区期刊《Frontiers in Microbiology》编委。Frontiers in Microbiology杂志编委，Asian PGPR Society of Sustainable Agriculture终身会员，中国林学会会员，中国微生物学会员。

Reference

Xingshan Han, Dongxia Shen, Qin Xiong, Beihua Bao, Wenbo Zhang, Tingting Dai, Yinjuan Zhao,Rainer Borriss, Ben Fan, Xiang‑dong Li. The plant beneficial rhizobacterium Bacillus velezensis FZB42 controls the soybean pathogen Phytophthora sojae due to bacilysin production. Applied and Environmental Microbiology (2021). https://doi.org/10.1128/AEM.01601-21