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氢气对蓝光诱导视网膜损伤的保护作用 精选

已有 2656 次阅读 2024-4-22 19:59 |个人分类:氢气生物学|系统分类:科研笔记

随着电子设备的广泛使用,人类的眼睛越来越多地暴露于电子屏幕发出的蓝光之中。这种增加的接触量已与触发氧化应激、引发炎症反应以及诱导视网膜细胞凋亡相关联,从而增加了黄斑变性和视力丧失的风险。短波长光以其高光化学能量而特点,通常由屏幕发出,在430-480纳米的蓝光范围内。这一范围因其对固有感光神经节细胞(ipRGCs)的显著影响而被识别出来,这些细胞内含有黑视蛋白(OPN4),一种在大约480纳米光处有峰值吸收的光色素。黑视蛋白在调节昼夜节律、睡眠清醒、褪黑激素释放调节中发挥着至关重要的作用。IpRGCs作为视网膜内的传出神经元,对于向大脑传递信息起着关键作用,大约有74%的视网膜神经节细胞投射到视交叉上核(SCN)。作为一种G蛋白偶联受体,黑视蛋白主要通过Gq途径触发钙和DAG的释放。值得注意的是,ipRGC轴突缺乏髓鞘,并且富含线粒体,暴露于蓝光会诱导线粒体酶产生活性氧种,影响轴突运输和ipRGCs的生存。视网膜细胞中的线粒体不断为视网膜提供能量以进行光电转换。然而,这种能量供应往往不足,导致产生活性氧自由基(ROS)。随后,ROS诱导的细胞内氧化应激最终导致凋亡。

Effect of hydrogen‐ ich saline on melanopsin after acute blue light‐induced retinal damage in rats - Wang - Photochemistry and Photobiology - Wiley Online Library

氢气作为一种新兴的治疗方法已经出现,越来越多的证据支持其清除羟基自由基的能力,增强抗氧化酶活性,并在抑制炎症、调节代谢和预防各种疾病的凋亡方面发挥有益效果。Qi等人的研究成功地证明了通过使用氢盐水减轻了大鼠的光诱导视网膜损伤,证实了其在解决眼部光损伤方面的有效性。然而,我们仍需探索氢盐水对视网膜细胞功能的影响,以完全理解其保护效应。黑视蛋白是一种存在于ipRGCs中的对蓝光敏感的蛋白质,对视网膜健康和功能至关重要,特别是在调节昼夜节律和响应环境光变化方面。因此,找出氢盐水是否影响OPN4的表达和活性将为全面理解氢盐水的视网膜保护机制提供线索。

急性蓝光暴露会对视网膜造成损害,导致视网膜细胞的细胞膜破裂和线粒体肿胀,这可以在电子显微镜下观察到。光激活的黑视蛋白会产生活性氧种,并打开细胞膜中的瞬态光感受器电位钙通道,导致钙离子流入,进而在线粒体中产生更多的活性氧种。因此,本研究采用了一种光诱导视网膜损伤的大鼠模型,来研究氢盐水处理后黑视蛋白的表达情况,并评估氢盐水对视网膜神经节细胞的保护效果。

材料与方法

 

动物和实验设计

健康的8周龄雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠在实验开始前被安置在12/12小时的光暗周期中,可以随意进食和饮水。实验方案获得了南开大学(中国天津)动物护理和伦理委员会的批准,所有与动物相关的程序均遵循了ARVO关于眼科和视觉研究中动物使用的声明。

 

在实验中,大鼠被安置在一个特制的笼子里,笼子上方30厘米处装有LED灯。笼子用透明玻璃隔开,以防止聚集和影响光照暴露。光照从上午8:00开始,持续48小时,特别关注蓝光。SD大鼠在立即(0D)、第3天(3D)、第7天(7D)和第14天(14D)通过过量麻醉剂处死(1A)。安乐死程序在晚上8:00至9:00之间进行,以最小化昼夜节律的影响。为了探索氢盐水的潜在效果,大鼠被随机分为三组(1B):(1) 对照组:没有任何干预的正常组(n=6);(2) BL组:暴露于48小时蓝光后不进行任何处理(n=22);以及(3) BL+HRS组:暴露于48小时蓝光后接受氢盐水治疗(n=19)。

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1,实验分组和黑视蛋白阳性RGC计数方法的图解。(A)实验根据是否应用氢盐水治疗分为BL组和BL+HRS组。(B)实验中大鼠执行的时间线。(C)在视网膜上计数黑视蛋白阳性RGCs的模板。在视网膜的每个象限,随机在一个方形区域内拍摄1张片,该区域位于连接边缘到视盘的线的1/6、1/2和5/6处,每个视网膜总共拍摄12张片。BL,蓝光暴露;HRS,富氢盐水;I,下方;N,鼻侧;O,视盘中心;S,上方;T,颞侧。

 

氢盐水的准备和给药

为了准备每次腹腔注射,纯化氢气通过氢气机输送到盐水中,然后密封在铝制容器中,内部压力为0.4 MPa。得到的生理浓度为每100毫升盐水中含有1.73毫升氢气,平均浓度为0.86 mmol/L。使用氢气浓度计(IDEXX,中国)进行氢盐水浓度测试,以确保浓度一致为1.4 ppm。大鼠每天两次接受氢盐水或盐水的腹腔注射,每次给药间隔12小时。这一注射方案在48小时蓝光暴露期结束后立即开始。

 

光照暴露方案

在生命的最初两个月里,大鼠被置于12/12小时的光暗周期中,以500 lx的白光照明。实验阶段通过在上午8:00开始诱导蓝光(450 nm-480 nm, 2000 lx, 徐州艾佳电子科技有限公司, 中国),连续照明48小时。光照结束后,大鼠立即返回到初始的光环境中。

 

蛋白质印迹

为了避免昼夜节律对黑视蛋白含量变化的潜在影响,每个实验组的大鼠都在一致的时间点被处死,特别是在晚上8:00至9:00之间。小心地移除视网膜并放入Eppendorf(EP)管中,加入170 μL的RIPA裂解液和2 μL的蛋白酶抑制剂进行蛋白质提取。随后采用超声裂解提取蛋白质,裂解物在4°C下离心15分钟。使用BCA蛋白质测定试剂盒确定蛋白质浓度,然后进行电泳并将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。

然后将膜在5%脱脂奶粉中孵育2小时,接着在一抗(黑视蛋白,稀释1:1000,兔抗大鼠多克隆抗体,Abmart, TD13615;GAPDH,稀释1:2000,兔抗大鼠多克隆抗体,Abmart, P60037)中浸泡过夜(4°C)。PBS漂洗三次,每次10分钟后,膜与二抗(辣根过氧化物酶标记的,稀释1:10000,山羊抗兔IgG,Proteintech, RGAR001)孵育2小时。PBS再次洗涤三次后,使用化学发光试剂(EMD, Millipore)进行显色。使用ImageJ进行条带分析。

 

实时定量PCR

根据RNA提取试剂盒(EZBioscience, USA)的说明书,从SD大鼠视网膜中提取总RNA,并使用反转录试剂盒(ABM, Cat.G592)进行cDNA合成。实时定量PCR体系包括BlasTaq 2 × qPCR MasterMix(ABM, Cat.G891)10 μL、正向引物1μL、反向引物1μL、cDNA 1μL和无核酸酶H2O 7μL。扩增条件设定如下:95°C初始3分钟酶激活,然后40个循环,每个循环95°C变性15秒,60°C退火和延伸60秒,以及72°C额外延伸60秒。

以GAPDH作为内参,使用2−ΔΔCt方法分析目标基因的相对表达量:ΔΔCt =(实验组目标基因Ct值 - 实验组GAPDH Ct值)-(对照组目标基因Ct值 - 对照组GAPDH Ct值)。引物序列如下:GAPDH(正向,5′-CCGCATCTTCTTGTGCAGTG-3′;反向,5′-ACCAGCTTCCCATTCTCAGC-3′)和OPN4(正向,5′-CTACCCATCGCTCCACACTG-3′;反向,5′-GTCTGTCCAGCCCACTTCAC-3′)。

 

形诱发电生理检查(pERG)程序

使用商业可用系统(ROLAND, Germany)进行PERG检查,评估ipRGCs的功能。记录前,让大鼠进行10分钟的暗适应。SD大鼠麻醉后,给予眼药水保持湿润。将一根导线弯成环形固定在角膜边缘,不遮挡视野。大鼠的尾部连接接地针电极,参考电极置于测量侧的耳朵。每只眼睛分别测试。

测试期间,动物放置在加热垫上,被测眼睛距离监视器20厘米,另一只眼睛完全遮盖。视觉刺激采用以下参数呈现的翻转条形:空间频率为0.05 cyc/deg,对比度为97%,时间频率为1 Hz。翻转条形垂直于视觉轴。测试完成后,将双眼数据平均得出最终结果。

免疫荧光染色

各组眼球在收集后立即浸入4% Paraformaldehyde Tissue Fixative(Phygene Scientific, PH1848)中固定6小时,固定后的视网膜切成四叶草形状(1C),然后在BSA中阻断2小时。剪切的视网膜放入一抗(OPN4,稀释1:200,Abcam, 19,383)过夜。之后使用PBS漂洗三次,每次10分钟,再用二抗(Abcam, ab150075)。视网膜分为四个象限(1C):颞上、颞下、鼻上和鼻下。在每个象限的视网膜上,随机在一个方形区域中拍摄像,该区域位于连接边缘和视盘的线上的1/6、1/2和5/6处,每个视网膜总共拍摄12张片。使用ImageJ软件对黑视蛋白阳性视网膜神经节细胞(mRGCs)进行计数。

统计分析

所有数据均以均值±标准差(mean ± SD)表示。统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)来评估不同组之间的差异。随后,进行Bonferroni事后检验以进行特定组之间的成对比较。选择p < 0.05作为显著性水平的标准,以确定分析数据中存在统计学上的显著差异。

 

结果

急性蓝光导致视网膜功能下降

通过pERG评估了急性蓝光暴露对视网膜功能的影响。在暴露前,平均pERG振幅为4.238 ± 0.6427 μV(均值±标准差),平均pERG潜伏期为62.75 ± 3.972 ms。然而,急性蓝光暴露后,与对照组相比,pERG波形显示出振幅明显减小和潜伏期延迟(2A,B)。这些发现证明,急性蓝光暴露后视网膜功能受损。

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图2,(A) 显示了正常大鼠代表性的pERG波形。(B) 暴露于蓝光的大鼠的代表性pERG。(C) 黑视蛋白的代表性Western blot。(D) 蓝光暴露和氢盐水治疗后的蛋白质表达。各组测试的大鼠的pERG振幅(D)和潜伏期(E)。(F) 黑视蛋白的mRNA表达。(G) 每个区域的mRGCs数量。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001。

 

蓝光暴露导致黑视蛋白数量和表达减少

在急性蓝光暴露结束时,通过Western blot观察到黑视蛋白表达显著减少(2C),同时黑视蛋白mRNA表达也显著下降(2F,p < 0.001)。此外,与对照组相比,mRGC的数量显著减少(2G,p < 0.001;3A,C)。在20倍显微镜下详细检查发现,黑视蛋白阳性过程的树突网络显著缩短并广泛不可见(3B,D)。这些发现共同表明,急性蓝光暴露对黑视蛋白表达和mRGC形态有显著影响。

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图3,SD大鼠中的黑视蛋白阳性RGCs受到蓝光暴露的影响。对照组放置在正常的12/12小时白光-暗周期环境中。BL组在48小时的急性蓝光暴露的光环境中。黑视蛋白存在于ipRGC细胞体和近端树突中。对照组的黑视蛋白阳性RGC表达(A) 10倍镜下。和(C) 20倍镜下。经过48小时的急性蓝光暴露后,黑视蛋白阳性细胞数量减少(B) 10倍镜下。并且外层分层树突中的黑视蛋白免疫反应减弱(D) 20倍镜下。绿色荧光显示黑视蛋白细胞的染色。

 

蓝光暴露损伤后黑视蛋白的自我恢复

在急性暴露于蓝光后,黑视蛋白在mRNA、蛋白质和mRGC数量上都急剧减少。未经治疗,黑视蛋白mRNA表达随时间呈上升趋势,但在3D、7D、14D和0D之间没有观察到统计学差异(2F;p > 0.05)。在分子水平上也观察到了类似的时间模式,蓝光暴露后黑视蛋白表达逐渐增加,表明正在进行功能恢复(2C)。

 

免疫荧光分析显示,随着时间的推移,视网膜中mRGCs数量增加,7D和14D时显著增加,尽管与0D没有统计学差异(2G)。在10倍显微镜下检查细胞形态表明,0D后mRGC树突逐渐延长,3D时近端树突免疫反应增强(4A),直到14D时远端树突免疫反应增强(4C),并伴随着阳性mRGCs数量的增加。

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图4,不同时间和治疗组在48小时蓝光暴露后黑视蛋白阳性RGCs的变化。黑视蛋白主要存在于ipRGC细胞体和近端树突中。急性蓝光暴露后,0D至3D间黑视蛋白阳性RGCs的数量没有显著差异(A),而在7D(B)和14D(C)时显著增加。在氢盐水治疗组中,第3天(D)、第7天(E)和第14天(F)远端分层树突中的黑视蛋白免疫反应增强,且黑视蛋白阳性RGCs数量增加。20倍镜下。绿色荧光显示黑视蛋白的染色。

 

在功能性方面,随着恢复时间的延长,pERG波形逐渐恢复正常。与0D相比,振幅有增加的趋势,潜伏期缩短,这表明ipRGC功能的恢复正朝着积极的轨迹发展(2D,E)。

 

氢盐水促进急性蓝光损伤后视网膜ipRGC的恢复

为了探索氢盐水对光损伤后黑视蛋白恢复的影响,我们评估了黑视蛋白mRNA和蛋白质表达。在腹腔注射氢盐水的第三天(3DH),黑视蛋白mRNA表达呈上升趋势,尽管与3D组无统计学差异(2F)。在蛋白质水平和数量上观察到了类似的模式(2C,G)。在氢盐水治疗的第七天(7DH),mRNA表达显著增加(2F),蛋白质表达活性增强(2C),视网膜mRGCs数量显著增加(2G),与7D和0D相比具有统计学意义(p < 0.001)。然而,与对照组相比,在蛋白质水平和数量上仍有差异(p < 0.001)。在治疗的第二周(14DH),mRGC数量继续恢复,并与14D有统计学差异(p < 0.001),但与对照组无显著差异(p > 0.05)。此时,远端分层树突中的黑视蛋白免疫反应增强(4F)。

 

经过14天的氢盐水治疗,pERG基本恢复到原始状态(2D,E)。然而,直到14天,氢盐水治疗组与未治疗组之间没有显著差异。这些观察结果表明,氢盐水给药加速了视网膜ipRGCs的恢复,并有助于在急性蓝光损伤后恢复黑视蛋白的表达和功能。

 

讨论

由于智能手机、电脑和电视等电子设备的广泛使用,蓝光在我们日常生活中无处不在。它不仅以其短波长(400至500纳米)为特征,而且与其他可见光相比具有更高的能量。尽管蓝光的普遍存在是现代生活不可避免的一个方面,但由于其对眼睛健康的潜在影响,它也带来了越来越多的关注。光毒性,即某些物质在光照下对生物体产生的有害影响,是在考虑蓝光暴露时的一个重要考虑因素。新兴证据表明,长时间暴露于低强度蓝光不仅会导致眼睛不适,更严重的是,它可能导致视网膜的结构和功能损害,进而影响眼睛的视觉功能。蓝光诱导的磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)扭曲以及随后的氧化损伤,这种效应不仅限于感光细胞,还影响到非感光细胞,导致视网膜细胞形态的改变甚至凋亡。一些研究还发现会损害内层视网膜的神经元,导致细胞数量减少和表达降低,视网膜结构改变和功能障碍。蓝光影响视网膜细胞的复杂机制引发了关于我们现代以屏幕为中心的生活方式长期后果的问题。在我们导航数字主导的时代,深入了解蓝光暴露与视网膜健康之间的复杂相互作用变得至关重要。探索保护措施和干预措施以减轻潜在伤害是一个值得持续研究的领域。平衡技术的好处与保护眼睛健康的考虑成为电子设备用户和设计者的一个关键考虑因素。

黑视蛋白是一种主要位于ipRGCs上的短波长敏感光色素。其多方面的作用包括调节昼夜节律、睡眠清醒调控、褪黑素释放、以及对光线的瞳孔反射。然而,视网膜的急性蓝光暴露可能导致黑视蛋白受损,从而影响ipRGCs的正常功能。pERG作为视网膜功能障碍的指标,其中振幅和潜伏期的变化与神经元的数量和活力相关。神经元健康或数量的减少表现为电信号的减弱。在我们的研究中,我们观察到48小时的蓝光暴露(0D)导致视网膜pERG减弱,同时伴随着黑视蛋白表达的显著降低和细胞数量的减少。这一结果可能是由于蓝光激活了黑视蛋白,导致活性氧种类的产生和过量自由基的释放,从而导致细胞结构的氧化损伤,并导致黑视蛋白的衰退。值得注意的是,在没有治疗的情况下,从3D到14D,黑视蛋白基因的相对表达增加,达到与对照组统计上无法区分的水平(p > 0.05)。同时,蛋白质表达和细胞数量继续增加。这一现象与Natalia等人进行的实验发现一致,表明黑视蛋白具有自我恢复的能力。然而,尽管有这些可观察的趋势,14D的pERG测量表明黑视蛋白尚未完全恢复正常功能,并且与对照组相比仍有统计学差异。黑视蛋白恢复的复杂动态需要进一步调查,以阐明其弹性的潜在机制和对持续ipRGC功能的影响。

最近的研究表明,氢分子在治疗各种疾病方面具有潜在的治疗潜力,无论是在临床环境还是动物研究中。氢气展现出强大的抗氧化和抗炎特性,提供了一种多方面的方法来积极影响多种疾病。其作用机制包括调节细胞信号、减少氧化应激和抑制炎症反应。氢盐水是一种氢疗法,以其使用方便和高生物利用度而突出,允许氢分子快速循环并渗透到组织和器官中。在我们的研究中,我们观察到在蓝光暴露后进行氢盐水治疗后,黑视蛋白表达和功能恢复显著增强。在整个一周的治疗期间,所有指标与未治疗组相比都显著增加。通过7天的氢盐水治疗(7DH),基因和蛋白质表达水平显著上升,与0D状态呈现统计学差异。然而,功能恢复与对照组仍可区分。我们假设这种差异可能归因于ipRGCs最佳功能所需的复杂的细胞间相互作用和协调。随着治疗进入第二周(14DH),黑视蛋白的蛋白质和基因水平与未治疗组在14D的水平有统计学差异,但与对照组没有显著差异。这一观察表明,氢盐水治疗加速了黑视蛋白的恢复,促进了ipRGC功能进程和信号传导的正常化。氢疗法的潜力,如氢盐水所示,为旨在减轻蓝光暴露对视网膜健康的不良影响的干预措施开辟了新途径。

在我们的研究中,我们发现了蓝光暴露后mRGCs的显著形态变化。单位面积内mRGCs数量的减少、广泛的黑视蛋白阳性过程不可见的树突网络,以及外层分层树突中的黑视蛋白免疫反应性降低,这表明了mRGCs结构完整性受到了显著影响。这种现象可能是由于细胞质合成和运输过程的中断,这些过程对于黑视蛋白在细胞内的分布至关重要。细胞质中黑视蛋白表达的下调可能是急性蓝光暴露后蛋白质运输到树突的改变的结果。值得注意的是,在氢盐水治疗下,我们在7DH观察到mRGCs的显著增加,伴随着加速的树突生长和恢复。到了14DH,与正常组相似的密集的黑视蛋白阳性树突网络变得可见。先前的研究已经表明,氢盐水可以减轻光损伤引起的视网膜炎症、凋亡和氧化应激。我们假设,在高强度蓝光刺激下,黑视蛋白的激活触发了细胞内信号通路,导致细胞内钙离子增加和ROS的释放,造成细胞损伤。氢气分子反过来可能通过促进超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶等抗氧化酶系统的活性来增强细胞的抗氧化能力。此外,氢盐水可能抑制炎症因子的释放和炎症信号通路的激活,从而减少蓝光引起的细胞损伤。此外,急性蓝光暴露可能会导致视网膜内网状层的边界模糊和凋亡,这会影响神经节细胞树突的分布。氢盐水治疗加速了视网膜结构的恢复,黑视蛋白阳性过程的树突网络,并增加了外层分层树突中的黑视蛋白免疫反应性。

尽管这些发现很有希望,但这项研究并非没有局限性。首先,调查仅关注了氢盐水治疗的短期效果,潜在的长期效果及相关副作用尚未探索。未来的研究工作应包括对氢盐水治疗的扩展影响的更全面检查,以更好地了解其安全性。未来的实验应该包含对所有视网膜神经节细胞的标记,以提供氢盐水暴露对视网膜健康影响的全面视。此外,在急性蓝光暴露后观察到的pERG变化表明RGCs功能受损。需要注意的是,在啮齿类动物中,ipRGCs约占总RGCs的3%,对RGC功能的贡献很小。因此,pERG可能无法准确反映特定于ipRGCs的功能变化。随后的实验应采用更针对性的评估,专注于ipRGCs,以精确探索它们的功能和对各种刺激的反应。氢盐水对黑视蛋白功能和恢复的保护作用的确切机制尚未完全阐明,需要进一步调查。未来的研究应深入探讨涉及的分子和细胞途径,提供关于氢盐水治疗作用的更详细理解。

尽管存在这些限制,我们的发现表明氢盐水对黑视蛋白具有保护性和功能性恢复作用。这意味着氢盐水可能在与ipRGCs相关的疾病的管理中发挥作用,提供了一种新颖且有前景的治疗方式。随着我们前进,进行进一步研究以完善我们对氢盐水作用机制的理解及其在改善患有ipRGC相关疾病的患者的视力和视觉功能方面的潜在应用至关重要。

总之,氢盐水显示出对黑视蛋白的保护性和功能性恢复作用。这一有希望的结果表明,氢盐水可以被视为与ipRGCs相关疾病的潜在治疗方式,最终改善患者的视力和视觉功能。此外,未来的实验应该旨在精确探索ipRGCs的功能,以补充我们对它们在视网膜健康中的作用的理解。



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