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Patch clamping 读书笔记

已有 6114 次阅读 2011-5-12 09:32 |系统分类:科研笔记|关键词:学者

Patch Clamping: An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology by Areles Molleman.   阅读笔记
 

1. 1952年,Alan Hodgkin & Andrew Huxley利用voltage clamp技术研究Squid Giant Axon(枪乌贼巨轴突),提出了Hodgkin-Huxley模型用以解释该轴突中的动作电位产生及其传播机制,并因此获得了1963年的生理医学奖。该轴突尺寸巨大,直径通常在0.5~1 mm之间。

2. 当时的Voltage clamp技术以2-5um的玻璃电极直接刺穿较大的目标细胞/神经,实现和细胞内液的直接连通。通常需要用到两根电极,一根通过注入电流的方式控制电位,另一根则测量膜内外电势差。

3. 1976Neher & Sakmann提出了膜片钳的概念。主要做了两个改进:第一是利用玻璃尖与细胞膜形成gigaohm sealing,从而可能直接记录该膜片区的电流信号;也可以通过施加负压给细胞穿孔,实现全细胞测量。第二是以一根电极快速切换其控制/测量电位的功能。这一电子学的改进使得只用一根电极就可以进行实验,从而使得小尺寸细胞的测量成为可能。他们也因为这一发明获得了1991年的生理医学奖。

最经常被引用的一篇论文发表于1981年,至今已被引用超过13千次。

Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. Pflugers Arch 1981; 391:85-100. ( AN : 82037188 )

4. Intracellular recording时,由于玻璃管径较细,毛细管阻抗较高。通常采用灌注2-3M KCl溶液电解质的方法尽可能降低这一阻抗至15-150 MOhm。一般来说,较大的毛细管阻抗并不是一个严重的问题。

5. Voltage clamp中,电极扮演着两重作用:a)测量电势差;b)注入合适电流以保证电势差处于指定水平。这一反馈响应需要十分迅速。因此大阻抗的电极不太合适(因为需要较大的电势才能驱动一定量的电流)。所以在voltage clamp中需要用孔径相对较大,阻抗较小(1-5MOhm)的extracellular recording electrode. Current clamp不需要进行反馈补偿,因此可以应用较大阻抗的intracellular recording electrode

6. Perforated Patch clamp:通过电极内液中某种化学物质(nystatin, gramicidin or amphoteracin B)的作用,使得细胞膜仅对小分子离子通透,但是阻止蛋白质等大分子通过。在此情况下,可以认为细胞膜外的电极和细胞内液是电学连通的,但是尽可能地保留了细胞内液的组成和活性。这是一种综合了extracellular voltage clampintracellular recording的膜片钳模式。前者能够控制膜电位,但是会导致细胞内液和电极内液的充分交换而流失(um级电极孔径);后者能够保证细胞内液组成不变(数十纳米的电极孔径),但是不能通过反馈电路控制膜电位。

7. Series resistance in whole cell mode指的是电极电阻(Rpipette)和接触电阻(Raccess)的串联之和。前者可以在接触细胞之前测得。后者是离子通过该电极孔洞时的阻抗,一般是一个较小的值。接触电阻不同于封接电阻(Rseal)。封接电阻反映的是离子通过孔洞流到电极外的溶液中的阻抗;接触电阻反映的是离子通过孔洞流到电极内液中的电极上的阻抗。

8. Amplifier上的Capacitance compensation:在改变holding potential由于毛细管电容的存在会引起电路出现一个暂态充、放电电流。这一电流可以通过电路加以补偿。Series resistance compensation : 在注入一定的电流时,细胞接触电阻Raccess和电极电阻Rpipette与细胞电容的并联电路会引起电路响应的滞后以及测得电压的减小,这一影响可以通过增大注入电流的大小来加以补偿。设定这一补偿数值所需要的RC电路参数可以通过capacitance compensation过程加以估计。一般可以补偿80%的影响。



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