我的红酵母苯丙氨酸解氨酶（PAL,EC 4.3.1.5）反向合成应用，并工业产出Phe的技术总结报告

                       杨顺楷      四川成都

1. 引言

笔者本文此处介绍有关植物和红酵母的苯丙氨酸解氨酶（PAL，EC 4.3.1.5） 及其工业生物技术应用。PAL是仅存在于植物和微生物（酵母，个别细菌）的酶类。在《植物的生物化学及分子生物学》（2000）的有关章节对PAL是如下表述的。PAL（酪氨酸酶，TALl) 苯丙素代谢的中心酶。在大多数维管束植物，苯丙氨酸（Phe）是高度优良的生化代谢底物，但是在单子叶植物，确实能够利用Phe和酪氨酸（Tyr）；PAL也能够在少数水生植物检测到PAL酶活性的存在，可能它的功能是代谢生成简单的黄酮类化合物，例如C- 葡萄糖酰-和毒蚕豆苷。在水生植物并不存在木质素，于是PAL（TAL）的酶促反应步骤，和多样化的苯丙素，及其苯丙素乙酸酯代谢途径产物成为了陆生植物定植的关键。

在所有植物次生代谢研究中，或许可以说PAL酶学是开展了最广泛的研究。在某些植物PAL是单基因编码，而在另外一些种类又是多基因家族的产物；PAL酶活性不需要辅因子，经由PAL反应引发出的铵离子，经由谷氨酰胺合酶和谷氨酸合酶催化而得以循环。早在上世纪80年代，依据植物苯丙素代谢中，Phe作为优良底物，经由PAL酶反应脱氨，生成反式肉桂酸，而该肉桂酸继续进行代谢反应，进入陆生植物的重要木质素循环。恰好在这一代谢节点，可以实现PAL酶反应的逆向合成反应，即利用肉桂酸和氨直接合成L-Phe；其时美一家公司在肯塔基建厂，实现工业生产L-Phe产品。有力推动了工业规模阿斯巴甜（APM）（L-天冬酰-苯丙胺酸甲酯）新产品的生产，L-Phe产品自那时的每年全球50吨水平，迅速提升到百千万吨级水平。

国内笔者首先在1985开展了这以技术途径的L-PheR&D。经由从本土滇西芒果园土壤样品中，分离筛选出高活力高稳定性的PAL红酵母CIBAS A-1401菌株，经过小试-中试-百吨级的中间试验，从1998-2005共计由国内3家企业生产出2000多吨L-Phe产品，有力推动了我国APM的产业发展。同时还借助化学-酶法的PAL合成实现了对20个芳基丙烯酸的立体氨化合成L-芳基丙氨酸的合成研究；并于998年秋在广西桂林的酶催化机制国际学术会议上参加了学术交流。

2.下面全文附上笔者在2006年的如下标题所述的个人团队在近20年有关PAL研发的技术总结报告，供参考。

红酵母苯丙氨酸解氨酶（PAL）工程菌的构建及产业化应用

杨顺楷 

一、        前言

鉴于1995年6月在江苏连云港经过中试鉴定的红酵母纯培养物Rhodotorula sp. CIBAS A 1401（Chengdu Institute of Biology, Academia Sinica, A 1401 分离筛选菌株编号）有希望在国内率先实现100t/a L-Phe生产线的建设。自那以后，经过3年的磨合期，直到1998年该菌种及工艺技术体系作为PAL酶源菌种在浙江绍兴亚美生物化工有限公司，首次实现L-Phe酶法转化肉桂酸生产L-Phe 100t/a生产线的正常生产；后来继续改进生产工艺，特别是产物回收工段膜技术的创新应用，使得生产线产能增大1倍，达到200t/a L-Phe产品；与此同时，掌握有该技术菌种的连云港某公司，独自经由不同途径进行技术转让，在江苏滨海长滨化工，山西晋城金驹煤电化工股份有限公司化工厂，均建立了年产L-Phe 100t/a级规模的生产线，投入了酶法转化肉桂酸生产L-Phe的试生产。据估测，三家企业到2003～2004年为止，共计约生产L-Phe 1500～2000t，带动了国产L-Phe及阿斯巴甜（APM）的生产，致使韩、美、日几家生产L-Phe的公司在1995年L-Phe的到岸价20万元/t下跌到今年的8万元多/t；APM的价格由1995年的50万元/t下跌到目前的20万元/t以下；其原因很简单，我国的企业已有能力自主开发生产L-Phe和APM这样的高端精细化工产品了。但同一时期，作为技术来源的中国科学院成都生物研究所的知识产权却得不到合理的保护。

为了维护技术来源的知识产权和科技成果规范有序地转化，我们继续开展了该红酵母菌种的实验研究工作，得到了绍兴亚美生物化工股份有限公司和常州常茂生物化学工程股份有限公司的经费资助，于2004年发表了“苯丙氨酸解氨酶高活性红酵母CIBAS A 1401菌株的鉴定”一文（应用与环境生物学报，2004,10(2):242~245），该工业菌种正式分类鉴定为粘红酵母（Rhodotorula glutinis）CIBAS A 1401。同时，于2003年底2004年春，我所又同江苏常茂生物化工工程股份有限公司正式签约开展“红酵母L-Phe PAL工程菌的构建及应用研究”，力求将细胞分子技术和传统工业微生物育种技术结合起来，在我国进一步发展首次投入工业化生产的L-Phe生物化工项目的基础研究工作——菌种改良。所做的工作有如下几项：

①苯丙氨酸解氨酶的分子生物学研究进展（应用与环境生物学报2002,8(6):672～675）

②红酵母苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质研究（四川大学学报(自然科学版)2004,41(4): 865～868）

③苯丙氨酸解氨酶（PAL，EC4.3.1.5）反应机理研究新进展（生物加工过程 2004,2(4) :1～5）

④粘红酵母（Rhodotorula glutinis）CIBAS A 1401苯丙氨酸解氨酶cDNA核心序列的克隆与分析（应用与环境生物学报2005,11(6):694～698）

  同期，国外德国慕尼黑一项从事植物转PAL基因烟草作物实验室，与美国肯塔基大学烟草研发中心合作，进行田间种植试验，让PAL在转基因烟草的叶绿体蛋白中进行超量表达，对收获的烟草生物量有两方面用途，其一，分离纯化的PAL用于治疗遗传疾病PKU；其二，作为工业生物催化剂用于工业生物合成L-Phe其结构类似物（非天然芳族丙氨酸）。此外，该种植物试验还可以因为PAL的强力表达，积累起经由植物苯丙素代谢途径所产生的具有药用商业价值的天然产物生理活性代谢物，有力推动借助合成生物学代谢工程途径的深度开发。

二、        实验进展情况

㈠过程小结

鉴于具有自主知识产权的粘红酵母CIBAS A 1401菌株的选育成功，3条产能为百吨级的L-Phe生产线首次在国内投入运转，经过数年的连续试产，共产出1500～2000吨L-Phe产品，促进了国内APM的快速发展，形成了目前国内L-Phe/APM的产业化局面。但是，随着近年石油化学品价格上涨，因此肉桂酸价格上扬；加之企业PAL菌种选育工作跟不上，相应地产酸率降低，能耗增加，成本增高，竞争能力下降。因此国内首次投产L-Phe的年产百吨级的工业装置所属企业（绍兴亚美、江苏常滨、山西晋城）数年来采用的肉桂酸/PAL酶法工艺不得不处于自发停产的局面。

在1998～2003年期间，绍兴亚美公司共生产了600多吨L-Phe，在肉桂酸价格为3.0～3.5万元/t，产酸率2.5％为盈亏平衡点；3.0％则明显盈利；3.5％则产品很有市场竞争能力。2001年夏，在绍兴柯桥召开了本工艺1000t/a级L-Phe的技术论证会，由浙江石化院提出了工程设计的可行性研究报告，在会上予以正面评估；后来因稽山集团董事会意见分歧，此项目被搁置，至今令人遗憾！

当时，浙江衢化集团下属一个分厂，已经在3个月内开发出利用四氯化碳和苯乙烯生产肉桂酸的工艺路线，并且完全符合我国政府作出的“积极处理作为化工原料利用的破坏大气臭氧层的四氯化碳生产肉桂酸”的国际承诺要求。当时已经达到月供肉桂酸20t的规模（年产300t肉桂酸），价格3.1万元/t，当时亚美公司的L-Phe/APM生产形势一片光明。如果当时抓住这一机会，将我国氯碱工业中的四氯化碳延伸开发为肉桂酸与本工艺配套，则我国的L-Phe/APM产业将是另一番景象。

2005年初，应江苏滨海长滨化工公司和山西晋城金驹煤电化公司化工厂的邀请，笔者考察访问了两家公司。均都以同样的工艺技术路线生产L-Phe，已有4～5年的试生产经历和经验。他们认为在菌种生产性能稳定时，L-Phe的生产具有操作容易、产品质量高、废水量少的特点。长滨化工公司的生产规模是3家企业中较大的（500t/a），亚美次之，山西晋城较小。

如上所述，肉桂酸/PAL酶法生产L-Phe带动了国内APM的产业化发展。但是，WTO后面临国际市场的强竞争力，加上糖质原料直接发酵从菌种到中下游工程的改进，工业生产规模的扩大，使得近2～3年来L-Phe进口到岸价一直下跌，目前已为8万元/t。例如，以韩国大象公司为例，L-Phe工业装置3000t/a产能，7只×260M³的发酵罐，批产量达达25t L-Phe。这种工业规模的葡萄糖直接发酵工艺，产品显然具有市场竞争力；美国生产L-Phe的同类工艺，发酵罐容量达600 M³。可见，工业发酵中膜技术的应用，使得氨基酸发酵生产工艺更加趋于完善，具有可持续发展的重要性！但目前国内的糖质原料直接发酵法生产L-Phe尚不能与之竞争。虽然如此，笔者并不认为我们的肉桂酸/PAL酶法生产L-Phe工艺已丧失竞争力。中国幅员广阔，各地工业发展水平、资源（能源、水、劳动力）配置参差不齐，市场发育程度差异较大！有胆识的企业家、投资人，加上政府等职能部门的积极引导、重组；肉桂酸/PAL酶法生产L-Phe/ APM、大输液医用L-Phe应用以及非天然L-Phe新产品开发等，必将使该工艺获得新生、发展壮大。

㈡得与失

过去10年来，国内具有自主知识产权的肉桂酸/PAL酶法生产L-Phe的创新工艺，经由研究所/企业直接合作的形式，已经收获了我国L-Phe工业化生产的成果。推动了我国APM的发展。但是，作为我国高科技产业仍由政府主导型起作用，至少在L-Phe的攻关（国家“六五～九五”）过程，就像京剧“三岔口”一样，在黑暗中摸索，缺乏沟通和交流；高管层对各条工艺技术途径莫衷一是，缺乏透明度，难以作出客观公正的评估，致使我国L-Phe/APM的产业化难尽人意，政府主导型没有发挥出来。例如，2001年初，笔者应超大型国企——浙江衢化集团公司之邀，在年度先进生产者表彰会上，作了新世纪里的生物化工及发展前景的报告；力图将该公司氯碱工业的有害副产物——四氯化碳，作为合成原料，与苯乙烯转化生产肉桂酸；再经由绍兴亚美公司的肉桂酸/PAL酶法规模生产L-Phe，再延伸到APM的生产。但是，终因两家企业间差异太大，一家是超大型国有化工企业，而另一家是中小型民营企业，除了简单的商业利益外，很难于真诚合作。这就是我国高科技生物工业发展过程中的悲哀！得失谁知之！

㈢进展情况

本所的生物转化实验室，早在获得1988～1990年度国家自然科学基金立项资助后，已于1991年春通过了“红酵母生物转化肉桂酸制苯丙氨酸”的省部级技术鉴定，1995年在江苏连云港通过了公斤级中试鉴定，1998年秋在绍兴亚美公司实现100t/a L-Phe的工业生产线运转；其后紧接着是江苏滨海长滨化工公司和山西晋城金驹煤电化化工厂也相继投入500t/a和100t/a产能的生产线运作。三家企业的技术源头和所用菌种均源自于我所生物转化实验室从滇西保山某芒果园土壤样品，经定向富集培养，分离选育获得的中试生产菌种（Rhodotorula sp.）CIBAS A 1401；现经鉴定命名为粘红酵母（Rhodotorula glutinis）CIBAS A 1401。

3.1分子生物学部分

经近年对该菌种的分子生物学结合生物信息学手段研究，发现从植物来源的PAL，例如从欧芹、马铃薯、大豆，以及从微生物来源的近缘种红冬孢酵母和胶红酵母中克隆的PAL基因，通过其PAL基因的同源性比较研究发现，PAL基因在它们之间同源性很低，很难找到可用来设计引物的同源性很高的核苷酸片断。我们通过氨基酸同源性比对，选择较保守的区域设计简并引物进行RT-PCR，首先扩增出一段386bp长的序列，但为了便于下一步进行5’RACE实验，又利用首次RT-PCR的结果及其氨基酸同源性比对，又设计了一对引物进行RT-PCR；考虑到扩增片断较长而且GC含量较高，故使用一种特定GC缓冲液体系，扩增出了810bp长的序列。在获得此片断的基础上设计引物，将两次RT-PCR和3’RACE的结果测序后进行拼接，获得长为2188bp的PAL cDNA序列。经相关软件翻译成为对应的氨基酸序列，其长度为714个氨基酸。用DNAMAN软件进行氨基酸序列结构与同源性分析，发现与其发布的红冬孢酵母（Rhodotorula toruloide）PAL相应氨基酸序列相似性为28.1％，和胶红酵母（Rhodotorula mncilaginosa）PAL相应氨基酸序列相似性为29.9％，而与植物来源的欧芹、大豆PAL相应氨基酸序列相似性仅有12.8％和14.7％。由此可见，PAL氨基酸序列在酵母与植物之间相差较大。通过Sanproside程序对该714个氨基酸序列进行分析，发现127～143位的氨基酸序列GTISASGCLSPISYIAA为PAL的特征序列。但与植源的欧芹、大豆PAL相应氨基酸序列进行比对时发现，在植物中该序列为GTITASGDLVPLSYIAG，其第4位、第10位与第17位的氨基酸与红酵母PAL相应位置的氨基酸不同。目前该粘红酵母菌株CIBAS A 1401该核心PAL基因序列已提交到GenBank，获得序列号（Accession Number）为DQ013364；这为进一步克隆PAL全长cDNA及构建苯丙氨酸解氨酶基因工程菌奠定了基础。

3.2常规育种部分

我们采用甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulphonate，EMS）作为诱变剂，对经由Ⅱ级活化，稀释涂平板，选择出的红酵母纯培养物，用无菌牙签移种到阵列平板（麦芽汁平板，8×8或10×10）上；再经培养，经用丝绒影印到至少3组诱导培养基（含芳香族丙氨酸结构类似物）平板上进行培养；经培养2～3日后，挑取生长良好的菌落到斜面上培养，按60株斜面为一组供试菌，进行Ⅱ级发酵摇瓶筛选，利用TLC（20×20㎝）；大板检测转化能力强而高（L-Phe产物积累浓度最高）的菌株作为生产用菌株。

3.3粘红酵母CIBAS A 1401苯丙氨酸解氨酶（PAL）的分离纯化与性质研究

应用选出的高PAL活性的粘红酵母CIBAS A 1401-37号菌株，在Ⅱ级发酵至21h时，生物量达到最高，PAL酶活力最高，且能维持活力峰值期2～3h；在此时搜集菌体纯化该PAL酶最适宜。经试验发现，用直径0.5㎜的采用玻珠破壁5～6次时，有最佳效果；用硫酸铵分级沉淀时,选择40％～65％饱和度，沉淀效果最好。获得的粗酶液再经Sepharose4B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换，得到最终纯化倍数为139倍，收率为12.6 %的结果 。

经纯化得到的酶液，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析均得到单一蛋白带,证明该酶已经达到凝胶电泳纯，且其亚基大小相等。由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条带上，其PAL亚基的相对迁移率和由标准蛋白质迁移率所配的标准曲线，插值分析可得出该PAL的亚基分子量约为79.4kDa。

该PAL制剂在不同的金属离子氯化物体系中，除了Mg²⁺ 和Na⁺外，其它金属离子如Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Hg²⁺等对其都有明显的抑制作用。

PAL的酶反应动力学参数：根据Lineweaver-Burk 作图法，在pH8.5，40℃条件下测得本粘红酵母CIBAS A1401 PAL L-Phe生成t-Ca的Km值为3.87×10^-4mol/L。

在不同温度和不同pH值条件下测试发现：在pH8.5时，该酶的最适温度为40℃；在40℃，该酶的最适反应pH为8.5，在pH8.0～9.5 之间有较好的稳定性。在无防腐剂和保护剂的条件下，4℃和-20℃保存2周活力下降分别不到40％和20％。

该酶在50℃以下，尤其是在最适反应温度以及更低温度下，都有较高的稳定性，这就是为什么该菌株能用于工业生产L-Phe的优势所在。

本工作将粘红酵母CIBAS A1401 PAL的部分酶学性质与已经报道的高等植物PAL的性质作了比较研究，发现都不同程度地证实了酵母PAL与高等植物PAL有着相似的结构大小和生物学特性；但这并不说明它们就完全一样。据报道，酵母PAL的活性部位的结构与高等植物有着较大的差异，且PAL在植物和酵母体内所起的生理功能是有区别的。

3.4粘红酵母（Rhodotorula glutinis）CIBAS A 1401菌株苯丙氨酸解氨酶（PAL）基础酶学问题辨析

据报道，PAL有酪氨酸解氨酶（Tyrosine ammonia-lyase，TAL）活性，催化酪氨酸（Tyrosine，Tyr）解氨生成对一香豆酸（4-羟-肉桂酸）；一般来说，TAL活性不总存在。有人认为该PAL存在两种酶形式，实验结果表明，其PAL和TAL最适PH不同，动力学参数（Km值，Kcat，Kcat/Km）不同，但都有类似的催化效率。

对于粘红酵母A 1401而言，在使用该菌种在发酵培养制作细胞作为PAL生物催化剂时，对其液体培养基中的两种芳族氨基酸（L-Phe，L-Tyr）作为PAL的诱导剂对其代谢利用过程的差异分析结果表明，该菌首先代谢利用L-Tyr，其次才是对L-Phe的代谢利用；由此可以推断本菌株经芳族氨基酸诱导生成的PAL酶系中也存在优势的TAL酶活性；这在本实验室的红酵母对三种底物，即间-羟-肉桂酸，邻-羟-肉桂酸和对-羟-肉桂酸生物转化制L-Phe结构类似物，即间-羟-L-Phe，邻-羟-L-Phe和对-羟-L-Phe（即L-Tyr）的筛选和制备合成试验中，实际上就是TAL（酪氨酸解氨酶）逆向生物催化合成天然（L-Tyr）和非天然L-Tyr的结构类似物，具有生物技术应用的重要性。

因此，从基础酶学角度分析，实际上该菌存在两种酶形式，即PAL和TAL；PAL/TAL的比率取决于菌种及其生理营养条件。不过通常认为两种酶活性均可对肉桂酸被直接立体氨化合成L-Phe起作用。表1给出了该菌株在生物催化剂制备阶段，优先代谢利用作为PAL诱导剂的Tyr，然后才是L-Phe的结果。由此表明该菌株存在两种酶的形式，且TAL可能较PAL占优势。

表1  红酵母生长培养过程中发酵培养基氨基酸水平的变化

3.5红酵母生物转化肉桂酸及其结构类似物合成L-Phe和L-Tyr及其系列非天然芳基丙氨酸的研究应用

表2  红酵母PAL/TAL酶促立体氨化合成L-Phe/L-Tyr

及其非天然芳基丙氨酸的实验研究结果

由表2可见，本实验室以及利用红酵母PAL逆向酶促合成出22个L-Phe及其结构类似物，已经较成功地构建起了这一创新性生物技术平台，显然具有工业生化合成的实用意义，具有工业开发价值。当前，特别是对具有类似苯丙氨酸结构作为手性合成子的各种非天然光学活性氨基酸的共性制备工艺技术方面需求迫切，特别是经由本PAL酶法合成提供的非天然芳基丙氨酸，因为这些生物活性化合物作用极端重要，而且特别有效的蛋白酶抑制剂药物合成中，均都含有类似苯丙氨酸结构的药效学基团。这类蛋白酶抑制剂药物，特别是HIV-蛋白酶抑制剂在药店和医院日渐增多。近年，美国FDA批准的3个治疗AIDS病的药物，全都含有苯丙氨酸衍生物结构部分。因此，筛选寻找更好更有效的蛋白酶抑制剂不仅在治疗HIV感染，而且在治疗其他疾病领域，如病毒性流感和人的巨细胞肥大症（CMV），仍然将有持续研发的重要性。

三、        现在及近期的研究计划

3.1菌种改良——分子选育技术程序的建立及应用

在现有工作基础上，发酵培养高活性PAL红酵母细胞培养物；收获细胞物，物理破碎菌体，提取分离纯化该PAL酶制剂，经电泳检测，达到电泳纯标准，作成冻干制剂；送外协单位，以此作为抗原，制成双抗体免疫试剂盒；以此双抗体试剂盒，用于96孔板的大规模菌种筛选试验。

对于筛选所得到的高活力菌株，直接用于表2所列的L-Phe及其结构类似物名录定向合成制备，规模可依定单需求组织研制生产，可以从L-Phe的工业规模生产，到药用中间体的公斤级、克量级，充分满足用户的市场需求。

3.2新型药酶制剂研究——苯丙氨酸解氨酶（PAL）治疗苯丙酮尿症

3.2.1项目研究意义

PKU是一种常染色体隐性遗传代谢障碍疾病。患儿体内不能代谢苯丙氨酸（Phe）导致高Phe血症。我国发病率约为1/16500。据报道，此病在儿童3岁前没有症状，但3岁后会出现患儿发育个子矮小、智力低下的症状。其原因就是血液中高水平的Phe导致脑部损害；如果不及早筛查PKU，对筛查出的PKU患儿及时治疗，将会给家庭和社会带来一系列问题，不利于我国人口构成的优生优育。我国的《母婴保健法》有关规定，也很重视对PKU的诊治。仅以我国山东的报道为例，总发病率平均为1∶6750，农村发病率1∶5121，城区1∶10912。据成都市新生儿疾病筛查中心对27万名新生儿进行筛查，查出PKU患者12例。欧美国家现有PKU患儿50,000名。传统的治疗方法是采用膳食疗法，即患儿摄入饮食中，含有很低量或者无L-Phe存在，他们吃的特制米和奶粉非常昂贵，一般一个患儿每月的膳食费用为1500～2000元，这无疑给家庭带来了沉重的经济负担。因此，PKU的临床治疗——饮食疗法一直是一个消极、低效、难于实际运作的方案。因此，寻求一个较食疗治PKU更积极有效的替代疗法成为了中外医药学工作者关注的课题。

有鉴于此，早在80年代初，欧美的科技工作者就开始了尝试采用苯丙氨酸解氨酶（PAL）控制PKU体内的L-Phe水平的研究，包括剂型给药途径，以及临床酶法检验，安全性评价等一系列研究；药理动物模型试验也证明该PAL方法降低L-Phe水平的有效性。这无疑给PKU这一世界医学难题带来了新的更有效的替代疗法治疗PKU的希望。

1995年前后，在前10多年研究工作的基础上，提出了“氨基酸肠道再循环的新理论”，以及使用口服人工酶池，消耗去不需要的氨基酸的研究工作，从产PAL酶菌种的分子技术改良，即工程酶PAL的产生到多种PAL/PKU的治疗方略的提出。但直到1999年春，美加一个专门小组在全美国家科学院会议录提供的报道称：加拿大已经研制出一个经由插入酶基因到细菌中，大量产生PAL的方法，包括该菌的大规模培养、分离细胞物，以及大规模地分离纯化制PAL的工艺过程，但PAL的制造成本没有提及。一个新近的PAL/PKU小鼠模型试验中，口服纯酶制剂，在1～2小时期间，血液Phe水平降低到50～54％。按临床要求，该PAL酶要降低氨基酸水平到70～80％，才有临床治疗PKU的价值。显然，PAL/PKU的研制历程已经有了相当可观的进展。同期，国内北京协和医院的刘敬忠等人也用植物材料欧芹为PAL基因供体，用大肠杆菌表达系统构建成功PAL基因工程菌；向华等用乳酸乳球菌为基因工程菌，用欧芹PALcDNA通过电穿孔法转化乳酸乳球菌，表达出了PAL活性，但活力不高。这些都说明国内也早有人重视对PAL/PKU的研究。

2005年夏，德国慕尼黑一个从事植物基因研究的成果，同美国肯塔基大学烟草研发中心合作开发进行田间种植试验，作物是含有的PAL基因经由遗传工程方法转移到烟草叶绿体中进行超量表达。种植试验收获的作物有两个用途：其一，分离纯化的PAL用于治疗遗传疾病PKU；其二，作为工业生物催化剂用于工业生物合成L-Phe及其结构类似物。此外，该种植试验还可以因为PAL的强力表达，积累经由苯丙素代谢途径所产生的具有商业价值的生理活性代谢物。

2005年6月，在《分子治疗》（英刊）杂志上，一篇简报报道了重组红冬孢酵母的PAL，经由PEG化学修饰，获得的PAL衍生制剂，经体外和动物的体内试验表明大部分制剂均呈现好结果，特别是20KDa的PEG-PAL组合保持了对Phe的催化活性，消除了体内的免疫原性问题，提示这是一种新型的PKU治疗剂诞生了。

3.2.2项目研究内容，急需解决的关键技术问题

立足“产品工程”项目，开发出具有自主知识产权的创新项目——新型药酶制剂研究——苯丙氨酸解氨酶（PAL）治疗苯丙酮尿症（PKU）新药开发。

研究内容：酶源菌种我所选育已用于工业化合成生产L-Phe的粘红酵母CIBAS A1401

⑴菌株改良：

①传统理化选育/发酵培养/收获高PAL活性细胞物/提取分离纯化PAL

②分子手段完善粘红酵母CIBAS A1401的全序列PAL分子克隆/合适表达系统的选择/筛选实验/评估PAL水平

⑵PAL的生化分离提取纯化的放大制备试验研究

⑶研制对PAL制剂的PEG化学修饰/及其制剂的全套表征工作

⑷PAL制剂的药理试验（外协）

3.2.3项目已有工作基础

早期（1988～1995）由国家自然科学基金资助，91年完成小试，92～95年同江苏连云港一企业合作完成公斤级酶法生产L-Phe的试验。1996～2003期间，经技术转让，先后在浙江绍兴亚美生化公司投入100t/aL-Phe生产线的投产；江苏长滨化工公司及山西晋城三家企业均利用该菌种及技术，累计生产出L-Phe共计1000多吨。

近年在同四川大学、江苏常州常茂生化公司（江苏省手性研究中心）的横向课题合作，以及院科技创新项目中，在PAL的基因克隆及PAL催化机理，非天然L-Phe结构类似物的酶法不对称合成中，作了相关工作。已有数篇论文发表，并参与了国际国内学术交流，奠定了开展如标题所示的研发工作基础。

3.2.4市场前景及经济、社会效益

自从上世纪1934年，欧洲挪威医生Folling首次发现该人常染色体隐性遗传代谢疾患以来，一直采用低Phe膳食疗法治疗PKU，但效果不佳，一直都在寻求一种合适的替代疗法，取代目前一直沿用的低效的饮食疗法。随着生命科学的发展，已经给这种治疗PKU的药用酶制剂的研发提供了机遇和可能。如前所述，目前欧美有PKU患者5万人，加上我国、亚洲各国、南美、澳洲、非洲等，将是一个不小的PKU遗传疾病群体。这一新型药酶制剂市场前景无疑是十分令人鼓舞的，且是一个典型的高技术课题，其学术价值和商业价值均会是当代生命科技领域的顶尖之作；项目开发成功后，将会产生非常显著的经济效益和社会效益。

3.2.5预期目标

⑴坚持以“产品工程”项目为开发目标：首期计划以2～3年时间完成研究内容⑴～⑶的内容；同期完成向受纳技术开发的企业分阶段的专业技术人员培训工作，作为企业放大研发及批量试生产目标产品的技术及管理骨干。

⑵PAL制剂（含PEG衍生制剂）的临床前/临床试验需要外部协作单位，拟2年内完成临床前后工作，总结资料，鉴定验收

四、        结论

4.1红酵母/肉桂酸技术途径酶法生产L-Phe工业生产工艺技术、经济是可行的。特别是结合我国国情，结合生态环境保护，将氯碱化工中的四氯化碳作为生产肉桂酸以原料充分利用，经由四氯化碳+苯乙烯→肉桂酸，再生产L-Phe，再延伸到APM的生产，具有十分重要的开发价值。

建议先在国家级层面上，由江苏省手性生化工程中心牵头，组织省际三企业（绍兴亚美、江苏长滨、山西晋城）间对“肉桂酸酶法工业生产L-Phe工艺”，进行交流，对该工艺进行充分技术经济学评估。形成一份共识的报告，上报国家有关决策部门，供产业化开发提供新思路，克服传统思维的弊端。

4.2化学-酶法合成21个L-Phe结构类似物的实验室研究成果表明，该生物技术平台框架已经建立，建议在江苏省手性生化工程中心，进一步对这一技术平台，研制生产非天然芳族氨基酸系列，进行产业化开发，以推动加速我国强效蛋白酶抑制剂药物的研制，如治疗艾滋病、SARS等病毒性疾病的治疗。

4.3启动创新药酶PAL制剂治疗PKU的项目，以利于我国人口优生与健康产业的发展

4.4建议成立跨地域的科研协作网络，推动我国手性生化工程产业的发展。

* 日立835-50氨基酸分析测试，除了L-Tyr和L-Phe浓度如上表所示，17种氨基酸在10hr（放罐）的发酵液中，有5种氨基酸（Thr，Ser，His，Arg和Dro）检测不出，浓度水平下降到零

* 已经在工业生产线（年产百吨级L-Phe）上运作；其余的已经有实验室的克量级制备合成结果