分枝杆菌突变株生产雄烯二酮4AD

                            杨顺楷      四川    成都

4AD是已知的前体激素，是甾体药物合成的重要中间体。当今，它是由细菌生物转化甾醇底物，即能选择性地降解甾醇C₁₇-侧链，保留甾体母核在发酵液里积累4AD（C-19酮型），该细菌是来自土壤的腐生型放线菌类的分枝杆菌属细菌野生株经遗传选育而来，最终用于生产的。

甾醇侧链的氧化是一个具有复杂调控的多酶作用工艺过程。在分枝杆菌，4AD能进一步被甾体9a-羟化酶和1(2)-脱氢酶修饰，生成化学上不稳定的9a-OH-ADD。后者同时经受非酶促A环芳构化，伴随着B环的开裂；生成的9(10)-开环甾体，经由进一步已知的分解代谢途径，成为CO₂和H₂O。9a-OH化优先还是1(2)-脱氢优先？取决于菌株的专一性。对偶发分枝杆菌而言，有两种不同的3-酮甾体-1,2-脱氢酶——SDH₁和SDH₂，分别催化4AD的1,2-脱氢（4AD→ADD）和9a-OH-AD的1,2-脱氢（9a-OH-ADD）。显然，当其涉及同甾核氧化有关的关键反应的酶活性被抑制，或者抑制了9a-羟化酶和1,2-脱氢酶的合成，那么4AD就作为主要产物积累。

已报道分枝杆菌NRRL B-3805，VKMAc-1815D，NRRL B-3683，以及其它的能由甾醇产生4AD的菌株。对于转化甾醇的分枝杆菌而言，抗菌剂常被用作表型标记。该手段适用于对抗生素的抗性选择是合理的，以及対于亲脂性化合物的生物转化似乎都是依赖于同样的因子。该因子就是在于分枝杆菌独特的细胞壁组成，它具有高的疏水性和相对低的可渗透性。例如使用万古霉素或甘氨酸抑制细胞壁肽聚糖的合成，结果造成了谷甾醇转化为4AD，ADD过程强化。

分枝杆菌细胞壁的组成不仅仅是影响分枝杆菌抗生素抗性和甾醇转化活性的因素，它还有抗b-内酰胺酶活性。分枝杆菌菌株对氨基糖苷类抗生素依赖于低的细胞壁可渗透性和低的b-内酰胺酶活性。分枝杆菌菌株对氨基糖苷类抗生素的抗性，可经由对这类抗生素酶失活氨基糖苷的增效作用，以及促进细胞壁屏障扩散作用得以解释。经由分枝杆菌生成并积累3,17-二酮甾体，也依赖于细胞壁的可渗透性，以及其切断甾醇侧链和甾核氧化的酶活性相关联。

对于腐生的分枝杆菌在抗生素的甾醇氧化作用之间的相关性尚未详细研究。借助分枝杆菌的NRRL B-3683经用甲基磺酸甲烷处理后，对获得的突变株借助对12种抗菌剂改变其敏感性进行了表征。它们保留了切断甾醇侧链的能力，有1株菌甾体1(2)-脱氢酶为负，并积累4AD作为主要的甾醇氧化物。该菌株并能转化4AD为睾丸酮，转化ADD成为AD，皆为酶法还原过程。

由分枝杆菌的甾醇侧链降解过程，常伴随有3,17-二酮甾体的17b-还原。该调控作用在从甾醇工业生产4AD，ADD工艺过程中，为了避免生成睾丸酮和1(2)-脱氢睾丸酮作为副产物而具有重要性。另一方面，17b-还原3,17-二酮甾体在利用分枝杆菌由甾醇降解工艺过程，经由对4AD的17b-还原生产睾丸酮的工艺具有特别重要价值。

分枝杆菌VKMAc-1815D能切断甾醇侧链，产生4AD作为主要产物，克分子产率63-68%；纯系菌株的选择是建立在克隆具有改变抗菌剂抗性方法学基础上；借助EMS或丝裂霉素C处理，获得的突变株保留有由谷甾醇生产4AD的能力，克分子产率达到70-75%；还选择出1株突变菌株能有效地还原3,17-二酮甾体的C₁₇位；其菌株细胞粗提物的17b-羟基甾体脱氢酶活性两倍高于亲株。这一途径提出了由甾醇生产4AD或睾丸酮产品的可行性，即可经由改进和标记生物催化剂方式实现这种可能性。