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焦磷酸测序技术-Pyrosequencing
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焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。
瑞典AB公司基于Pyrosequencing技术而研究开发的PSQ 96系统是一个理想的遗传分析技术平台，它既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的SNP检测及等位基因频率测定。具有以下优点：不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素；10分钟内可分析96个样品的SNP，可满足高通量分析的要求；每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析，实验设计灵活；序列分析简单，结果准确可靠。
Pyrosequencing技术的原理：
Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下：
第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase)和底物混合物(包括APS和Luciferin)。
第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下降解。
第5步：加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。
https://m.sciencenet.cn/blog-89405-367383.html
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