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远红外显微镜

已有 6184 次阅读 2013-6-13 10:42 |系统分类:科研笔记|关键词:学者| 显微镜

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   用加热的方式控制外源基因表达和离子通道开关,在生物医学中有着非常广泛的应用。热激蛋白启动子是一组在结构上高度保守的多肽,当外部温度较高(大于35度)时,该启动子被激活并调控其下流基因的表达。该方法是发育生物学中一个非常重要的实验手段。在离子通道大家族中,最近有许多对温度敏感的离子通道被发现,但对它们的生物学功能的研究还相当匮乏。通过局部加热的方式控制离子通道的开关是研究其功能最有效、直接的实验方法。

传统的加热的方式主要用水浴(37度水浴箱)或者电子元件(电阻)对活体生物或者活体组织、细胞进行加热。传统方式有以下四个缺点:

1)无法微区域加热。无论是用水浴还是电加热,只能对生物标本整体或者大面积局部加热,无法对感兴趣的微区域(十到几十微米)或者单细胞(十微米)进行精确定点加热;

2)加热效率低。用水浴激活热激蛋,通常需要对生物标本或者组织持续加热12小时。长时间加热对生物个体有较大的损伤,影响其生物活性;

3)无法精确控制温度。不同组织对热的传导性不一样,导热模型复杂,理论上很难计算加热区域的实际温度梯度分布。同时,传统方法无法实时监控不同区域的温度并进行相应调控;

4)无法深度加热。由于生物组织不良导热性,使得部分内部组织无法得到有效的加热。


1、 技术方案。

利用高功率低噪音的远红外激光(1450 nm 1500nm)加热生物标本,使得被加热的微区域在几微妙内温度就能迅速升高十几度到几十度。

本发明的有以下两个主要理论依据:

(1) 生物组织里面的水分对远红外波长吸收效率高,而蛋白质和脂类对远红外波长的吸收效率低。生物组织主要由水蛋白质脂类和核酸组成,其中水分占到了80%以上。在1450nm-1500nm附近,水的吸收系数远高于水对可见光(400-700nm)的吸收系数,高达 10000倍以上。而其它成分,如蛋白质和脂类,对远红外的吸收很低。用1450nm对生物组织进行加热,能有效快速加热组织中的水分, 进而间接加热但是不损坏其余重要成分,保持生物活性。

(2) 显微镜物镜对激光的精确汇聚能力。市场上通用的显微镜物镜对激光有非常好的汇聚作用,焦点处光斑大小在1微米左右。


本发明克服了传统加热方式的缺陷,有以下三个优点:

(1) 微区域加热。通过明场或荧光显微镜找到感兴趣的单细胞细胞群或小面积组织,然后用激光进行精确的定点加热。根据不同的实验需求,可以一次加热几个微米的区域(单细胞水平)或者几十微米的组织;

(2) 快速加热。在远红外激光的刺激下,组织温度在几微妙内就能升高十几度,并稳定在平台期。根据本公司的初期实验结果,1秒就可以激活斑马鱼中的热激蛋白启动子,远优于传统水浴方法的几十分钟;

(3) 实时监控温度。在对生物标本就是远红外激光加热同时可以进行荧光成像。一些荧光团的荧光强度和温度成线性关系,通过测量荧光强度的变化实时监控微环境的温度。

(4) 深部加热。由于远红外激光对生物组织(脂肪类等)有较高的穿透性,可以无创伤加热深部组织。

       

2、 具体实施方式:

在普通荧光显微镜上安装远红外激光器以及相关光学和电子配件,通过红外激光加热标本,用光学快门控制加热时间,通过自动平台移动加热位置。利用系统中的平凹透镜和平凸透镜组合调节红外激光的分散度,矫正系统中的光学色差。整套系统可安装在不同品牌公司的倒置和正置显微镜镜体上。图12分别是安装在倒置显微镜的结构正面图和侧面图;图34分别是安装在正置显微镜的结构正面图和侧面图。两种结构安装方式相似,八个核心部件相同,每个部件在图1到图4中的编号相同。在图1中,远红外激光线路用红色线表示,荧光线路用黑色线表示,远红外激光和荧光的混合线路用蓝色线表示。下面用图一来说明每个配件的规格型号以及它们之间连接方式。

(1) 远红外激光器、耦合器、光纤和准直器(图1A和图5)。激光器采用高功率低功耗远红外半导体激光器,波长为1450nm或者1470nm,输出功率大于150mw。激光器的输出口连接到耦合器,通过调节耦合器内部的非球面镜,把激光光束耦合到内径为100-200微米光纤(1300-1600nm)的输入端。光纤的输出端链接准直器,调节准直器内部的非球面透镜位置,使输出激光为平行光(高斯光束)。准直器的输出激光光束功率不低于100mw。激光器、耦合器、光纤和准直器的结构位置关系见图5。该组和部件可选用长春新产业光电技术有限公司生产的1450nm红外半导体激光器(型号:MDL-1450(FC)或者 FC-1450)或1470nm光纤耦合激光系统(型号:MDL-1470(FC)或者 FC-1470FC-W-1470)。

(2) 电子光学快门快门控制器以及控制软件(图1B)。准直器和光学快门通过自制适配器连接。光学快门的光圈大于15毫米,快关的响应时间低于10微妙。控制器为光学快关提供驱动电源,控制光学快门开关。控制器配备TTL输入接口,高TTL打开光学开门,低TTL关闭光学快门。TTL的电压高低由定制软件控制。电子光学快门和控制器可选用Vincent Associates公司生产的VCM-D1单通道控制器和LS6光学快门。

(3) 透镜组合(图1C1C2。透镜组合由抗反射增透膜的平凹透镜和平凸透镜组成,由定制的透镜套管固定。平凹透镜的焦距(-f1)在75毫米到125毫米之间,平凸的焦距(f2)在125毫米到175毫米之间,两个透镜的初始距离(D)满足D=f2-f1小范围调节D(小于5毫米),改变红外激光辐射发散角矫正系统中的色差,使得远红外激光和可见光在物镜后(图1F)能聚焦在同一个平面。平凹透镜和平透镜可选用Throlabs公司生产的N-BK7(1050-1620nm)系列球面透镜。

(4) 金属卤素灯(图1D)。选用市场上通用的金属卤素灯,提供荧光成像的激发光光源,如Lumen Dynamics Group公司生产的X-Cite® 120系列荧光灯。

(5) 远红外-可见光双色镜(图1F)。双色镜固定在标准显微镜滤光立方体内,安置于显微镜荧光转盘中。该双色镜对45度角入射的14501470nm的激光反射率大于90%;对45度角入射的可见光(400-700nm)透射率大于80%。双色镜可选用Semrock公司生产的45度角低通双色镜(FF746-SDi01);显微镜滤光立方体可选用Throlabs公司生产的MDFM-MF2

(6) 荧光滤光片组合(图1E1E2E3)。该组合包括一个直径25毫米的发射滤光片(E1)、直径25毫米的激发滤光片(E2)和与之配套的二向色镜(E3)。该组和固定在标准显微镜滤光立方体内,安置于另一显微镜荧光转盘中。在倒置显微镜中,该组合处于远红外-可见光双色镜的垂直正下方(图12);在正置显微镜中,该组合处于远红外-可见光双色镜的垂直正上方(图34)。荧光滤光片组合可选用市场上通用的滤光片组合。

(7) 显微镜物镜(图1F)。显微镜物镜固定于显微镜物镜转盘中。物镜需选择干系物镜,放大倍数介于40x63x之间,数字孔径大于0.6,对远红外光的通透率大于50%。物镜可选用Olympus公司生产的40x物镜(型号:UPlanFL,∞/0.17 )

(8) 显微镜自动平台(图1G)。自动平台需安装显微镜镜体上,并提供可编程控制的RS232接口或其它标准接口。通过定制的程序,控制自动平台移动到指定位置。自动平台的移动误差小于0.1微米,移动速度大于1毫米每秒。自动平台在移动过程中,电子光学快门处于关闭状态。自动平台可选用Applied Scientific Instrumentation公司生产的MS-2000三维移动平台。

除了以上的八个核心配件,该发明还配备矫正载玻片。在显微镜载玻片(厚度1mm)的表面平放热敏纸,施加一定压力后用盖玻片(厚度0.17mm)覆盖、封片做成矫正载波片。热敏纸可以记录红外激光通过物镜的激光斑点大小和相对位置,为加热标本提供位置坐标。

图1: 安装在倒置显微镜镜体上的远红外温度跃升显微镜结构正面图。A 准直器;B 电子光学快门;C1 C2透镜组和;D金属卤素灯;E1 E2 E3荧光滤光片组合;F远红外-可见光双色镜;G显微镜物镜 H显微镜自动平台


图2:安装在倒置显微镜镜体上的远红外温度跃升显微镜结构侧面图。各配件和图1相同。





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4 徐大彬 戴德昌 郑环泉 HBG

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