随着单分子荧光光谱的日趋成熟以及激光和探测技术的发展，越来越多的分子可以用于单分子荧光光谱技术，但单分子技术对于荧光分子的要求仍然比较严苛：首先荧光分子必须具有较高的荧光量子产率和较大的吸收截面，使荧光分子可以在弱激光激发下得到足够强的荧光信号；其次荧光分子的荧光寿命或激发态寿命要足够短，太长的荧光寿命往往限制荧光信号的探测，即使荧光量子产率再高，单位时间内的荧光发射量仍然会很弱，比如稀土离子的发光；再次荧光分子三线态或其它暗态的量子产率足够低，如果系间窜越量子产率较高的话，由于三线态寿命较长，分子大部分时间处于暗态而没有荧光信号；最后，荧光分子要有足够的光化学和光物理稳定性，在实验过程中避免发生快速化学变化。因此单分子荧光光谱于是仍局限于“染料分子”中的一小部分，因为自然界中绝大部分分子只有非常弱的荧光或者几乎没有荧光，这很大程度上限制了单分子光谱技术的应用。2010年，三个研究小组几乎同时通过不同手段实现里非荧光分子的单分子检测技术1–3。最近人们还通过纳米颗粒的表面等离子性质成功实现了无标记单分子蛋白的探测4,5。实现弱荧光探测的另一个途径是通过荧光增强技术，是分子荧光量子产率提高，达到可以进行单分子探测的水平。近来弱荧光分子的荧光可以被增强上千倍6,7。目前这些技术仍处于初级阶段，实验技术相对复杂，对于实验室普及有一定难度，但是打开了通往为非荧光分子的单分子检测的大门，随着技术和发展，相信不久的将来这些技术会的到更好的应用，从而大大拓展单分子的技术的应用，并可以解决目前如单分子荧光量子产率测量等的技术难题。

第二节 超分辨单分子成像

德国物理学家恩斯特阿贝提出由于光的衍射性质，光束不能无限聚焦，可见光能聚焦的最小光斑由光的波长和透镜的数值孔径以及介质的折射率决定即1.22λ/NA，一般为几百纳米，这远远大于分子本身的尺寸。自此以后，阿贝定律一直被认识是光学显微镜的分辨率极限，要想得到更高的分辨率必须使用电子显微镜或者原子力显微镜等其他手段。但是近几年随着单分子技术的成熟以及各种光学技术的发展，人们可以通过不同的途径突破了衍射极限的限制，实现了分辨率为几十纳米甚至更高的超分辨单分子成像。常见的几种技术分别为STORM（Stochastic optical reconstruction microscopy）、dSTORM（Direct stochastical optical reconstruction microscopy）、PALM（photoactivated localization microscopy）和STED（Stimulated emission depletion）等。当然近场光学显微镜同样可以实现小于衍射极限的高分辨成像，这里不做介绍。

（一）STORM和dSTORM

尽管受衍射极限的限制，光学显微镜所得到的最小光斑一般不小于~300纳米，因此当两个或多个光源距离小于衍射极限时，光学显微镜不能对其进行分辨，但是如果知道某个光斑是由一个发光光源所发射，显微镜对其定位精度却可以达到几个纳米量级，基于这种原理华裔科学家庄晓薇组在2006年首先提出了STORM技术（随机光学重构显微镜）8。他们通过利用不同波长的激光，可以控制的对两种不同染料分子进行处于激活态或暗态，使得每次成像时染料分子浓度足够低，可以通过单分子成像对每个染料分子进行精确定位。经过反复重复该过程上千遍甚至更多，对样品中不同位置的染料分子进行成像后，将所有经过精确定位的点重新构成图像即可得到分辨率达到几个纳米的荧光图像。

图5.2.1 STORM原理示意图：位置较近的三个分子（a）同时成像时得到图像（b），如果分别对每个分子成像（c）（d）（e）后，进行精确定位，然后重构得到高分辨图像（f）。

其简单示意图如图5.2.1所示，图中几个分子同时被激发时，荧光显微镜下只能得到一个衍射极限大小的光斑。但是如果可以控制每次成像时只有一个分子发光，其他分子处于暗态，则可以对其进行精确定位。经过多次成像后，即可以得到三个精确定位的分子位置。dSTORM和STORM原理类似，只是将分子进行明态和暗态之间转换的机制不同9。dSTORM是直接利用荧光分子的闪烁性质，选择暗态寿命非常长的荧光分子，使得即使在高浓度标记的情况下，每次成像时处于亮态的分子也是极少数，可以进行单分子成像和精确定位，同样经过许多次反复成像，重新构造高分辨的荧光图像。

（二）PALM

在同一年，Betzig和Lippincott-Schwartz利用相同的原理提出了PALM技术（光激活定位显微镜）10。其基本原理与STORM稍有不同：他们利用一种绿色荧光蛋白作为标记，这种荧光蛋白在未激活状态下没有荧光发生。当选用特定波长的激光（波长1）将其激活后，蛋白分子在另一个较长波长的激光（波长2）下可以进行荧光成像。如果波长1的激光能量非常非常低，每次只能随机激活几个分子，那么在后来的荧光成像时则可以利用精确定位原理得到较高分辨率的分子的位置。此后将波长2的激光能量增高，是所有被激活分子发生淬灭，不再影响后来的成像。再重新用波长1的激光激活另外几个分子……，如此反复，最终得到高分辨的荧光成像。

（三）STED

上述两种技术虽然得到了高分辨的荧光图形，但是从理论上将并未真正打破衍射极限的限制，只是利用单分子定位的技巧实现了精确的分子定位。2000年德国科学家Stefan Hell发明了一种利用荧光损耗原理实现的超分辨荧光显微技术STED11，其基本原理是通过光物理过程减小荧光发射源的面积。由于衍射极限无论从激发角度还是从探测角度，光学显微镜的分辨率都不能突破几百纳米的极限。Hell等人巧妙的利用荧光损耗原理，在衍射极限的激发光斑下，利用另一束环形激光将外围荧光分子强行淬灭回基态，而中间荧光分子则不受影响，进行正常荧光发射。由于外围激光的中心小孔可以非常小，达到几十个纳米，因此在环形激光淬灭后，能够进行荧光发射的样品尺寸可以小到几十个纳米，在这种情况下进行样品扫描或激光扫描则可以得到几十个纳米分辨率的荧光图像。

图5.2.2 STED原理示意图：（a）荧光激发光斑；（b）高能量环形激光；（c）荧光淬灭所得荧光光斑。

STED从物理上提高了成像分辨率，因此并不局限于单分子成像，对于任何荧光样品均适用。

第三节 荧光相关光谱

单分子荧光相关光谱是研究溶液中单分子光谱的重要手段。由于荧光分子在溶液中无法被固定，单分子荧光显微成像技术不再适用，因此人们只能通过荧光分子经过物镜焦点的短暂时间内对荧光分子进行研究。通过荧光相关光谱虽然不能得到单分子图像，但是根据荧光信号的强弱、荧光信号停留时间的长短等信息来对荧光分子以及溶液介质的性质进行分析。下面对荧光相关光谱方法进行简单介绍：荧光相关光谱装置和普通共聚焦显微镜比较相似。只是荧光相关光谱不需要扫描装置，激光和样品台都是固定的。激发光通过物镜聚焦到样品溶液中，而样品中荧光分子的浓度需要足够低，使得每次通过激发光光斑只有一个荧光分子，而且还要足够高，需要再特定的时间内会有分子通过激光光斑。荧光通过收集系统后通常由光电倍增管或雪崩二极管探测。通过对该结果的自相光分子可以得到分子的荧光强度以及通过光斑的时间等参数，从而可以得到荧光分子的扩散性质。