关于你的项目的同行评议意见如下： 1 前期研究表明花生种子发育中有8种DOF基因表达，其功能可能分别与种子粒数、抗病及形态建成有关。本项目拟深入分析这些基因的结构、表达及生物学功能。这几种DOF虽然在种子发育过程中都有表达，但他们可能有不同的功能，前期的初步分析也说明了这一点。建议应该选择功能相似的一两个基因进行重点、深入的研究，突出目标，这样也更容易获得预期结果。将这些功能不同的转录因子放在一起分析的意义不大。不建议资助。 2 1、本项目拟解决的关键科学问题是：DOF基因在种子发育中控制哪些基因的表达，也就是要寻找其调控的靶基因，但是本申请书中并没有给出如何筛选获得靶基因的可行方案。 2、研究内容之三“DOF蛋白生物学功能的研究”中指出：将通过在拟南芥中的过量表达和抑制表达目标蛋白基因，然后通过性状分析来推测目标基因的生物学功能。 在拟南芥中如何能实现花生基因的抑制表达？这说明申请者在分子生物学方面还缺乏基本的认识。 3、本项目申请者认为该项目的难点为拟南芥的转基因，其实拟南芥的转基因技术已经非常之成熟并被广泛应用。申请者应该致力建立花生的转基因技术，以实现对花生基因表达的干涉。 基于以上问题，建议对本项目不予资助。 3 研究花生中表达的DOF的生物学功能虽可能具有一定的应用前景，申请者也做了大量的前期工作，但该申请未能针对DOF的生物学功能提出合理的研究方向，研究内容比较散乱，难以达到预期的研究目标。建议在取得一定的研究结果，或/和确定了明确的研究方向后再申请。 国家自然科学基金委员会 生命科学部 微生物学、植物学 梢后将把申请书放出，欢迎所有同行指正！ 不批也是好事！ 下面是申请书内容: 申请领域：植物资源学，种子生理（全部是植物领域） 1. 项目的立项依据 （研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）； DOF （ DNA binding with one finger ）是植物中一类 N 端含有 C 2 H 2 锌指结构，与含有 -AAAG- 核心序列的 DNA 结合的转录调控蛋白。由于这类蛋白其它区域的多样性，在植物中不同部位和时期起着各种特异的调控作用 。种子发育过程中有多种 DOF 蛋白在形态建成、各种贮藏物质合成的调控中起着重要作用。拟南芥发育中种子中有 18 种 DOF 基因表达 ，花生发育中种子中发现了 8 种 DOF 基因表达 ，其中三种与果实中种子的粒数有关 。其中还有可能与未来植株抗叶斑病有关的基因 ，三个 DOF 基因可能同时与形态建成和抗病性都相关 。 花生种子发育中的形态建成与花生的农艺品质有密切关系，包括蛋白和脂肪含量、产量、抗病性。 DOF 转录调控因子与这些性状有密切关系。瞿礼佳课题组的研究揭示拟南芥中与花生 D08 DOF 同类的基因 AtDof5.6 在维管束发育中起重要作用 ，而 D08 也含有相似保守肽段 。我们的前期实验结果表明 DO8 基因可能与果实中种子粒数有关（未发表结果）。陈受宜实验室证明大豆中 DOF 基因 GmDOF11 和 GmDOF4 对脂肪合成和含量有很强的促进作用 ，且 DOF 最终影响一批基因的转录 。 B06 DOF 基因既与果实中种子粒数有关，也与未来植株叶斑病抗性有关 。 H10 基因类型也与果实中种子粒数明显有关 。这些结果说明 DOF 基因的作用可能比较复杂。已经知道启动子中转录因子之间可能发生复杂有序的相互作用 。孙其信实验室发现小麦中的 DOF 蛋白 WPBF 在植株各类组织中都表达，并与 TaQM 相互作用 。王学臣课题组证明拟南芥 AtDOF4.7 基因与器官的脱落有关，在角果脱落的脱落层特异表达 。 小果中种子数目在果针时期已经显示出来，然而前期的 DOF 蛋白印迹结果非常不明显，但种子发育中的子叶表达量很高，小果（子叶非常小，难以取出）期不同类品种基因表达差异很大 。 DOF 在什么时期开始表达并发挥作用还不完全清楚。 鉴于多倍体作物多是多个基因组发挥作用 , 关于作物中与性状有关基因的研究常用 FRLP 、 SSR 、 SNP 等与遗传连锁作图等分子标记相结合的方法，以及最近多用的基因组学、转录组学、翻译组学、代谢组学方法。最近使用较多的有将相对性状的基因组文库序列互为对照，根据分子标记的连锁群资料（特定连锁的与性状有关的基因，包括 SNP 密集序列），从其中筛选出现频率差异序列 (bulked segregant analysis) ，结合高通量序列分析，从而确定与性状有关的基因和功能 。这些方法都是围绕着特定性状寻找相关基因。我们将采用前期自己创造的方法，结合基因芯片、 QTPCR 、蛋白质杂交等方法进行研究。 我们的研究将涉及已知的几个特定基因在四倍性花生基因组中探索其是否多倍性、连锁性和异同性，以及序列异同性与性状的关系和作用机制。我们前期工作已经证明同一品种花生中存在两种不连锁的 H10DOF 基因，且其序列特性可能与种子粒数相关。目前我们对花生发育中种子中表达的 DOF 的研究结果是在对 26 个不同品种的 5 种 DOF 基因进行了克隆和分析的基因组序列基础上得到的，加上合作单位同事对不同处理表达分析和我们自己所做的 H10 基因分析、蛋白印迹等工作得到的初步结果，因此还有大量深入细致的工作需要进行。如各种上述 DOF 基因在四倍体基因组中的数目、种类、分布需要进一步验证，表达控制、蛋白互作、目标基因、功能等其详细作用机理有待深入探讨。此外，花生中的 DOF 基因虽然能在研究过的植物 DOF 家族中归为某大类，但相似度非常低，很难确定它们的功能也属同类 。 参考文献 1. . 郭晓芳 , 严海燕 . 植物中的 Dof 蛋白和 Dof 转录因子家族 . 植物生理学通讯 , 2005,41(4): 419-423 。 . 2. Day RC, Herridge RP, Ambrose BA, Macknight RC. Transcriptome analysis of proliferating arabidopsis endosperm reveals biological implications for the control of syncytial division, cytokinin signaling, and gene expression regulation. Plant Physiol, 2008 ， 148, 1964- 1984. 3. Yan H, Huang J, Liao B, Lan X, Luo Q, Tang J. DOF transcription factors in developing peanut ( Arachis Hypogaea ) seeds. American J Mol Biol, 2012 ， 60-71. 4. Yan H, Suo H, Liao B, Ren X. Study on H10 DOF transcription factor in peanut from different cultivars. Submitted 5. Guo Y, Qin G, Gu H, Qu L. Dof5.6/HCA2, a Dof transcription factor gene, regulates interfascicular cambium formation and vascular tissue development in arabidopsis. Plant Cell, 2009, 21, 3518-3534. 6. Wang H, Zhang B, Hao Y, Huang J, Tian A, Liao Y, Zhang J, Chen S. The soybean Dof-type transcription factor genes, GmDof4 and GmDof11 , enhance lipid content in the seeds of transgenic arabidopsis plants. Plant J, 2007, 52, 716-729. 7. 陈泽宇，左欣欣，严海燕 *. 不同花生品种 B06 基因的克隆与序列分析及蛋白质预测，广西农学报， 2011 ， 6 （ 3 ） , 25-31 。 8. Vicente-Carbajosa J, Moose SP, Parsons RL, Parsons RL ， Schmidt RJ. A maize zinc-finger protein binds the prolamin box in zein gene promoters and inter-acts with the basic leucine zipper transcriptional activator Opaque2. PNAS, 1997 ， 94, 7685-7690. 9. Diaz I, Vicente-Carbajosa J, Abraham Z, Martínez M, Isabel-La Moneda I ， Carbonero P. The GAMYB protein from barley interacts with the DOF transcription factor BPBF and activate endosperm-specific genes during seed germination. Plant J, 2002 ， 29, 453-464. 10. Dong GQ, Ni ZF, Yao YY, Nie XL ， Sun QX. Wheat Dof transcription factor WPBF interacts with TaQM and activates transcription of an alpha-gliadin gene during wheat seed development. Plant Mol Biol, 2007 ， 63, 73-84. 11. Wei PC, Tan F, Gao XQ, Zhang XQ, Wang GQ, Xu H, Li LJ, Chen J, Wang XC. Overexpression of AtDOF4.7, an Arabidopsis DOF family transcription factor, induces floral organ abscission deficiency in Arabidopsis.Plant Physiol ， 2010 ， 153(3) ， 1031–1045. 12. Yan H ， Zong C ， Shan S. Two distinct vesicle trafficking patterns in developing peanut seeds related to Aspergillus Flavus resistance and sensity respectively. Submitted 13. Pomraning KR, Smith KM, Freitag M. Bulk Segregant Analysis followed by high-throughput sequencing reveals the neurospora cell cycle gene, ndc-1, to be allelic with the gene for ornithine decarboxylase, spe-1. Eukaryot Cell ， 2011 ， 10(6) ， 724–733. 14. Magwene PM, Willis JH, Kelly JK. The Statistics of Bulk Segregant Analysis using next generation sequencing. PLoS Comput Biol ， 2011 ， 7(11) ， e1002255. 15. Chen X, Hedley PE, Morris J, Liu H, Niks RE, Waugh R.Combining genetical genomics and bulked segregant analysis-based differential expression: an approach to gene localization. Theor Appl Genet ， 2011 ， 122(7) ， 1375–1383. 16. Wenzl P, Raman H, Wang J, Zhou M, Huttner E, Kilian A. A DArT platform for quantitative bulked segregant analysis. BMC Genomics ， 2007 ， 8 ， 196. 17. Becker A, Chao D, Zhang X, Salt DE, Baxter I. Bulk Segregant Analysis Using Single Nucleotide Polymorphism Microarrays. PLoS One ， 2011 ， 6(1) ， e15993. 2. 项目的研究内容、研究目标 , 以及拟解决的关键科学问题 （此部分为重点阐述内容） ； 研究内容如下： 一、 DOF 基因和蛋白结构和本质的研究 根据目前已经获得的 26 个品种中 5 种 DOF 基因的种类和编码的蛋白之间的差异对代表性品种进行相关基因在基因组中的拷贝数和种类进行研究，确定该基因在基因组中相似基因的数目和种类。根据基因序列进行蛋白质几个水平的结构分析。 二、 DOF 基因表达分析 分析各类基因中能够以 RNA 和蛋白形式表达的相似基因数目和类型，确定其在 RNA 和蛋白合成过程中被调控的可能途径。 分别通过酵母杂交系统研究各种 DOF 蛋白之间以及同种 DOF 蛋白内变异体之间相互作用和与 DNA 作用的情况。由此分析几种 DOF 之间是否有互作的功能。如果时间允许，也探索与 DOF 作用的蛋白种类。如果有可能对已知蛋白进行纯化和测序分析。 三、 DOF 蛋白生物学功能的研究 研究 DOF 蛋白的功能可以通过几种不同的途径进行。首先通过含有目标 DOF 蛋白的不同基因型的不同品种的基因转录组、生物学性状（组织细胞水平和整体水平等多种指标）的比较分析其功能性差异。其次，进一步通过在拟南芥过量表达和抑制表达该目标蛋白基因型的生物学性状分析比较，进一步推测该目标基因的生物学功能。 本项目的研究目标： 揭示几种花生发育中种子中表达的 DOF 基因在花生植株中的生物学功能以及可能的作用机理。本项目从基因组中 DOF 基因的组成和结构， DOF 蛋白质的结构和组成、 DOF 基因表达的转录水平和蛋白质翻译后水平的相互作用来了解 DOF 基因作用的分子机制。同时将通过充分的具有不同性状的品种间 DOF 基因的结构和组成以及在不同时间和部位表达的差异初步推测相应基因的生物学功能。进一步通过过量和抑制表达相应基因和蛋白研究其生物学功能。 本项目拟解决的关键科学问题是： 1. 几种花生发育中种子中表达的 DOF 基因在种子发育中控制哪些基因表达？与生物学那些性状有相关性？ 2. 特定类型的 DOF 基因在 RNA 和蛋白水平的表达类型如何？ 3. 拟采取的研究方案及可行性分析。 （包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）； 一、 研究方法： （一）、 PCR 克隆和鉴定每种 DOF 基因在基因组中的种类和相似基因的数目。 根据对 26 个品种中三种 DOF 基因序列类型的分析结果和品种间性状差异的相关性，选取相应的品种种植，并从叶片中提取基因组 DNA 。 以基因组 DNA 为模板，根据原始的三种 DOF 序列设计的引物进行 PCR ，采集所有阳性产物，克隆到 T 载体中，验证阳性后测序检测是否同类 DOF 基因。然后保留每一个同类 DOF 基因连接产物转化大肠杆菌后得到的阳性菌株群（表 1 ） 。本研究针对每一种基因将多设计几对引物进行分析，并选择代表性克隆测序鉴定。同时选用特异序列 PCR 制备探针，进行 Southern 杂交进行检测 。 Table 1 The ratio of no-insert: insert of a 1062 sequences are different between different cultivars Indor MY4 NcA927 YCG12625 ICG6326 Xh3 Nek16940 DF S162-a1469 10 8 9 8 7 N/I* 3:7 5:3 1:8 1:5 6:1 ?:3 ?:3 ?:1 Seed Numbers 3 3 3 3 2 2 2 2 *N-no insert; I-s162-a1062 positive. Cultivars are marked with underline ?-not determined 根据每种 DOF 基因中的不同基因设计特异引物和共性引物，使其符合连锁检测标准。对上面的每一类 DOF 基因的阳性菌株群，进行符合统计学数目的单个菌株的 PCR 检测，并选择代表性的菌株测序鉴定。数据用来进行不同类同种 DOF 基因之间的连锁分析 。 （二）、各种相关花生种子中表达的 DOF 基因转录表达的研究 本研究将根据每种 DOF 基因中保守的和变异序列设计引物，分析相应类型基因在不同品种和转基因（见后）品种植株各时期部位的表达情况，分析 RNA 水平调控机理。 采取和收集几种与三种 DOF 基因型有关特性的代表性品种花生的叶、茎、根、雌蕊、果针、小果、小种子时期的种皮、子叶、果皮，提取 RNA ，进行反转录，获得 cDNA ，然后用上面每种 DOF 基因各类基因型共同和特异引物进行 PCR 检测，同时选择性克隆特异带并测序，看每种 DOF 基因转录的种类、在花生中表达的时期和部位。 图 1. 用 DOF 保守区域不同引物对发育中种子中 cDNA PCR 的产物 根据上述结果，选择关键时期的具有相对性状代表性品种材料送到公司，用根据 3 万多条花生 cDNA 合成的序列制备的基因芯片进行品种间基因组水平转录表达差异分析。 （三）、各种相关花生种子中表达的 DOF 蛋白的表达和结构分析 图 2. 用 DOF 保守区域的抗体对发育中种子总蛋白所做的蛋白质印迹分析 本研究将根据分析所得的结果设计和合成关键肽段序列，并用其制备抗原和抗体，用来进行相关蛋白在各类关键品种的植株中表达分布情况的分析，例如我们已经做的工作（图 2 ）。 例如：三种 DOF 蛋白共有序列、 H10B 类特异的抗原肽设计和抗体的制备，蛋白质材料的制备和杂交 。 本研究将采用酵母单杂交系统对几种 DOF 蛋白进行蛋白与 DNA 互作分析，研究几种 DOF 作用目标 DNA 的异同。本研究还将采用酵母双杂交系统分析几种 DOF 蛋白之间的相互作用能力，以及寻找与 DOF 蛋白可能结合的蛋白。 本研究将采用蛋白结构预测和互作软件进一步分析几种 DOF 蛋白与 DNA 和蛋白质之间的互相作用如已经做的部分工作（图 3 ） 。 图 3. A 和 B 类 H10 蛋白预测的三维结构对比 四、各种花生转基因品系和品种生物学性状比较 根据蛋白表达和酵母双杂交实验结果的分析，每种 DOF 基因中选择代表性的序列，构建 GFP 或 GUS 标记的植物转基因载体 , 用拟南芥做材料，进行转基因并对阳性转基因植株进行基因芯片和生物学性状分析。 对各种代表性品种的农艺和生物学性状根据其发育时期、部位进行详细描述和记录，包括细胞学、组织学水平的观察。并根据基因转录组学的结果进行选择性的组织和细胞水平的基因表达分析。 参考文献 1. 严海燕主编，副主编，丁益，吴元喜，李晓华，刘新琼，肖靓，谢青，江雪原，陈思礼，陈江宁，臧宇辉。基因工程与分子生物学实验教程 武汉大学出版社。 2009.8 2. Yan H , Huang J, Liao B, Lan X, Luo Q, Tang J. DOF Transcription Factors in Developing Peanut ( Arachis Hypogaea ) Seeds. American J Mol Biol, 2012 ， 2 ， 60-71. 3. Wei PC, Tan F, Gao XQ, Zhang XQ, Wang GQ, Xu H, Li LJ, Chen J, Wang XC. Overexpression of AtDOF4.7, an Arabidopsis DOF family transcription factor, induces floral organ abscission deficiency in Arabidopsis.Plant Physiol ， 2010 ， 153(3) ， 1031–1045. 二、技术路线 对每种 DOF 基因： PCR 克隆 DOF 基因，并在十个以上阳性克隆进行多种引物的 PCR 鉴定和测序鉴定，统计和分析结果， Southern 杂交 对每个品种各时期和部位的材料提取 RNA, 并反转录，进行 RTPCR 检测各类 DOF 的表达情况 对每个品种各时期和部位的材料提取蛋白质，用抗体进行蛋白质印迹分析 合成特异抗原，制备抗体 选取具相对性状品种的 DOF 表达关键时期的材料送公司用基因芯片进行转录组差异表达分析 进行每种 DOF 在品种内和品种间的基因结构、数目和遗传重组关系分析 分析品种内和品种间表达的 DOF 蛋白的种类和时期、部位 预测蛋白质二维结构、三维结构、结构内酶修饰和作用位点，由此预测分子和细胞水平其加工运输和调控机制 由差异表达分析 DOF 基因所影响的转录组水平基因表达的类型，由此分析其生物学功能 初步分析 DOF 类型中各类可能的功能 构建主要类型 DOF 基因常表达和抑制表达植物转基因载体，转入拟南芥 分析转基因拟南芥的分子、细胞和生物学性状的改变，分析其生物学功能 构建表达各类 DOF 蛋白的酵母双杂交载体，分析各类 DOF 蛋白之间相互作用的可能性（根据情况选择性执行） 分析 DOF 作用的分子机制 三、关键技术 本研究采用的关键技术有：植物材料 DNA 、 RNA 的提取、反转录、分别以 DNA 、 cDNA 、菌液为模板、不同引物对的 PCR ，总蛋白质的提取、特异抗原多肽的合成、抗体的制备，蛋白质印迹和特异抗体的杂交、酵母双杂交、由公司用三万多条寡聚碱基组成的花生基因芯片进行的转录组水平品种间基因差异表达分析。 DOF 基因常表达和抑制表达的转拟南芥生物学性状分析。 这些技术中只有转基因一项是难点，关键在于项目持续的时间可能很紧张。其他技术申请人都十分娴熟。 4. 本项目的特色与创新之处； 本项目集中针对发育中花生种子中表达的 DOF 基因进行研究，这类研究在花生领域中是独一无二的研究。本项研究是 2004 年由本项研究的主持人开始并持续进行的。所研究的几种 DOF 基因都是未有研究过。尽管在拟南芥和大豆中对 DOF 基因分别进行过不同程度的研究，而且进行过系统分类，但物种之间的基因和蛋白结构还是有很大差异，同类型蛋白之间仅有几处保守肽段相似，它们是否具有相似类型的功能未知。而且花生种子发育中有一半以上 DOF 基因很难归类，找不到相似基因。因此对这些基因的研究是前所未有的工作。 5. 年度研究计划及预期研究结果。 （包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）。 年度研究计划 2013 年 1 月 -2013 年 12 月 对三种发育中种子中表达的 DOF 基因进行基因组中种类、数目以及连锁特性的研究，构建植物过量表达和抑制表达的转基因载体。同时开始合成抗原，制备抗体。 2014 年 1 月 -2014 年 12 月 对代表性品种特定时期的材料进行基因转录（ RNA ）和蛋白表达分析，包括用基因芯片杂交进行表达分析。用构建的植物转基因载体对拟南芥进行转化。构建酵母单杂交和双杂交载体。 2015 年 1 月 -2015 年 12 月 继续酵母单杂交和双杂交研究 DOF 蛋白与 DNA 和其他 DOF 蛋白的相互作用。对用于进行基因芯片杂交的品种进行生物学性状分析，包括组织细胞学分析。 2016 年 1 月 -2016 年 12 月 总结实验结果，写论文。 预期研究结果 查明三种 DOF 基因在花生基因组中的种类、数目以及同类 DOF 基因之间的连锁性。检测三种 DOF 蛋白之间和同类 DOF 蛋白之间是否相互作用，观察 DOF 基因在转录和翻译水平表达情况，以及受其影响的基因，结合生物学性状和品种间表达差异分析，由此分析研究它们可能的功能和作用机制。 本研究将发表 10 篇以上论文，包括高水平 SCI 论文。培养研究生 6-7 人，本科生若干。 （二）研究基础与工作条件 1 、 工作基础 （与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）； 我们 2004 年就开始了花生发育中种子中 DOF 类基因研究，是国内外首次对花生中 DOF 基因进行研究的唯一小组， 2009 年暑假从中国农科院发育中种子的 cDNA 文库中扫描得到了 8 种 DOF 基因，并得到克隆菌株，经过检测和全长序列测序，得到了较为完整的 mRNA 序列。随后申请人对 8 种 DOF 基因进行了较为全面的生物信息学比较分析和研究，克隆了 26 个不同性状品种的 5 种 DOF 基因共 130 个基因，对其中的 H10 基因用 PCR 进行了统计分析和蛋白印迹反应分析，加上几年中申请人对目前已经存在的所有关于 DOF 基因和其蛋白作用的启动子的大量的文献检索和生物学信息学分析的工作，为进一步深入研究 DOF 基因奠定了强有力的理论和实验基础。目前申请人在 DOF 基因方面已经发表的论文有三篇 ，另有一篇投稿之中 。此外申请人本人一直在亲自做实验， 130 个基因中，一半是申请人 20 多天克隆得到的，技术已经达到从 PCR 到得到检测阳性的克隆只需三天时间，而且只要 PCR 结果有明显的阳性带，得到阳性测序结果是 100% 。此外 H10 基因的其他 PCR 统计学分析和从抗原抗体制备到杂交过程全部是申请人独自进行，并获得好的结果 。申请人在 RNA 提取和反转录技术上也十分娴熟，在申请人指导下不仅将省钱的 CTAB 试剂 RNA 提取法成功地推广应用到本科生大实验中 ，还应用到动物 RNA 的提取中 。申请人在植物组织培养和转基因以及组织细胞学实验技术方面也有丰富的经验 。 1. 郭晓芳 严海燕 , 植物中的 Dof 蛋白和 Dof 转录因子家族 , 植物生理学通讯 , 2005,41(4): 419-423 。 2. 陈泽宇，左欣欣， 严海燕 * ，不同花生品种 B06 基因的克隆与序列分析及蛋白质预测，广西农学报， 2011 ， 6 （ 3 ）： 25-31 。 3. Haiyan Yan , Jiaquan Huang, Boshou Liao, Xianqing ,Lan, Qiuting Luo, Junlong Tang. DOF Transcription Factors in Developing Peanut ( Arachis Hypogaea ) Seeds. American J Mol Biol, 2012 ， 2 ， 60-71. 4. Haiyan Yan, Zhenling Huang, Hui Suo, Boshou Liao, Xiaoping Ren. S tudy on H10 DOF transcription factor in peanut from different cultivars . submitted 5 . 严海燕 主编，副主编，丁益，吴元喜，李晓华，刘新琼，肖靓，谢青，江雪原，陈思礼，陈江宁，臧宇辉。基因工程与分子生物学实验教程 武汉大学出版社。 2009.8 6. 左欣欣，陈泽宇，马腾， 严海燕 * ，谭艳平 . 从动物组织中提取总 RNA 的 CTAB 法 , 中国西部科技， 2011 ， 1 ， 35-36 转 76. 7. 严海燕 曹日强 . 紫草组织培养中细胞发育时期与紫草宁形成关系的研究 . 中草药， 2001 ， 32 （ 3 ）： 264-266. 8. 严海燕 曹日强 . 紫草愈伤组织培养中紫草宁形成的影响因素 . 华北农学报， 2002, 17 （ 2 ）， 116-120. 9. 王静， 严海燕 * ，康强胜 . 一种花生植物转基因载体的构建，中国科学院武汉植物园 武汉植物学研究， 2005 （ 6 ）， 514-518. 2 、 工作条件 （包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况）； 申请人使用本人的办公室、教研室实验室和本院生物技术和生物工程两个省级重点综合实验室进行研究。教研室实验室具有光照培养箱和恒温培养箱、摇床、超净工作台、台式离心机， PCR 仪、电泳仪和电泳槽（但用的人多，不够用）。重点综合实验室各种设备齐全，具有国内一流的仪器装备，如激光共聚焦显微镜、荧光定量 PCR 仪等。 3 、 承担科研项目情况 （申请人和项目组主要参与者正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）； 山东花生研究所合作研究：花生黄曲霉抗性与敏感品种发育中种皮基因差异表达的分析 4.477 万。 HZY05013 ，起始于 2005 年。负责人和执行人，所得的大量数据可为本项目提供参考信息。钱已经用光，没有结题之说。发表文章四篇，一篇英文已经投稿。 湖北省自然科学基金：发育中花生种子 DOF 基因的克隆 2 万， 2005ABA075 ，起始于 2005 年。是本项目的基础，钱已花光，发表文章 3 篇，一篇英文待修改和补充。目前的结果尚未被接受作为可结题结果，已经在自费继续实验。 中南民族大学校基金：扁豆茎表皮基因表达类型分析 4.5 万， YZZ06004 ，起始于 2006 年。该项目目标已经完成，发表两篇文章。钱已经用光。尚未被批准结题。与本项目无关。 4 、完成自然科学基金项目情况 （对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限 500 字）和相关成果的详细目录）。 没有得到过国家自然科学基金的资助。 （三）经费申请说明 购置单项经费 5 万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。 PCR 仪（能进行巢式 PCR ）是本研究必需的仪器，之前申请人一直用本科教学专用的 PCR 仪。北京六一仪器厂的电泳仪（能做蛋白质转膜）、水平和垂直电泳槽、转膜槽，也是本研究大量和必需使用的仪器。阳台和走廊改建培养室和温室，植物转基因和生物学性状分析必需。 （四）申请人简介 （包括申请人和项目组主要参与者的学历（从大学本科开始）和研究工作简历，近 3 年来已发表的与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。论著目录要求详细列出所有作者、论著题目、期刊名或出版社名、年、卷（期）、起止页码等；奖励情况也须详细列出全部受奖人员、奖励名称等级、授奖年等） 1 、个人简介（应包含本项目中承担的任务） 近五年申请人严海燕以发育中花生种子为主要研究对象，从基因、蛋白、组织细胞学多个水平综合研究种子发育过程中形态建成、贮藏物质种类与合成以及黄曲霉抗性调控的机制。在五年前用大豆发育中种子 3 万多条转录子所做的基因芯片对高脂肪 / 高蛋白、黄曲霉抗性 / 敏感品种发育中子叶和种皮分别进行的差异表达分析和对发育中种子 DOF 基因研究的基础上，通过近五年对黄曲霉抗性和敏感品种差异表达分析和生物学信息的研究，提出了花生果实发育中小果阶段细胞学水平的小泡运输途径的主要类型在抗性品种和敏感品种中不同（ 4 ， 5 ， 6 ， 13 ），这种不同可能涉及发育过程中合成代谢方向的不同。申请人对合作者提供的从较为完善的花生发育中种子 cDNA 文库中得到的 8 种 DOF 基因进行了全长测序和充分的生物信息学分析。初步克隆了 26 个品种的 5 种 DOF 基因（共 130 个，本人亲自克隆有一半，几个本科生克隆了一半，自费测序（ 5700 元）），并对其中的 H10DOF 基因进行了进一步的类型分析和蛋白质印迹分析（后期蛋白印迹试剂自费，几个项目有关的论文发表全部自费，实验独自完成）。 此外，申请人严海燕对扁豆红色茎表皮基因表达类型进行了分析，并利用生物信息学方法从拟南芥茎表皮和茎心转录组数据中找到相似基因的表达差异，与扁豆茎表皮与茎心定量 PCR 分析差异表达比较，提出茎表皮不仅是防御器官，还是对各种信号感知的器官。 近五年来，申请人严海燕阅读了大量文献，独自写作完成了“植物发育分子生物学”教材，并编写了“基因工程与分子生物学实验”教材。 2 、大学开始受教育经历 例：××年－××年，单位，院系所，学历 / 学位，导师 · 1979 年 -1983 年，武汉大学，生物系遗传专业，学士，毕业论文导师徐乃瑜 · 1986 年 -1989 年，南京大学，生物系植物生理专业，硕士，导师曹日强 · 1991 年 -1997 年， University of Arkansas, Horticulture department, plant sciences, Ph D, 导师 JB Murphy. 3 、研究工作经历 例：××年－××年，单位，院系所，职务 · 1983 年 -1986 年，河南师范大学，生物系遗传教研室，助教 · 1989 年 -1991 年，中国科学院北京植物研究所， 实习研究员 · 1997 年 -1999 年，中国农业大学，园艺系， 博士后 · 1999 （ 8 ） -2000 年，北京大学，生物技术系， 7 级讲师 · 2000 年 -2001 年，康乃尔大学，作物土壤系，博士后（ research associate ） · 2001 年 -2003.3 ，郑州大学，生物工程系，副教授， · 2002 年 10 月 -2006 年 4 月，中国科学院，武汉植物研究所，首席研究员 · 2006 年 4 月 - 迄今， 中南民族大学， 生命科学院，教授 4 、科研成果 近三年论著： · 严海燕 ，郭晓芳， 利用花生 Arah3 启动子转基因载体的制备方法及应用 专利号： ZL 2006 1 0018770.4 中国科学院武汉植物园 授权公告日： 2010 年 4 月 7 日 · 左欣欣，陈泽宇，马腾， 严海燕 * ，谭艳平 . 从动物组织中提取总 RNA 的 CTAB 法 , 中国西部科技， 2011 ， 1 ， 35-36 转 76 。 · 宗成志，左欣欣， 严海燕 * ，影响 RNA 提取质量的因素分析。广西农学报 ， 2011 ， 26 （ 1 ）： 31-34 · 严海燕 ，宗成志，景聪慧，单世华， 花生黄曲霉抗性与类受体蛋白激酶的相关性分析，华北农学报， 2011 ， 26(4): 198-201. · 严海燕 ，宗成志，马国华，单世华，核糖体蛋白 L41 与黄曲霉抗性的关系， 华北农学报， 2011 ， 26(6): · 严海燕 ，宗成志，包文志，单世华，花生黄曲霉抗性与糖原合成酶激酶 -3 的关系 , 华北农学报， 2011 ， 26 (5):1-8 · 严海燕 ，科研与分子生物学技术实验教学的整合，中国西部科技， 2011 ， 242 ： 66-67 · 赵瑞杰 严海燕 * 谭艳平 王朝元 林爱华， CTAB 法提取动物 DNA ，中国西部科技， 2011 ， 254 ： 7-8 · 陈泽宇，左欣欣， 严海燕 * ，不同花生品种 B06 基因的克隆与序列分析及蛋白质预测，广西农学报， 2011 ， 6 （ 3 ）： 25-31 。 · Haiyan Yan , Xumin Wang, Jun Yu, Kang Dai , Yanan Chu ， Comparative gene expression analysis in stems of Dolichos purpureus and Arabidopsis thaliana . American J Mol Biol, 2012 ， 2 ， 72-84. · Haiyan Yan , Jiaquan Huang, Boshou Liao, Xianqing ,Lan, Qiuting Luo, Junlong Tang ， DOF Transcription Factors in Developing Peanut ( Arachis Hypogaea ) Seeds. AJMB, 2012 ， 2 ， 60-71. · 严海燕 编著，植物发育分子生物学，科学出版社， 2012 · Haiyan Yan ， Chengzhi Zong Shihua Shan. Two distinct vesicle trafficking patterns in developing peanut seeds related to Aspergillus Flavus resistance and sensity respectively. （投稿中） · Haiyan Yan, Zhenling Huang, Hui Suo, Boshou Liao, Xiaoping Ren. S tudy on H10 DOF transcription factor in peanut from different cultivars . （投稿中） （五）其他需要说明的问题 （六）附件 Cover Letter of paper “ S tudy on H10 DOF transcription factor in peanut from different cultivars” H10 DOF gene expressed in developing peanut seeds is studied in this paper. Two groups of H10 DOF genes were found existing in peanut genome of cultivated strains. The first group is encoded by S30-a1469 PCR products, they are highly conserved with almost 100% similarity in 16 cultivars studied, possible is the essential regulation factor in seed development. The second group of H10 DOF gene is encoded by PCR products with S162-a1469, two types of H10 genes are seperated from PCR products with s162-a1469, type A is the same as group I. Type B has multiple differences from type A in the sequence. Type B H10 gene is not located on the same chromesome as Group I H10 DOF gene. Ratio of type A/type B is related to the seed number per fruit. These results are confirmed by analysis on sequences from 26 cultivars with different sets of primers, and PCR results from different cultivars and clones from same cultivars with different primers. With different forward primers paired with the same insert reverse primer, PCR with the first primer set do not have product, but with the second set of primers have different products. Multiple difference coordinatedly exist in two types of sequences, which are not possible mutated only one time, thus they are possiblly from different origin. H10 DOF gene is specifically expressed in developing cotyledons displayed by western blot on proteins from different tissues. Removing of N-terminal sequence of the first type of H10 DOF proteins is possible necessary for activation of H10 DOF transcription factor by tree dimension structure, regulation site and enzyme site analysis. DOF transcription factors play important roles in both developing process and formation of storage material in seeds development. Very few study has been conducted on molecular mechanism in developing peanut fruit till now. H10 DOF gene is one of DOF genes expressed in developing seed. This study conducted the relatively integrated analysis on H10 DOF genes and proteins in peanut at first time. This study provided basic information and possible role of H10 DOF protein. Two types of H10 DOF proteins exist in peanut genome indicates that reguation mechanism is mediated by coordination of similar proteins or genes, besides the essciential function of the conserved H10DOF, the similar but different H10 DOF gene play important regulation role. The result provided reference information for planning on breeding between cultivars. In addition, we provided a new and simple PCR method to identify the similar genes on the same or different chromosomes, and at the same time, discriminate if they are from the same genes. This method is based on Mendel principle at molecular level with PCR method, determing the linkage and allele between similar genes without growing plant in field. The method can also be used for discriminating genes with fine difference in other plant with multiple genomes.
近日来自浙江大学生命科学学院的研究人员在新研究中揭示了对TGFβ信号传导通路起重要调控作用的一个蛋白磷酸酶。这一研究成果“PPM1A dephosphorylates RanBP3 to enable efficient nuclear export of Smad2 and Smad3”公布在国际权威期刊《EMBO Reports》上。 近日来自浙江大学生命科学学院的研究人员在新研究中揭示了对TGFβ信号传导通路起重要调控作用的一个蛋白磷酸酶。这一研究成果“PPM1A dephosphorylates RanBP3 to enable efficient nuclear export of Smad2 and Smad3”公布在国际权威期刊《EMBO Reports》上。 领导这一研究的是2009年起担任浙江大学生命科学研究院院长的冯新华教授，其早年毕业于武汉大学，重要研究方向是分子信号转导、蛋白质修饰及其在疾病发生和发育过程中的功能。在迄今在国际权威杂志如Cell、Molecular cell、Nature等上发表论文80余篇，总被引用超过5000次。 QIAGEN 隆重推出体细胞突变筛查试剂盒，点击获取相关资料 转化生长因子-β(TGF-β)是一个包括数十种TGF-βs、骨形态发生蛋白(BMPs)等配体在内的生长因子超家族。近年来大量的研究表明TGF-β信号通路控制着一系列的细胞反应，包括细胞增殖、分化、细胞外基质重建和胚胎发育。TGF-β信号转导异常与多种疾病如肿瘤的起始和转移、组织纤维化，自身免疫性疾病及心脑血管疾病有关。Smad2和Smad3 (Smad2/3)是TGFβ信号传导通路中重要的信号传导因子。 在这篇文章中，研究人员揭示了一个调控TGFβ信号通路的关键蛋白磷酸酶PPM1A。体内外实验表明PPM1A可直接与输出蛋白RanBP3发生相互作用，使得RanBP3第58位丝氨酸发生去磷酸化。与此相一致的是，研究人员在PPM1A敲除小鼠胚胎成纤维细胞中检测到RanBP3磷酸化水平增高。进一步的分析表明，第58位丝氨酸去磷酸化使得RanBP3被激活，将Smad2/3输出核外，从而导致了TGFβ信号通路的终止。 新研究证实了蛋白磷酸酶PPM1A对TGFβ信号通路的重要调控功能及分子作用机制。并为研究人员开发出TGF-β信号转导异常导致多种疾病的有效治疗策略提供了一个潜在的靶点。 PPM1A dephosphorylates RanBP3 to enable efficient nuclear export of Smad2 and Smad3 Smad2 and Smad3 (Smad2/3) are essential signal transducers and transcription factors in the canonical transforming growth factor-β (TGF-β) signalling pathway. Active Smad2/3 signalling in the nucleus is terminated by dephosphorylation and subsequent nuclear export of Smad2/3. Here we report that protein phosphatase PPM1A regulates the nuclear export of Smad2/3 through targeting nuclear exporter RanBP3. PPM1A directly interacted with and dephosphorylated RanBP3 at Ser 58 in vitro and in vivo. Consistently, RanBP3 phosphorylation was elevated in PPM1A-null mouse embryonic fibroblasts. Dephosphorylation of RanBP3 at Ser 58 promoted its ability to export Smad2/3 and terminate TGF-β responses. Our findings indicate the critical role of PPM1A in maximizing exporter activity of RanBP3 for efficient termination of canonical TGF-β signalling.
番茄果实的发育可以分为四个主要时期：座果期、细胞分裂期、细胞体积扩展期和成熟期。而前三个时期是决定果实最终大小和形状的关键时期。目前已克隆的几个控制番茄果实大小和形状的QTL位点中 fw2.2, ovate, fasciated 均在开花前决定了表型，最近克隆的 SUN 主要在开花后起作用 1, 3 。但这些基因的作用机理多不清楚。总的来说，我们对番茄早期果实生长和发育(细胞分裂期前后)的认识还非常缺乏。利用组学手段，我们鉴定出了大量在番茄果实早期发育过程中特异表达的基因 3 。我们拟通过功能分析，重点研究几个转录因子在番茄果实早期生长发育过程中的作用，以增加对番茄果实早期发育的新认识。 Jiang N., Gao D., Xiao H. , van der Knaap E. (2009) Genome organization of the tomato sun locus and characterization of the unusual retrotransposon Rider. Plant J . 60(1):181-193 Xiao H*. , Radovich C*., Welty N*., Hsu J., Li D. Meulia T., van der Knaap E. (2009) Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN on fruit shape. BMC Plant Biology . 9:49. (*, co-first author) Xiao H*. , Tang J*., Li Y*., Wang W., Li X., Jin L., Xie R., Luo H., Zhao X., He G., Zhu L. (2009) STAMENLESS 1, encoding a zinc finger protein of C2H2 type, regulates rice floral organ identity. Plant J . 59(5):789-801. (*, co-first author) Xiao H. , Jiang N., Schaffner E., Stockinger EJ., van der Knaap E. (2008) A retrotransposon-mediated gene duplication underlies morphological variation of tomato fruit. Science . 319:1527-1530 (cover story)
标签: 发育过程
