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低温冷冻电镜的门道和方法学: 热度 12 liwei999 2015-5-6 06:28; 外行看热闹，内行看门道作者: mirror (*) 日期: 05/05/2015 17:12:25 《外行看热闹，内行看门道：从低温冷冻电镜的近热看创新》是个好文章。虽然王博主对低温冷冻电镜的理解还不到位，但是对方法学重要性的认识还是相当深刻的。方法学的重要性大约没有人会否定。但是科学共同体 “集体出错” 的事情时有发生。“集体出错”的事例有许多：比如法英的协和号飞机，比如美国航天飞机，都是这类错误的代表。曾几何时，有过一些人主张用X线激光解析（单分子）蛋白质的结构问题。直到Cryo-EM对（单分子）蛋白质的结构解析成功后，用X线激光（FEL）做结构分析的事儿才算是没人提了，改提时间分辨了。时间分辨能走多远？镜某不知道。作为研发，X线激光技术还是要做下去的。只是不要扯那些不靠谱的理由来做目的。透过电镜（TEM）的分辨率当初并不很高，原因在于“镜头”的收差（像差等）。放弃修正像差方法的思考导致了Dennis Gabor发明了全息照相。当初相机透镜的设计比较困难，主要依赖于工程师的经验，一年也设计不出几套镜头。电镜的领域里也是这个状况。计算机技术发达后，对“镜头”的收差的分析可以做得很好，因此可以设计出很好的镜头（组）改善电镜的分辨率。这是分辨率发达的一个主要动力。其次，电镜技术的90%在于做样品。有了好的样品，谁都可以看到结构。这是电镜优越于X射线（衍射）的地方。换言之，如果蛋白质从晶体缩小到（单）分子的话，几乎就没有X射线晶体学的立身之地了。这个问题做FEL的人与其说是看不出来，不如说是不愿意去看、去想。低温，一个理由是为了保证样品投影像的信噪比（热运动），一个是保护样品的电子束流照射的损伤（强照明）。至于为何液氮温度比液氦好，理由在于液氮温度时的水的相态不妨碍电镜的观察分子结构。低温在电镜技术里并不新鲜，也没有难度。低温电镜能获得成功的另一个技术是图像处理。量子力学的一个支柱是统计学。如果单分子的结构测试成功了的话，其结果必然是需要测试很多个同样的单分子。因此，单分子的结构解析的工作就成了 “图像处理” 的工作，很有些像CT的图像重建。每个不同方位分子的投影图像，相当于物体的CT投影像，根据分子的各种投影像，分子的结构就可以被重建出来了。学术研究领域里，有些是要与产业结合的东西，比如说新材料、新原理的器件。有些则不是，比如说古生物学和天文学。研究蛋白质结构的产业意义在于制药，治疗人的各种疾病，而理解生命的机理不过是对付大众的一个说法而已。与产业结合这样的事情，往往是人算不如天算。这就是所谓的不确定性。过去大众本能性地相信不确定性。如今，被科学“洗脑”后，反倒是倾向于拒绝不确定性了。其实也不是大众不相信不确定性，而是官员们不愿意相信不确定性。低温电镜的蛋白质结构分析大约也不能够取代晶体的蛋白质结构分析，最终不过是各自有自己适用的领域和活法儿。 ---------- 就“是”论事儿，就“事儿”论是，就“事儿”论“事儿”。; 个人分类: 镜子大全|12703 次阅读|13 个评论

电镜资料: skyclub2008 2009-7-7 21:17; 另一个文件 TEM1 TEM1 TEM2 TEM3 TEM4 TEM5 TEM6; 个人分类: 科研教育|2869 次阅读|0 个评论

整理的电镜资料: skyclub2008 2009-7-7 21:09; 我搜集了一些电镜资料和有关的演讲稿，均在下面的文件中电镜电镜电镜3; 个人分类: 科研教育|2931 次阅读|0 个评论

我们小组研究成果之二 – 终于直接观察到了Eu2+离子的存在: 热度 4 rjxie 2009-2-5 17:16; 2005年我们研究小组首先报道了两价Eu掺杂的beta-sialon的发光特性，并将其成功开发了蓝光激发的白光LED用绿色发光材料（Appl. Phys. Lett., 86,211905 (2005））。其发射峰位于535 nm，且半高宽较窄约为35 nm。另外，我们与一些公司合作，利用蓝光LED作为主光源并结合绿色beta-sialon和其他红色荧光粉相继开发了高显色指数的白光LED器件，特别是采用四款不同颜色的荧光粉后显色指数高达96以上，是目前为止采用蓝光LED芯片制作白光LED器件所报道的最高的显色指数结果。同时，我们也利用beta-sialon绿色荧光粉成功开发了液晶背光源用的广色域白光LED。这些结果当然离不开beta-siaon 的优异的发光性能。而熟悉beta-sialon的同行们可能知道，由于beta-sialon特殊的晶体结构特征，在其中掺杂金属发光离子是不可能的，更谈不上发光特性能达到实用化的程度。在认识beta-sialon荧光粉之前，先简单介绍其晶体结构特性。Beta-sialon的化学式为Si6-zAlzOzN8-z (0 z 4.2), 也就是说，beta-sialon 只是beta-Si3N4的固溶体，是以Al-O键部分取代Si-N键而形成，而且Al的固溶度即为化学式中的z值。因此，和beta-Si3N4相同，beta-sialon具有六方的晶体结构，其结构建立在由(Si,Al)(O,N)4四面体构成的三维网络，并且在z轴方向形成一个连续的通道。由于在取代后电荷仍旧保持平衡，所以不需要像a-sialon一样引入金属离子以补偿电荷失衡。所以，教科书以及所有文献都一致认为，任何金属离子在beta-sialon结构中是不稳定的，也是无法存在的。另外，对于发光材料的设计一般都是以发光中心离子部分取代基质材料中某一离子位置或者是在基质材料中故意产生某一元素的空位为原则。前者的例子很多，典型的如Eu3+掺杂的Y2O3红色荧光粉，Eu3+位于Y3+的位置；后者的例子如ZnO，产生氧空位时发绿光。这种发光材料的设计思路也是教科书式的，或者是经典式的。但是，我们小组却成功地在beta-sialon中掺杂了离子半径相对比较大的Eu2+,而且开发了可以实用化的绿色beta-sialon荧光粉。这两个结果都同时违背了我们上面所说的常理。那么，为什么会出现这种情况呢？这个问题也是我们在许多国内、国际学术会议上介绍我们研究成果时被与会者经常提问的问题，包括美国宾西法尼亚大学的I-W Chen教授和荷兰诶因霍温大学的H.T. Hinzten 教授，前者是陶瓷界的学术大师，后者则是氮化物发光材料领域的创始人之一。前不久，有土耳其Anadolu University大学的研究人员向我索要我们发表的相关beta-sialon荧光粉的研究论文，说他们也很感兴趣。我发给他后，他又来信质疑Eu2+是否真的存在于beta-sialon晶体结构中，并要求我们能不能提供给他们直接的实验证据。其实，在发现这个有趣的现象和结果后，我们从来都没有停止过研究Eu2+为何能老实地呆在beta-sialon结构中且能如此高效地发光。解释清楚这个问题不仅具有学术价值，而且能够帮助我们设计新型的发光材料和有效控制材料的发光特性。因此，我们把这个问题分解成以下几个小问题：（1） Eu2+离子的发光是不是由于晶界相造成的？（2） Eu2+离子在beta-sialon结构中什么位置存在？（3） Eu2+离子周围的配位情况、电子结构如何？针对第一个问题，我们采用了高分辨透射电镜分析发现，没有杂质相的存在，同时单个beta-sialon小晶体的表面覆盖着厚度约为1nm的非晶相，而且Eu2+的浓度在颗粒的表面和内部均匀分布。假如是Eu2+在非晶相中发光，应该得到的是很宽的发射光谱，而且强度也不会很高。因此，我们可以排除非晶相发光的可能。接下来，我们结合扫描电镜测试单个颗粒的电子束激发光谱发现，每个beta-sialon颗粒都发射出均匀的绿光，也就是说确实是beta颗粒在发光。所以，第一个问题很好解释，从现象上说明了beta-sailon的发光来自于其固溶Eu2+离子。但是怎么来证明Eu2+就在beta-sialon结构里呢？这就是第二个问题。原先在我们小组工作的Y.Q. Li博士通过计算预测了Eu2+存在于beta-sialon的沿z轴方向的通道里，位于2b的位置（J.Solid State Chemistry,181, 3200 (2008)）（见图1）。虽然这个说法可以接受和理解，但是仍然没有实验上的直接证据。最近，我们才依靠STEM技术直接观察到了Eu2+离子在beta-sialon的通道里（Appl. Phys. Lett., 94,041908 (2009)），第一次从实验上证实了Eu2+的确存在于sialon的晶体结构中（见图2）。第二个问题只说明了Eu2+的存在，但它以什么方式能够合理地存在？这就是第三问题。这个问题比较复杂，目前还没有答案，我们还在分析中。有了结果再作说明。图1 Y.Q.Li预测的Eu的位置，（a) (001)方向，（b) (100)方向图2 (a) BF和 (b) ADF 的 STEM像。白点即为Eu离子像。; 14429 次阅读|3 个评论

一沙一天堂——显微镜简史（二）: eloa 2008-11-28 08:54; 桔子帮小帮主发表于2008-11-26 星期三 20:00 前一篇在这里。超越光的极限电子显微镜自从镜头下的物体第一次被光线照亮，光学显微镜的分辨率就被套上了极限枷锁。即使透镜组合被制作得无可挑剔，分辨率最多也只能达到光波长的一半。自然光的平均波长为0.55m，这就是为什么光学显微镜最多只能分辨0.275 m的细节。若想继续用可见光做显微镜的光源，必须缩短它们的波长，唯一的办法是让光跑得更快然而如果有什么速度能超越光速这个定值，相对论则会被推翻，时间机器就会存在，电影《无极》中的情景可能成真，我们的世界里就会飞满了来自未来的观光者大家知道这是不可能的。这样，光学显微镜的发明使人们的目光从一面墙倏的一下集中到了墙上的一块块砖头；但由于光线无法提速，就无论如何敲不开砖头，看不到它们的内部去。随着时间的推移，天文学家望到越来越多的天体，只是不可触及；对生物学家来说，细胞尽在咫尺，然而从某种意义来讲却同星系一样遥远。对可见光下不可见的微观世界猜了四百年，那时的人们自然地认为，细胞内部如同一锅稠粥，用专业的话讲，细胞就是一口袋蛋白酶。质的飞跃发生在1924年。32岁的德布罗意证明电子也和光子一样具有波动性，令人惊喜的是其波长本身就比光子短。这位未来的法国公爵和德国亲王，早年曾毕业于历史专业，却在刚刚萌发科学兴致不久投身第一次世界大战。战中巴黎铁塔上无数个与无线电发射器为伴的夜晚，不知是否启发了德布罗意对波的奇思妙想。上述研究使德布罗意马上博士毕业，5年后，为他赢得了诺贝尔物理学奖，自此开创博士论文获得诺奖的先河；而它对本篇文章最有意义的贡献是：它提供了理论依据，说明电子为何能像光子一样做显微镜的光源；利用德布罗意公式可以算出，电子的速度能被电场加到特别大，以至波长缩到光子的1/100000。如果用电子做光源，那么显微镜分辨率则可以本质性地提高，就可以看到更加细微的物体了。 1931年，一束轻盈的电子在一条一米多高的巨型金属柱中加速（图为一台1933年制作的电镜），继而被汇聚在一些小网格样品上，将小格放大了14.4倍。这台试验品就被定义为世上第一台电子显微镜（电镜），尽管放大本领和一把手持放大镜差不多，但它却标志人类首次以电代光照出了物体的影像。执行这项工程的德国科学家卢斯卡也因此在55年后被颁予诺贝尔奖。电镜诞生后，电子被不断提速，其波长越来越短，能照出的细节也越来越精致10年之内，电镜的理论分辨率已达10纳米（当然那时没有真正实现），是细胞膜的厚度。然而，正当前途试探性地铺展开，二战的炮声打响，西门子刚刚兴建的实验室毁于空袭；两位重要的科学家失去生命，电镜史中留下辛酸一笔。镜头跳转至1945，细胞学为这个年头欢欣鼓舞。在纽约一间黑漆漆的屋子里，一个完整细胞第一次在墨色的电镜底片上留下它舒展的身影（图），其内部格局依稀可辨。在发表这幅照片的文献中，作者Porter好奇地对着这个宝贵的模特儿远观近瞧，并对每一条细小的分叉和每一处模糊的颗粒详加论述，留有15幅明星照为证人们借助电镜首次清晰地看到，细胞内部原来不是一锅粥，而是分门别类码好的。Porter在随后的研究中依据无数电镜照片对细胞内部这些高度有序的门类加以命名，其中最著名的如内质网、微管、纤毛和衣被小泡。可惜在若干年后，诺贝尔奖在评选细胞生物学先驱时却略过了这位第一次近距离窥视完整细胞的科学家；不过，他留给当代和后代人那些电镜照片，则确实地见证了细胞生物学随电镜技术日渐完善而发展的脚步，使得Porter作为细胞学之父而被许多人记住。 1945年的这张划时代照片标志人类从此获得进入细胞的门票，而将之记录下来的电镜元老来自美国RCA。可惜的是，这家独霸北美电镜市场的公司却在三十年打拼之后郑重决定：卖唱片将是一个更有钱途的买卖它也确实做得很成功，自此RCA被每个古典音乐爱好者所铭记，而美国也再无电镜制造的后起之秀。今日，一般电镜分辨率已达1纳米，能将物体放大200万倍，细胞、细胞里的膜、膜上的分子世界豁然开朗；如果再让电子疯狂加速，加上软件的帮忙，不到1埃（=0.1纳米）的原子也能分辨清楚；全世界一共分布了10000台电子显微镜，想想在它发明之初人们做出的预测只要10台便已足够不禁慨叹在科学领域，做预言真需要有夸海口的胆识。插图：为精子画一幅素描精子：Sperm，来自希腊语，取种子之义，一颗种子就是一个细胞。在温和无害的玻璃皿中，每小时大约毙命5-10%；橡胶避孕套中这一数字达到60-80%。在他们自然死亡之前，我们就可以给他们画肖像画了。先复习一下简史（一）的内容。下图左所示为普通光学显微镜下的精子；右边是荧光照片，在这张照片中，蓝色是他们的头，显示里边塞满了遗传的全部家当DNA；红色是不停扭动的长尾巴，因为这个颜色染出了尾巴中为精子提供长跑比赛巨大能量的结构线粒体（下文图中会看到线粒体如何塞满了精子尾巴）。用电镜画画需要更复杂的过程。首先要杀死他们。原因是精子在电镜内部电子的轰炸下会死得非常惨烈，因此先将它们安乐死是一种仁慈的做法这当然是谎话（生物学家和心慈手软毫不沾边）。正解是，在电镜系统内，这颗可怜的小精子正如一个摊开的鸡蛋，软塌塌地禁不起蹂躏，为了让生物学家能够长时间观察它，它必须坚毅地挺住。让鸡蛋变硬，我们可以煎炒烹炸，对精子，只能用化学物质让它内部的结构原地不动。然后是细胞脱水。因为电镜内部几乎为真空，如果细胞里的水分持续不断地挥发到这个系统中，真空就会被打破。下边还得让精子变得更结实，方法是将它们泡进液态的树脂中，然后放在烤箱里烤，加速自然界树脂的硬化过程，最后一颗亮晶晶的精子琥珀就出炉了。到这一步，两天至少已经过去。但这颗琥珀对于电镜观察实在太厚，于是需要用极其精细的手段将之切成几十纳米薄的切片；琥珀很硬，因此用的武器是世间最硬的钻石制成的刀，刀尖锋利无比，价值上千美元。把切好的精子切片放到电镜里，用电子轰炸、成像，一张如铅笔素描一般的精子电镜照片就炼成了。这张照片所显示的是长长的精子的尾巴，相当于上图荧光照片中红色的部分，那一个个整齐排列的圆球便是前边提到的能量工厂线粒体了。精子头脑简单，四肢发达（指头部内容物精简，尾巴力量无穷），头部没什么东西好看，就不给大家展示了。人最关心人的精子，实际上植物的精子一样美丽它们被包裹在花粉之中。图示为天竺葵花粉，右下和左上分别为两颗细胞。其中右下的那个（被红笔框出）会在花粉落到柱头（雌性生殖器官）上之后一分为二，每一半都是一颗精子。和人的不同，天竺葵花的精子没有尾巴，不会游泳。在大学那个眼不花手不抖的年纪，我曾带着自己最绚烂的热情和最纯真的眼睛做过几年电镜工作。前所未有的精度揭示出超乎预期的生物细节，细胞内曲线之完美和布局之平衡也随之向我袭来，这些都让我只有接招的份儿。满眼和满脑充斥着惊喜和感动，我相信自己看到的微观世界就是宏观的生命之美的本源。但是电镜操作复杂；更重要的是此项技术不能看活的细胞，这作为它致命的弱点，自六十年前细胞学之父首次描述细胞之时就承受起种种指摘，人们有理由怀疑，不管具有多少美学意义，电镜制样所必须的致死步骤或许改变了真实的细胞世界。现在，有些从前只能靠电镜来完成的工作已经能被其它手段取代；而电镜自己所配备的软件也使上边所描述的精密制样过程和那些精致的图片结果一再简化。有人说：电镜学家是世界上最相信眼见为实的人；还有人说，电镜是一门正在死去的艺术。但至少现在，我仍然相信做科学就是做艺术，电镜研究是这句话最直观的体现。而电镜学家就如同舞台上正襟危坐的演奏家，握着自己的提琴，心里执着一个艺术的和精准的世界，不会被台下观众的喧嚣或冷漠而撼动。扫描显微镜精子还有另一种死法它们可以被镀上金，变成一颗金精子，再拿到扫描电镜下边照相。下图一团乱麻就是扫描电镜下的精子。要知道为何镀金，如何照相，请听下回分解。致谢：感谢田萌提供动物精子的电镜和光镜照片。转载原创文章请注明，转载自：科学松鼠会本文链接: http://songshuhui.net/archives/4959.html; 个人分类: 生物|1851 次阅读|0 个评论

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