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yanjx45 2020-4-12 09:28

新冠病毒基因组中 328 个核苷酸的缺失与减毒有关？ SARS-CoV （ SARS病毒）在流行的中后期其基因组中会出现缺失。现在在 SARS-CoV-2 （新冠病毒）的基因组中也发现了类似的缺失。 SARS-CoV基因组的缺失发生在名为 Orf8 的为蛋白质编码的区域（第 8 开放阅读框）。最初曾认为这 29个核苷酸的缺失在某种程度上参与了SARS-CoV对人类的适应。这一假设在随后的实验中被证明是错误的。实验表明，这 29个核苷酸的缺失降低了病毒在许多不同类型细胞中的复制能力。换句话说，与含有完整 Orf8的病毒相比，这种病毒的适应度降低了。据今年 3 月 11 日新加坡的研究人员发表的论文（参见参考文献），具有 382个核苷酸缺失的SARS-CoV-2，几乎将 Orf8的整个开放阅读框都删除掉了。该病毒已从新加坡的 8名住院患者中分离出来(如下图所示)。这些病毒似乎已经在新加坡传播了至少四周。该论文的作者认为，这种缺失可能导致 SARS-CoV-2毒力的降低。这一假设是基于细胞培养中缺乏Orf8的SARS-CoV的适应度降低。而且当时尽管 SARS-CoV-2 已经在新加坡传播了至少四周，但整个新加坡确诊病例的增长很缓慢，而且直到 3 月 20 日整个新加坡还未出现死亡病例。今年 1月23日检索 2019-CoV(当时的SARS-CoV-2的名称)的基因组序列，表明当时所有分离毒株的 Orf8 都是完整的。如果该病毒随后在人类的传播过程中 Orf8 没有丢失，则疫情可能会更加严重。迄今为止， SARS-CoV-2引起的大流行相当严重，全球的平均致死率约为 6%。Orf8的缺失是否会降低该病毒对人类的毒性还不清楚。通过与SARS-CoV的类比，Orf8的缺失可能降低了SARS-CoV-2的适应能力，因此具有这种突变的病毒可能无法与该基因完整的病毒竞争。 Orf8 删除的 SARS-CoV-2 尚未在新加坡以外的地方报告。在未来的病毒分离中，仔细观察基因组中的这一区域是很重要的。应当进一步确定发生了这种突变的病毒是否有能力在全球广泛传播，如果能广泛传播，则需要了解它是否伴随着毒性的减弱。参考文献： Discovery of a 382-nt deletion during the early evolution of SARS-CoV-2 ， Yvonne CFSu,et al.,　 bioRxiv 　preprint . 　 doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.11.987222 　

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新型狂犬病毒减毒活疫苗可能用于狂犬病的治疗

热度 10 yanjx45 2012-9-2 15:55

美国费城 Thomas Jefferson 大学的 Bernhard Dietzschold 等在近期《病毒学杂志 (Journal of Virology) 》上发表论文证明：用狂犬病毒 (RV) 减毒活疫苗 TriGAS 进行暴露后治疗 (PET) ，可通过快速诱导中枢神经系统 (CNS) 组织中的适应性免疫相关基因的表达而导致野生型 RV 从中枢神经系统 (CNS) 中被清除，使大部分受感染的小鼠得以生存，从而使该疫苗有可能用于狂犬病的治疗。采用新型 RV 减毒活疫苗，即含三个糖蛋白分子的 RV 减毒变种 TriGAS ，对被野生型 RV 感染的小鼠进行暴露后治疗（ PET ），可在致病的 RV 已经入侵大脑并在其中复制的情况下提高小鼠的存活率。 PET 的成功是由于诱导产生了强有力的 RV 中和抗体应答，从而能将野生型 RV 从脑中彻底清除。作者将正常鼠脑中的转录子与野生型 RV 感染的小鼠进行比较，将 RV 感染的小鼠又分为用新型 RV 减毒活疫苗 TriGAS 进行 PET 治疗的和未进行治疗的 2 组。实验发现，在只有野型 RV 感染而未用 TriGAS 进行 PET 的小鼠中，代表 1 型干扰素（ IFN ）反应的许多宿主基因都被激活。这表明，野型 RV 感染早期引起的 I 型干扰素反应不能控制 RV 的感染。相反，在用野型 RV 感染后又用减毒活疫苗 TriGAS 进行 PET 的小鼠大脑中，大多数选择性活化的基因能发挥适应性免疫的作用，包括调节 T 细胞的活化和分化、调节淋巴细胞和单核细胞的增殖。这些发现得到采用定量 PCR （ qPCR ）芯片进行的研究的证实。芯片实验的结果显示，在 RV 感染又经 TriGAS 进行 PET 的小鼠脑中，编码趋化因子配体 3 （ CCL3 ）、自然杀伤细胞活化因子 2 （即白细胞介素 12B ）和颗粒酶 A(GzmA) 的 3 个基因活化较早，并有更充分的表达。已知这些基因的活化对调节淋巴细胞和单核细胞的增殖发挥关键作用，这也可能用于解释减毒活疫苗 TriGAS 在 PET 中的作用机制。从大脑中清除 RV ，需要在周围神经和 CNS 中快速诱导强大的先天免疫和适应性抗 RV 免疫。作者已经确定了 TriGAS 诱导有可能参与这一进程的几个基因。确定与这些基因产物的诱导相关的上游和下游路径以及这些基因产物的活性，最终将有助于进一步认识从 CNS 中清除 RV 所涉及的机制，并最终有助于延长 PET 的窗口期：从暴露后数天一直延长到 RV 已经到达 CNS 之后。这也就是说，在暴露于狂犬病毒后即使症状已开始出现，此时再开始 PET 仍然可能有效，从而使狂犬病的真正意义上的治疗成为可能。这项新的研究成果将为狂犬病的治疗研究开辟一条全新的途径。（国药中生武汉公司狂犬病检测中心严家新研究员编译自 Journal of Virology ， 2012 ， 86(6) ： 3200–3210 ，）

个人分类: 狂犬病防治|9986 次阅读|16 个评论

狂犬病活疫苗经多重突变减毒及其安全性和有效性评价

热度 3 yanjx45 2012-6-1 15:21

( 这是日本学者近期在研究狂犬病减毒活疫苗方面取得的一项进展，此为发表在《 Vaccine( 疫苗 ) 》杂志上的论文摘要的译文。 ) 已知狂犬病毒 G 蛋白 333 位氨基酸的替换可以决定其致病性：颅内接种该位点是 Arg 或 Lys 的毒株后成年鼠死亡，而该位点是其他氨基酸的毒株则不会造成致死性感染。在这些发现的基础上，获得了狂犬病毒减毒株并用于主要针对野生动物的口服疫苗。然而，考虑到毒株有回复突变成致命表型毒株的可能性，对某个毒株不仅在 G 蛋白上，还在病毒的其他蛋白上进行多重突变来减毒，更有希望获得安全的活疫苗。我们以前曾证明，狂犬病固定毒 Ni-CE 株主要通过突变 N 、 P 、 M 蛋白减毒，减毒后的毒株颅内注射成年鼠只引起短暂的体重减轻，该毒株 G 蛋白的 333 位还是强毒型的 Arg 。在本研究中，为了通过多重突变减毒来获得活疫苗株，我们制备了 Ni-CE 突变株 Ni-CE （ G333Glu ）株 ( 其 G 蛋白 333 位的 Arg 突变为 Glu) ，并验证该毒株的病原性和免疫原性。我们发现，与 Ni-CE 株相比， Ni-CE （ G333Glu ）株颅内注射后不会引起成年鼠短暂的体重减轻。减毒的 Ni-CE （ G333Glu ）株通过乳鼠脑内传代 10 次也没有发生表型性状的改变。我们也证明了注射 Ni-CE （ G333Glu ）株后，被免疫的鼠产生的病毒中和抗体能够保护小鼠对抗致死性攻击。这些结果表明， Ni-CE （ G333Glu ）株是研发有高度安全性的狂犬病活疫苗的有希望的候选者。

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狂犬病毒致病机理：基于灭活和减毒疫苗免疫的发现

热度 9 yanjx45 2011-4-10 22:05

(此文是一篇专业论文的全文翻译，本来是作内部参考用，但因很多网友关心这方面的问题，而在网上对相关问题常有过时或错误的观点流传，所以在此全文发布，供感兴趣的网友参考。因主要是供本专业人员阅读的文献，对其他专业或一般读者，其中有些内容可能不易理解，可先只看摘要。我们以后争取能有时间作一些简化的解读。) 摘要虽然狂犬病疫苗的应用已经有一个多世纪的历史，但是狂犬病疫苗通过免疫接种或天然感染后引起机体免疫应答的具体机制仍不太清楚。本研究通过减少灭活和减毒活疫苗剂量，分别采用常规、提前或延迟的处治方案来比较所产生的不同保护效果。分别对 2 月龄叙利亚地鼠、 4 周龄 ICR 小鼠或成年猕猴接种犬狂犬病毒（ RV ）变种。在暴露后 6 小时、 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 和 7 天开始处治。应用单剂或多剂灭活疫苗（ HDCV ）、反向遗传技术构建的减毒活疫苗或 γ 射线灭活的 ERAG333 疫苗进行肌肉接种。对病毒在这些啮齿类动物模型中的传播动力学进行监测。结果发现， RV 在感染 4 天后播散到脊髓， 6 天到达脑部。在暴露后迟至 5 － 6 天才接种 ERAG333 活疫苗的地鼠全部死亡。而在 6 小时、 1 、 2 、 3 和 4 天分别接种一个剂量的 ERAG333 活疫苗的存活率分别是 78% ， 44% ， 56% ， 22% 和 22% 。与此相似，在暴露后 24 小时接种灭活 ERAG333 疫苗，地鼠存活率是 67% 。如果标准预防方案 ―― 埃森 (Essen) 方案推迟 3-6 天才执行，则所有的地鼠全部死亡，而暴露后 1-2 天即开始进行预防的地鼠的存活率分别是 67% 和 33% 。猕猴在暴露后 24 小时接种一剂减毒的 ERAG333 疫苗即可获得保护力。即使预防延迟，高度减毒（活的）和灭活的 ERAG333 疫苗也可诱导强有力的保护性免疫反应。按照埃森方案，采用 2-5 剂商品疫苗和人狂犬病免疫球蛋白（ HRIG ）进行预防，实验动物的存活率可达 89-100% 。经缩减的疫苗接种程序仍可以提供有效的预防，接种疫苗的剂量总数不影响结果。 1. 引言狂犬病一旦发病就会致命，但是如果能够尽早采取适当的暴露后预防（ PEP ），完全可以避免疾病发生。到目前为止，还没有单独的任何一种药物具有特异性的治疗效果，但是联合采用不同生物制剂的治疗方案可发挥协同作用，已成功地应用于实验性治疗。目前， PEP 仍是在暴露后唯一有效的预防人类狂犬病的方法。现代的 PEP 主要包括被动免疫和主动免疫，被动免疫是早期输入针对狂犬病毒（ RV ）的中和性抗体，这些抗体是由病毒的有效成分刺激产生的；而经诱导产生的主动免疫则可进一步清除外周组织的病毒。在接种的疫苗能产生主动免疫应答之前，被动输入免疫球蛋白所提供的病毒中和抗体 (VNAs) 可以填补机体抵抗力暂时的空缺，这是 PEP 的一个重要组成部分，特别是对于严重的暴露。以往的实验表明，体液免疫对清除外周 RV 作用很大，而细胞免疫应答则作用有限。 PEP 一方面可以快速诱导免疫应答，还可以使机体产生持续的免疫记忆，这是 PEP 的另一个重要作用。在过去的一个世纪中，狂犬病疫苗生产所用的基质、减毒和灭活的水平和方式，以及接种途径都发生了巨大变化。同时，由于疫苗免疫原性、有效性和安全性的提高， PEP 经肌肉途径接种疫苗的剂量从原来的 21 剂以上逐渐减少到现在的 4 剂。关于未来的疫苗产品，亚单位、 DNA 和重组活疫苗都正处在实验评估阶段。尽管狂犬病生物制品的生产在全球已得到改进，对狂犬疫苗的免疫原性和有效性的认识也在不断进步，但其实际应用仍受到经济和技术的制约。在 21 世纪，某些国家仍在生产神经组织疫苗，并用作暴露于疯动物后唯一的预防手段。而且，尽管针对狂犬病的成功的疫苗接种已有一个多世纪的历史，但在自然感染或接种灭活或减毒活疫苗所引起早期的细胞和体液免疫的分子机制仍不清楚。本研究目的是在不同动物模型中，对各种灭活和减毒狂犬病疫苗及 PEP 程序的预防效果进行实验比较。 2. 材料与方法 2.1. 动物与病毒 2 月龄雌性叙利亚地鼠（金仓鼠）、 4 周龄雌性 ICR 小鼠，在实验前至少观察 72 小时。 1 岁龄雌性猕猴，实验前至少经 2 个月检疫。为了便于对比，选用两种不同的犬街毒株作为攻击毒株。其中一株滴度为 10(2.5 次方) MICLD50/50μl ，分离自德克萨斯州一只自然感染狗的唾液腺；另一株滴度为 10(2 次方)MICLD50/50μl ，分离自墨西哥一只自然感染狗的唾液腺。所有的实验动物的处理及实验程序都是符合疾病预防与控制中心关于动物管理和操作委员会的指导方针。 2.2. 　生物制品对于啮齿类动物，根据实验设计方案一次性接种最低效价为 2.5 IU/ml 的 50μl （非人灵长类动物 1ml ） HDCV ， Imovax(sanofi pasteur) 或 50μl 纯化的鸡胚疫苗 (PCEC) ， Rabavert (Novartis) 。同样地，对于啮齿类动物，根据 PEP 的原则，在相应部位肌肉注射 50μl 未经稀释的 HRIG ， HyperRabtm S/D (Talecris Biotherapeutics, 150 IU/ml) 或 ImogamRabies-HT (sanofi pasteur, 150 IU/ml) 。减毒疫苗 ERAG333 （通过定点突变的方法将病毒 G 蛋白 333 位点的精氨酸突变为谷氨酸）和 ERA2G333 （含有两个 G 基因， 333 位点都突变）通过反向遗传系统构建。 ERAG333 株显示出高度的安全性，对 3 周龄的成年小鼠及其他目标或非目标物种均无致病性，甚至经颅内注射也是如此。经 γ 射线灭活的 ERA G333 株，将灭活病毒样品在鼠神经瘤细胞（ MNA ）中连续传 3 代以验证完全灭活的病毒。将减毒或灭活的 ERA G333 株 50μl ( 10(9次方) TCID50/ml) 肌肉接种于仓鼠或小鼠右腓肠肌或接种 1ml 于猕猴三角肌 (10 (9次方) TCID50/ml) 。 2.3. 实验方法 2.3.1. 　直接荧光抗体试验 (DFA) 采用异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体检测脑组织样本中的狂犬病毒抗原。 2.3.2 . 　逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 及半嵌套式 RT-PCR (hnRT-PCR) 采用 RT-PCR 和 hnRT-PCR 方法追踪检测 RV 从地鼠的接种部位到达脑部的过程。采集腰部、胸部脊髓及脑部切片组织，应用无菌技术以防止交叉污染，按照 TRIzol Reagent （ Invitrogen ）说明书进行操作提取组织总 RNA 。逆转录的引物为 1066fw （ 5’ GAG AGA AGA TTC TTC AGG GA 3’ ），引物根据 RV PV 株基因组（登录号 M13215 ） 1136nt–1155nt 处的序列设计，反应条件为 42 ℃ 90 min 。第一次 PCR 采用引物 1066fw 和 304rv （ 3’TTG ACA AAG ATC TTG CTC AT 5’ ）扩增病毒基因组从 304nt–1066nt 的一段序列。另设计两条引物通过 hnRT-PCR 检测微量的病毒 RNA ： (a) 1087fw (5’ GAG AAR GAA CTT CAR GA3' ， 1087–1104) 和 304rv ； (b) 504sfw （ 5’TCA TGA TGA ATG GAG GT 3’ ， 504–521 ）和 304rv 。两次 PCR 反应条件一致： 94 ◦C 预变性 1 min ， 40 个循环： 94 ◦C 30s ， 37◦C 30s ， 72◦C 1.5 min ，最后 72 ◦C 延伸 7min ，采用 3.5% 琼脂糖凝胶的方法检测扩增片段大小，然后通过序列分析鉴定病毒。 2.3.3. 　快速荧光灶抑制试验 (RFFIT) 采用 RFFIT 方法利用 CVS-11 作为攻击毒株检测病毒中和抗体（ VNA ）。 2.3.4 . 　统计学分析统计并绘制 Kaplan–Meier 生存曲线 (SAS 9.2) ，采用时序检验法 (log-rank test) 分析各个实验组的生存量差异。同一生存函数的检验假设在 P 0.05 时被否定。 2.4. 　应用灭活的商用 HDCV 和减毒活疫苗 ERAG333 或 ERA2G333 对地鼠进行 PEP 2.4.1 利用分离于德克萨斯狗的 RV 进行攻击实验将分离于德克萨斯狗的 RV ( 10(2.5次方) MICLD50/ 50μl ) 肌肉接种于 2 月龄雌性叙利亚地鼠 (6 只 / 组 ) 左腓肠肌。实验动物根据不同的 PEP 方案被分为若干组，每只地鼠经左腓肠肌注射 50μl 灭活的 HDCV 或减毒疫苗 ERAG333 或 ERA2G333 。接种 HDCV 的实验组，于 0, 3, 7, 14 和 28 天各接种一剂（同时注射或不注射 HRIG ）；接种减毒活疫苗 ERAG333 或 ERA2G333 的实验组，每只动物只接种一次，分别于暴露后 1 、 3 、 5 或 7 天；对照组 6 只地鼠不做任何处理，发病后于 1-6 天执行安乐死并检测病毒的播散情况。 2.4.2. 利用分离于墨西哥狗 RV 进行攻击实验将 2 月龄雌性叙利亚地鼠分为 13 组（ 9 只 / 组），每只地鼠经左腓肠肌注射 50μl ( 10(2次方) MICLD50/ 50μl ) 分离于墨西哥的狗 RV 。然后，应用减毒的 ERAG333 疫苗在 6 小时、 24 小时和 2 、 3 、 4 、 5 、 6 天对地鼠进行 PEP ，每只地鼠只免疫一次。埃森方案规定于暴露后 0 、 3 、 7 、 14 和 28 天各接种一剂 HDCV 疫苗或同时注射 HRIG 。对照组 9 只地鼠不做任何处理，发病后于 1-6 天执行安乐死并检测病毒的播散情况。收集各个实验组动物腰部、胸部脊髓和脑组织并用 hnRT-PCR 检测病毒 RNA 。同时，每日观察动物情况，连续观察 4 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。 2.5. 　应用减毒和灭活的 ERAG333 疫苗对地鼠进行 PEP 将 2 月龄雌性地鼠分为 5 组（ 6 只 / 组），每只地鼠经左腓肠肌注射 50μl （ 10(2次方) MIC LD50/50μl ）分离于墨西哥狗的 RV 。然后，应用减毒或灭活的 ERAG333 疫苗在 24 小时和 3 天对地鼠进行 PEP ，每只地鼠只免疫一次。每日观察动物情况，连续观察 2 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。 2.6. 　应用灭活的细胞培养疫苗或减毒的 ERAG333 疫苗对猕猴进行 PEP 将成年雌性猕猴分为 3 组（ 3 只 / 组），每只猕猴经咀嚼肌注射 0.5ml 滴度为 10(2次方) MIC LD50/50μl 分离于墨西哥狗的 RV 。 24 小时后，第一组于三角肌接种 1ml HDCV( 根据埃森方案于 0, 3, 7, 14 和 28 天各一剂，不包括 HRIG ）；第二组于三角肌接种一次 1ml 减毒 ERAG333 疫苗（ 10(9次方) TCID50/ml ） ( 于 3, 7, 14 和 28 天在三角肌接种 1ml PBS ）；第三组只在 0, 3, 7, 14 和 28 天于三角肌接种 1ml 的 PBS 。所有动物在第 1 个月每周采一次血检测 VNA ， 1 个月后继续每日至少观察动物两次，连续观察 3 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。 2.7. 　在地鼠模型中检测早期和延迟进行标准 PEP （ 5 剂疫苗）的有效性将地鼠分为 6 组（ 3 只 / 组），每只地鼠经左腓肠肌注射 50μl 滴度为 10(2.5次方) MIC LD50/50μl 分离于德克萨斯狗的 RV 。根据埃森方案，应用灭活的疫苗（ PCEC ）和免疫球蛋白于 1 、 2 、 3 、 4 、 5 和 6 天进行 PEP ，对照组不进行任何处理。每日观察动物情况，连续观察 3 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。 2.8. 　在地鼠模型或 ICR 小鼠中检测不同剂量疫苗 PEP 的有效性将两月龄叙利亚地鼠或 ICR 小鼠分为 8 组（ 9-10 只 / 组），每只小鼠经左腓肠肌注射 50μl 滴度为 10(2次方) MIC LD50/50μl 分离于墨西哥狗的 RV 。根据埃森方案，应用灭活的疫苗（ HDCV ）和 HRIG 于 24 小时进行 PEP ，第一组免疫 5 次（ 0, 3, 7, 14 和 28 天），第二组 4 次（ 0, 3, 7, 和 14 天），第三组 3 次（ 0, 3, 和 7 天），第四组 2 次（ 0 和 3 天），第五组 1 次（ 0 天）。每日观察动物情况，连续观察 2 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。 3. 结果 3.1. 应用灭活的商用 HDCV 和减毒 ERAG333 或 ERA2G333 疫苗对地鼠进行 PEP 3.1.1 利用分离于德克萨斯的狗 RV 进行攻击实验对照组的动物和仅接种灭活 HDCV 的地鼠全部发病，与何时开始 PEP 无关。在经 11-15 天的潜伏期出现狂犬病症状后执行安乐死，检测发现：病毒于第 4 天播散到实验动物的腰部脊髓，第 6 天到达脑部。于第 7 天接种减毒疫苗 ERAG333 以及第 5 或 7 天接种减毒疫苗 ERA2G333 的地鼠全部死亡。然而，暴露后第 1 或 3 天接种 1 个剂量减毒疫苗 ERA2G333 的地鼠存活率为 50% 。与此类似，暴露后第 5 、 3 、 1 天接种减毒疫苗 ERAG333 的实验组中分别有 17% 、 33% 和 83% 的地鼠存活。在对照组与接种 HDCV 、 ERAG333 或 ERA2G333 疫苗的实验组之间，病毒的潜伏期无差异。 3.1.2. 利用分离于墨西哥狗的 RV 进行攻击实验仅接种 HDCV 或感染后第 5 或 6 天只接种减毒疫苗 ERAG333 的地鼠全部死亡。然而，暴露后第 6 小时、 1 、 2 、 3 或 4 天接种一剂减毒疫苗 ERAG333 的地鼠存活率分别为 78% （ 7/9 ）、 44% （ 4/9 ）、 56% （ 5/9 ）、 22% （ 2/9 ）和 22% （ 2/9 ）。通过比较发现，根据标准 PEP 方案进行预防或仅注射 HRIG 的动物有 44% （ 4/9 ）存活。对照组（只用病毒攻击，没有采取 PEP ）中仅有一只地鼠存活（ 1/6 ），检测发现病毒于暴露后第 4 天播散到动物的腰部脊髓，第 6 天到达脑部。 3.2. 应用减毒或经 γ 射线灭活的 ERAG333 疫苗对地鼠进行 PEP 在暴露后 24 小时接种减毒 ERAG333 株的地鼠全部存活（ 6/6 ）；于暴露后第 3 天接种一剂相同疫苗的只有 50% 存活。在暴露后 24 小时接种灭活 ERAG333 株的地鼠有 4 只存活（ 4/6 ），存活率为 67% ；于暴露后第 3 天接种相同灭活疫苗的存活率只有 20% （ 1/5 ）。仅接种 PBS 的对照组中，地鼠存活率为 33% （ 2/6 ）。 3.3. 应用灭活的细胞培养疫苗或减毒的 ERAG333 疫苗对猕猴进行 PEP 实验前，在本组实验动物中未检出 VNAs 。对照组发病动物执行安乐死后，采用 DFA 均在脑部组织检测到 RV 抗原。接种 5 剂 HDCV （没有接种 HRIG ）的实验组有 2 只猕猴存活（ 2/3 ）。而暴露后 24 小时仅接种一剂减毒 ERAG333 疫苗的猕猴全部存活。两个疫苗免疫组中动物的 VNA 水平相差无几，在 14-28 天到达顶峰，并逐渐降低直至免疫后第 90 天。 3.4. 在地鼠模型中检测早期和延迟标准 PEP （ 5 剂剂量）的有效性于第 3、4、 5 和 6 天开始进行灭活疫苗（ PCEC ）加免疫球蛋白的 PEP 实验组中，所有的地鼠都死于狂犬病，而暴露后第 1 和 2 天进行 PEP 的实验组存活率分别为 67% 和 33% 。 3.5. 　在地鼠和小鼠模型中检测不同剂量疫苗进行标准 PEP 的有效性在对照组中（ PBS 处理）， 78% （ 7/9 ）的地鼠死于狂犬病；按照埃森方案接种 5 剂 HDCV 疫苗（没有接种 HRIG ）的实验组中，有 89% （ 8/9 ）的地鼠死亡。而根据修订的埃森方案接种 1 、 2 、 3 、 4 和 5 剂疫苗和 HRIG 的实验组中，地鼠的存活率分别为 67% (6/9) ， 89%(8/9) ， 78% (7/9) ， 100% (9/9) ， 78% (7/9) 和 78% (7/9) 。与此类似，在接种 1 ， 2 ， 3 和 4 剂 HDCV 疫苗和 HRIG 的小鼠实验组中，其存活率分别为 80% (8/10) ， 90%(9/10) ， 90%(9/10) 和 70% (7/10) 。对照组动物全部死亡。 4. 讨论与结论暴露于某个特定 RV 后的结果与该 RV 的基因型或是否存在变异体，以及其致病性（致凋亡力、神经侵袭性）、病毒的感染剂量、感染途径和严重程度、宿主种类及其对病毒的易感性等都有一定的关系。这些因素与宿主的固有和适应性免疫应答一起决定着病毒感染的最终结果。 PEP 的目的是快速刺激宿主免疫应答，并介导宿主在早期对病毒的中和和清除。不同的免疫方法可以刺激固有或适应性免疫应答的不同分支部分。由于中枢和外周神经系统具有免疫学方面的某些特权而且对早期的病毒识别能力有限，所以外周非神经组织中的病毒中和作用在清除 RV 的过程中起到非常重要的作用，也是 PEP 成功的关键。致病性的 RV 通过限制复制水平从而降低糖蛋白的表达、抑制干扰素反应、抗细胞凋亡刺激和单一的沿神经传播方式等特别机制来逃避外周免疫系统的早期识别。病毒颗粒一旦进入外周神经系统就开始向中枢神经系统（ CNS ）传播，该病的致命性后果就不可避免。鉴于 RV 病理学的特殊性，越早开始合理的 PEP ，治疗的效果越好。然而，病毒的潜伏期及从感染到成功进行 PEP 的间隔时间是不同的，取决于 RV 的基因型 / 是否存在变异体、及其对特定宿主的致病性、病毒的感染量、感染的途径及严重程度。在啮齿动物模型中发现，病毒可能进入肌肉细胞并在入侵部位增殖，或直接进入外周神经而不预先在非神经组织增殖。大量研究表明， RV 首先侵入外周神经元的运动和 / 或感觉神经的轴突并沿轴突以 50–200mm/ 天的速度逆行至 CNS 。我们研究发现，两种不同 RV 变异株在地鼠模型中的逆行传播速度为 15–30mm/ 天。如果病毒只是 “ 被动地 ” 传播，仅依赖于沿轴突转运固有的速度，那么不同的宿主种类以及其他实验因素的不同可以用来解释当前的发现与以往研究结果的不同。 RV 侵入外周和 CNS 后不断地适应和逃避免疫系统的反应，尽量促进自身的存活。病毒在不同的宿主内具有不同的致病性，所引起的免疫应答强度也存在差异。一旦 RV 侵入神经元，便有可能发生经典的中和作用，但发生的几率很小。早期的 PEP 使用免疫球蛋白，并用灭活的疫苗诱导体液免疫，随后可中和外周非神经组织中的病毒，这是在发病前清除病毒的主要机制。如果缺失了 B 细胞和 T 细胞，或仅缺失 B 细胞，小鼠在经鼻感染减毒的 CVS-F3 RV 后会发展成为进行性疾病并死于狂犬病。然而将缺失了 CD8+T 细胞、 IFN 受体或补体 C3 和 C4 的小鼠与相应功能正常的小鼠进行比较，结果存活率无显著差异，这表明细胞免疫在清除 RV 过程中起到的作用较小。其他研究也显示，免疫功能正常的小鼠，而不是 B 细胞有缺陷或缺失了 IFN-I 、 TLR 或 IL-1 受体信号通路的小鼠，在经颅内感染致病性的 DOG4 RV 和减毒 SPBAAN-GAS-GAS-GAS RV 的混合物后，仍然能够存活。目前，所有人用细胞培养商品疫苗都是基于灭活的 RV 。疫苗中的病毒抗原可以激活 CD4+ 辅助性 T 细胞反应，随后通过 MHC-II 机制（主要针对病毒糖蛋白）激活 B 细胞体液反应，产生 VNA 。正如在我们的 “ 严重暴露 ” 实验中所显示的，暴露后被动和主动免疫的时间非常关键，延迟 PEP 开始时间将会增加疾病的死亡率，如果推迟 3 天甚至更晚才进行预防接种，可能会完全没有保护作用。显然，暴露后尽早开始 PEP 是成功的关键。我们的结果表明，被动免疫以及 VNAs 在病毒的清除过程中非常重要：早期开始的 PEP 即使接种了 5 剂灭活疫苗，攻击后的动物仍全部死亡。相反，如果 PEP 只包括 HRIG ，或包括 HRIG 加灭活疫苗，则 60%-100% 的实验动物存活。灭活疫苗可以激活 B 细胞并通过 MHC-II 机制激活 CD4+ T 细胞，而重组 DNA 和减毒活疫苗除了可以激活 CD4+ T 细胞和 B 细胞外，还可以激活 CD8+ 细胞毒 T 细胞。后者在狂犬病 PEP 中的作用尚未得到充分研究。在啮齿类和非人灵长类动物模型中，与接种灭活商品疫苗相比，仅接种一剂减毒 ERAG333 疫苗在引起体液免疫反应的效果上并无差异（前 7 天检测不到 VNAs ），这说明细胞免疫、趋化因子、细胞因子以及固有免疫在外周非神经组织的狂犬病毒清除中具有重要作用。我们发现减毒活疫苗可以有效地保护感染的动物，即使是在暴露后 3-5 天仅接种一剂疫苗，此时已经可以在动物的腰部和胸部脊髓检测到病毒 RNA ，这进一步表明存在可以从神经系统清除 RV 的机制。我们的结论是，高度减毒的活疫苗比灭活疫苗能诱导在质或量方面都不同的更强的免疫反应，即使是在 PEP 延迟开始和病毒已经在部分神经系统中分布的情况下，也可以提供保护。一个类似的报道显示，在小鼠模型中，采用致病性的 DOG4 RV 进行攻击后 4 、 16 、 24 、 48 和 72 小时再肌肉注射减毒活疫苗 SPBAAN-GAS-GAS-GAS ，小鼠的存活率分别为 100%, 、 90% 、 55% 、 40% 和 30% 。我们推测在 CNS 中已存在致病性的 RV ，因为实验中观察到于暴露后 4 小时或更晚给予 PEP 的小鼠中，有 50%–90% 出现暂时性后肢麻痹，而未感染、仅接种了疫苗的小鼠无任何临床变化。在免疫功能正常的小鼠中经颅内接种致病的和活的减毒狂犬病疫苗的混合物后，观察到 100% 的生存率。我们并未详细研究后来在外周神经组织中清除 RV 的具体机制，但我们推测细胞介导的免疫应答联同血液 - 神经间屏障的改变对整个结果具有重要影响。血脑屏障（ BBB ）以及 CNS 内的免疫应答的作用以前已有详述，但是关于血脑屏障的通透性及其协助 CNS 在发生可检测到的脑炎之前清除病毒的准确机制目前尚不清楚。外周神经系统的神经内膜间隔由结缔组织、内皮细胞和神经内膜血管构成，被血液 - 神经屏障所分隔。虽然这些内皮细胞并不像脑部血管内皮细胞那样紧密连接，但他们在将外周神经与血浆组分分隔开的能力方面仅次于 CNS 。有趣的是，最近在脊髓根处，最远在运动神经终板处，其间的屏障效果要差一些。而且，已知 T 细胞经常是先移行至分隔的免疫特权器官，例如脑和外周神经，在此短暂停留，监控各种组织，然后返回至血液循环。这些研究能为中和作用和从外周神经中清除 RV 提供部分解释。许多病毒的中和以及从 CNS 的清除都需要 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的协同作用，其中 CD8+ T 细胞直接提供穿孔素和 IFN-γ 介导的抗病毒活性。以往已有研究部分地证明，减毒活疫苗激活的免疫应答可中和 RV ，即使病毒已经在有限程度上进入 CNS （经肌肉进行攻击后再脑内免疫接种）。我们的研究也发现，接种一剂减毒的 ERAG333 就可以激活免疫应答，促进清除已侵入腰部和胸部脊髓的 RV 。然而，如果在暴露后 6 天才接种减毒活疫苗 ERAG333 ，此时 RV 已经复制并播散到脑部，该疫苗就不能足够快速地激活有效的免疫应答。尽管将 RV 从 CNS 中清除也可能发生，但我们的实验明确显示，当 RV 在 CNS 增殖和播散超过一定阈值，不管是什么程度或是多么强烈的免疫应答，都不能完全中和和清除病毒，并同时能维持神经细胞的完整性和保证宿主的存活。到目前为止，所有的实验治疗临床狂犬病的尝试方法包括鞘膜内注射特异性 RIG 、输入细胞因子或趋化因子、接种减毒的 SAG2 减毒活疫苗和利用各种抗病毒药物，或联合应用这些方法，结果除了一例外，全都失败了。总结：与其他报道不同，在暴露后 24 小时内接种经 γ 射线灭活的 ERA G333 疫苗也可以诱导免疫应答，并保护大部分（ 60% ）的实验动物。这说明复制并不是诱导上述免疫应答所绝对必须的。减毒的病毒疫苗诱导相关免疫反应的潜力及其从 CNS 中清除 RV 的能力还需要在完善的动物模型中进一步研究。在动物 PEP 中，尽管接种了 5 剂灭活的商用疫苗，但没有同时注射免疫球蛋白，结果发现这样并不能保护感染的实验动物对抗严重的实验性病毒攻击；而联合注射免疫球蛋白和 2-5 剂疫苗（如果在暴露后很早就开始）就可以提供有效的保护，不必考虑使用的疫苗剂量的绝对数量。在猕猴模型中， PEP 采用灭活疫苗而不同时注射免疫球蛋白，结果出乎预料，除了一只猕猴外其他的都存活下来。这说明，物种特异的相互作用 ( 天然的敏感性 / 抵抗力 ) 在很大程度上决定于 RV 的致病性和宿主的免疫反应。在很多发展中国家都存在免疫球蛋白短缺，于是经常采用仅使用疫苗的 PEP 方案，这可能会导致死亡率增加，尤其是对于那些头部严重暴露的病例。与其它研究不同的是，在我们的只接种疫苗的试验中，未观察到明显的 “ 早死 ” 现象。这可能与所选择的 RV 毒株、间隔时间和其他因素有关。迄今为止，虽然在狂犬病疫苗和 RV 致病性的研究方面取得了很大进展，但是狂犬病的症状一旦出现仍无法治疗。所以，当前的应用研究和公共卫生政策应该着重加强以广泛分布的实验室为基础的监测项目，研发和生产高效、安全、廉价的生物制品，并为发展中国家提供一种理想的人狂犬病预防措施。发展和应用适当的动物模型作为人类的替代品非常关键，它将为不断改进狂犬病的预防措施、发展和评价实验性的狂犬病处治方案提供有用的参考依据。

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