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挑战狂犬病治疗：从中枢神经系统清除狂犬病毒感染的实验: yanjx45 2020-10-29 16:57; 挑战狂犬病治疗：从中枢神经系统清除狂犬病毒感染的实验前言狂犬病只能预防不能治疗 ! 狂犬病一旦发病，死亡率为100 %。人类迄今尚未实现狂犬病治疗成功率零的突破 ! 迄今全球所有声称狂犬病治疗成功的病例中，没有一例得到国际学术界普遍的承认。但是人类对狂犬病治疗方法的探索和研究一直未停止。目前认为有两个途径最有希望能取得成功。据法国巴斯德研究所的研究人员今年 9 月发表的研究论文，他们开创了狂犬病治疗的一条新途径。他们主要有两个创新点:一是采用针对病毒包膜糖蛋白的具有有效中和作用的两种人类单克隆抗体进行结合治疗，二是同时对周围和中枢神经系统进行抗体处置，对后者是通过持续多日直接向脑室内灌注单抗实现的。本博客中对此曾有专题报告：狂犬病治疗首次重大突破：两种人源单抗结合治疗方案动物实验成功（ 1 － 3 ） 2020-10-10 。狂犬病治疗另一条有希望取得成功的途径主要涉及减毒活疫苗的应用，这个领域研究的时间较长，研究获得的数据较丰富，但由于涉及活病毒在人体的应用，在人体试验和推广上存在伦理学上的障碍，所以多年来一直进展缓慢。以上两个途径各有自身的优势和劣势。最终究竟哪条途径能通向完全的成功，目前还很难说。本文主要简介减毒活疫苗这条途径所取得的主要进展。主要参考资料是《 Journal of General Virology 》 2019 年 8月发表的一篇综述论文（参考文献１）。摘要狂犬病毒在临床发病后必然引起致命的脑炎。尽管有安全有效的疫苗，狂犬病脑炎一旦出现临床症状就无法治疗，有记录的幸存者极少。狂犬病治疗的一个主要障碍是狂犬病毒的嗜神经（ neurotropic ）性质，同时血脑屏障（ BBB, blood–brain barrier ）对大分子物质的排除限制使得向中枢神经系统 (central nervous system ， CNS) 输送抗病毒药物和分子存在固有的问题。本综述重点介绍在处治临床狂犬病时为克服大分子递送方面的障碍所作的努力，概述当前在开发实验性活狂犬病毒疫苗方面所取得的进展，包括通过现有基因的多次重复或突变对狂犬病毒载体进行减毒，或将非病毒元素整合进病毒基因组内。该疫苗可能在未来应用于治疗已出现临床症状的狂犬病。狂犬病感染后治疗 ( post-infection treatment ， PIT) 仍然是狂犬病研究的最耀眼的目标。结论暴露前或暴露后接种灭活狂犬病疫苗，以及接种 RIG （狂犬病免疫球蛋白），是目前预防临床狂犬病发展和避免人类死亡的唯一选择。然而，一旦出现临床症状，疫苗和 RIG在预防疾病进展和避免死亡方面完全无效，迫切需要有有效的 PIT （感染后治疗）方法作为替代。使用 LAVV （ live attenuated virus vaccine ，减毒活疫苗）的实验方法已经证明，在没有任何有效的抗病毒药物来对抗病毒在大脑中的复制的情况下， PIT的未来发展可能依赖于LAVV方法。 LAVVs （减毒活疫苗）已经被广泛用于根除自然界的野生动物宿主中的狂犬病，但是关于在人类感染中使用 LAVVs 在伦理上是有争议的，即使在动物模型中效果良好的实验数据已有报道。此外，狂犬病感染的严重性（ 100%致命）意味着对非人灵长类动物的研究结果越来越难以用于对在人群中进行 PIT的可能结果进行评估。尽管用抗病毒分子进行治疗在体外实验中获得了明显的成功，但在体内尝试对已出现症状的狂犬病采用抗病毒分子进行治疗的实验，从未有存活者，这说明需要考虑采用不同的方法。抗病毒药物，包括利巴韦林（ ribavirin ）、金刚烷胺（ amantadine ）和法维吡拉韦（ favipiravir ），都在体外显示出抗病毒作用，但这些体外实验的成功并没有转化为体内实验的成功。通过 LAVV （减毒活疫苗）所表达和递送的趋化因子（ chemokine ）和细胞因子（ cytokine ）的增强作用在该领域引起了极大的兴趣，并可能在未来用于狂犬病的 PIT （感染后治疗）。集中研究了以宿主分子的表达来刺激或调节对感染的不同免疫反应，来自狂犬病 LAVV （减毒活疫苗）的异源基因的表达已经取得了有希望的结果，尽管研究通常仅局限于小鼠模型。对这些 LAVVs 的成功还必须进一步研究，才可能尝试用于人类临床狂犬病的适当治疗，确保有更大的成功希望。具有高度免疫刺激能力的 G 蛋白的多个拷贝与来自活病毒的相关外源基因的联合表达，可能使未来开发有前景的 LAVVs 成为可能。在缺乏有效的抗病毒分子的情况下， LAVVs 可能代表临床狂犬病治疗的未来。美国费城 Thomas Jefferson 大学的 Bernhard Dietzschold 等证明：用狂犬病毒 (RV) 减毒活疫苗 TriGAS 进行 PIT （感染后治疗），可通过快速诱导中枢神经系统 (CNS) 组织中的适应性免疫相关基因的表达而导致野生型 RV （狂犬病毒）从 CNS 中被清除，使大部分受感染的小鼠得以生存，从而使该疫苗有可能用于狂犬病的治疗。采用新型 RV 减毒活疫苗，即含三个糖蛋白分子的 RV 减毒变种 TriGAS ，对被野生型 RV 感染的小鼠进行 PIT ，可在致病的 RV 已经入侵大脑并在其中复制的情况下提高小鼠的存活率。 PIT 的成功是由于诱导产生了强有力的 RV 中和抗体应答，从而能将野生型 RV 从脑中彻底清除。从大脑中清除 RV ，需要在周围神经和 CNS 中快速诱导强大的先天免疫和适应性抗 RV 免疫。作者已经确定了 TriGAS 诱导有可能参与这一进程的几个基因。确定与这些基因产物的诱导相关的上游和下游路径以及这些基因产物的活性，最终将有助于进一步认识从 CNS 中清除 RV 所涉及的机制，并最终有助于延长 PET 的窗口期：从暴露后数天一直延长到 RV 已经到达 CNS 之后。这也就是说，在暴露于狂犬病毒后即使症状已开始出现，此时再开始 PIT 仍然可能有效，从而使狂犬病的真正意义上的治疗成为可能。这项新的研究成果将为狂犬病的治疗研究开辟一条新途径。参考文献： 1.　 Trying to treat the untreatable: experimental approaches to clear rabies virus infection from the CNS ， Journal of General Virology ， 2019;100:1171 – 1186. DOI ： 10.1099/jgv.0.001269 .　 2.　 Postexposure Treatment with the Live-Attenuated Rabies Virus (RV) Vaccine TriGAS Triggers the Clearance of Wild-Type RV from the Central Nervous System (CNS) through the Rapid Induction of Genes Relevant to Adaptive Immunity in CNS Tissues ， Journal of Virology ， 2012,86(6)3200-3210;DOI:10.1128/JVI.06699-11 . 3.　 A knockout vaccine for rabies?6 July 2009| Nature | doi:10.1038/news.2009.627 相关博文：狂犬病治疗首次重大突破：两种人源单抗结合治疗方案动物实验成功（ 1） 2020-10-10; 个人分类: 狂犬病防治|6633 次阅读|0 个评论

抗体能清除中枢神经系统中的狂犬病毒吗？: 热度 30 yanjx45 2011-8-2 11:04; 许多网友，特别是其中的“恐狂症”患者最喜欢提出这样的疑问：狂犬病毒一旦进入神经细胞，接种疫苗后产生的抗体是否就没有用了？由于血脑屏障 (BBB) 的存在，抗体是否无法进入中枢神经系统 (CNS) ，因而无法清除其中的病毒？狂犬病毒是否会在 CNS 中潜伏，并在多年后发作？科学是不断发展、进步的。大量原有的和新发现的证据都表明，狂犬病毒的抗体不仅能中和掉外周神经细胞内的病毒，在一定条件下也可能彻底清除 CNS 中的病毒；而在任何情况下，狂犬病毒都不可能在 CNS ( 包括脑和脊髓 ) 中长期潜伏。（一）狂犬病的病理学 WHO 在今年 2 月发布的系列丛书之一“狂犬病的免疫学基础”中就明确指出：“将有毒力的狂犬病毒接种到模型动物，病毒可能在接种部位（通常在肌肉组织）复制，也可能不经复制而直接进入分布在伤口附近的外周神经。狂犬病毒一旦进入神经元，则它有潜在的可能被中和，虽然早期研究认为这种可能性较低。……有大量实例证明，在病毒暴露发生几天甚至几个月后才进行暴露后预防 (PEP) 也可能会有效，说明狂犬病毒中和抗体 (RVNA) 有时也可能将狂犬病毒从中枢神经系统（ CNS ）中清除。” 狂犬病毒通过伤口或与粘膜表面直接接触而进入体内，但病毒不能穿过没有损伤的皮肤。狂犬病毒又称慢病毒，增殖速度很慢。少量病毒刚进入体内时，不进入血液循环（通常在血液中检测不到狂犬病毒）。病毒粘附或进入几类细胞，例如运动和感觉神经，通过神经内的逆向轴浆流动向 CNS 移动。病毒移动的速度很慢，为每天 15-100mm 。根据侵入的病毒量和侵入部位，狂犬病潜伏期为 2 周到 6 年不等（平均 2-3 个月）。病毒侵入部位越靠近 CNS ，潜伏期就可能越短。在潜伏期，狂犬病毒主要在外周肌肉或神经细胞中存在。狂犬病的最短潜伏期可能只 10 天左右，通常发生在头面部严重咬伤、又没有同时接种免疫球蛋白的人。疫苗引发的抗体要到 14 天后才能达到一定滴度，对这类潜伏期特别短的病人可能就太晚了。狂犬病毒是嗜神经病毒，一旦进入 CNS 后会迅速增殖（但仍比其他多数病毒慢），如无抗体抑制，推测数天（如 3 － 5 天）内会感染 CNS 中的大量细胞，从而引发症状。从少数病毒到达大脑，到病毒增殖到一定的数量，并引起大脑功能障碍 ( 表现为发病 ) ，需要一定的时间，也就是说仍有一个较短的潜伏期。但这个时间相对较短，即狂犬病毒不可能在 CNS 中长期潜伏。病毒在进入大脑后，在开始快速增殖的同时，也会从 CNS 通过顺向轴浆流动进入周围神经，导致邻近的某些非神经组织（如唾液腺）的感染。唾液腺的解剖位置离大脑实际上非常近。唾液腺等部位可能在大脑功能明显受损 ( 即发病 ) 之前 1-3 天就有病毒分泌出来，即在发病前一个很短时间内就可能有传染性。当然，如抗体产生太迟，病毒不仅进入了大脑，而且已经将大脑的功能破坏了，即如果病人已发病，此时再清除病毒为时已晚，并不能挽救患者的生命。（二）判断狂犬病发病风险的一个简单实用的标准狂犬病毒进入 CNS 后，在 3-5 天内，要么被清除，要么发病，即只有很短的潜伏期。狂犬病人一旦发病，通常在一周内就会死亡。在任何情况下，狂犬病毒都不可能在 CNS 中长期潜伏。狂犬病不存在隐性感染，即不可能像其他某些传染病一样，部分被感染者不发病，而且还可能在随后产生免疫力。狂犬病也不存在所谓“健康带毒”或病后康复 ( 治愈 ) 的可能。虽接种了疫苗，如果在疫苗发挥作用前就开始发病，仍是 100% 必死无疑。实际上疫苗接种失败多数都出现在第一针开始后的 20 天之内，主要是头面部被严重咬伤的患者。目前的世界纪录是有一例在接种完疫苗后第 3 天仍然发病的。如果过了这个时间还未发病，以后再发病的可能性几乎不存在。狂犬病毒不引起大脑细胞形态的改变，狂犬病毒在人体内的行踪在发病前是无法检测的，只能根据症状判断功能是否受损。“发病”前检测到足夠高的抗体，就证明其大脑功能尚未受损，至少是未严重受损，他以后就不会再发病。十余年来，凡在发病前在我们单位检测到抗体效价为 0.5 IU/ml 以上的，没有一例死亡。曾有实验检测脑脊液 (CFS) 中的抗体来代表脑内的抗体含量。但这种检测技术要求高，风险高 ( 可能造成人为的大脑感染 ) ，通常也没有必要，因在绝大多数情况下来检测的人并未发病，病毒也未进入大脑。从以上介绍我们可以得到一个基本的结论：只要在发病前接种完了疫苗，产生了抗体，体内（包括 CNS 内）就不可能再有狂犬病毒“潜伏”。检索国内外的相关文献资料，基本未发现与此标准相违背的病例。这是一个简单实用的判断标准，可以将绝大多数“恐狂症”患者从对狂犬病的盲目恐惧中解放出来。（三）抗体能清除 CNS 中的狂犬病毒的若干证据： 1. 　如前所述，有大量统计资料显示，将被狗咬伤后推迟一个月甚至更长时间接种疫苗的人与那些根本未接种疫苗的人相比，仍显著提高了生存率。越早接种，生存率越高。但推迟接种也仍然可能有效。 2. 　西方发达国家用最现代的生命支持系统维持狂犬病患者的生命，某些经积极抢救维持了较长时间生命的患者在死后尸检时，发现全身（包括 CNS ）的狂犬病毒都被彻底清除干净，这证明机体固有的免疫应答能够清除体内感染的狂犬病毒，可以间接证明抗体可进入 CNS ，清除 CNS 中的病毒。只是清除太晚也没有用，此时如果患者的大脑功能已受损，仍不能避免死亡。美国医生 Willoughby ( 他的团队于 2004 年在世界上首次治愈未接种过狂犬病疫苗的狂犬病人 ) 认为，神经传导功能紊乱，包括自主神经功能异常，是狂犬病患者死亡的主要原因，因而通过麻醉抑制患者神经系统功能减退，直至机体产生固有免疫应答，似乎是一种合理的治疗措施。按这一治疗方案，最近又有治疗成功的报导。（一个附带的问题：有网友提出疑问：死后对脑组织标本进行 DFA 检测是确诊狂犬病的金标准，狂犬病人死后通常脑中充满了病毒，很容易用荧光标记的抗体进行检测、确证。你怎么又说病人死后病毒可以从 CNS 被彻底清除呢？上述“金标准”是否也会不适用呢？回复：“狂犬病人在死后体内病毒已经被彻底清除”仅是极个别情况，只出现在国外采取了特殊措施大大延长了病人生命的情况下。“金标准”仍是金标准。） 3. 　数十年来全世界疫苗生产和监管部门用于检测狂犬病疫苗效价的标准试验－－ NIH 试验，也可直接证明抗体能从 CNS 中清除狂犬病毒。该实验的过程可简述如下：给多组小鼠分别接种不同稀释度的待试疫苗和参考品疫苗，在第 1 天和第 7 天各接种 1 次，到第 14 天，直接往小鼠大脑中注射一定数量的活病毒，看多大浓度的疫苗能保护小鼠在接种病毒后的 14 天内一直成活。每一批人用狂犬病疫苗在出厂前都要在小鼠体内做 NIH 试验，这类实验所用的预先定量的活病毒是直接注射到小鼠的脑内，等于注射到 CNS 。该实验可充分证明疫苗产生的抗体能清除大脑中的病毒。这样的实验在中国几乎天天在进行。 4. 　全球最权威的狂犬病研究单位之一――美国 Wistar 研究所于 1992 年 8 月在美国科学院院报（ PNAS ）上曾发表一篇题为《抗体介导的将狂犬病毒从 CNS 清除的机制》的研究论文，证明有些单克隆抗体在体外可抑制病毒的传播和病毒 RNA 的转录；在动物实验中，用该单抗对暴露后的小鼠和大鼠进行治疗，证明抗体可清除 CNS 中的病毒，防止致命的狂犬病毒的感染。小鼠体内实验的过程：按每组 10 只小鼠，接种 5 种糖蛋白特异的单克隆抗体，分别用 4 种浓度（ 10 ， 2 ， 0.4 ， 0.08 IU/0.1 毫升），每只小鼠接种 0.1 毫升到腓肠肌。 24 小时后，小鼠肌肉注射 0.1 毫升 CVS - 24 病毒。动物在接种病毒后观察 3 周，每天记录发病和和死亡数量。结果：单克隆抗体 1112-1 在浓度低至 0.08 IU/0.1 毫升的情况下，仍能保护 80% 的小鼠，而对照组（没有使用单抗）小鼠全部死亡。大鼠体内实验：将大鼠通过滴鼻感染狂犬病毒。在感染后的不同时间（ 1 ， 2 ， 4 ， 8 ， 12 ，和 24 小时），用单克隆抗体 1112-1 （ 0.1 毫升含有 30 IU 单抗）进行治疗。鼻内接种病毒后，狂犬病毒基因组在感染后 6 小时在嗅球处可检测到，感染后 12 小时在中脑处可检测到。在感染后 12 和 24 小时进行治疗，分别有 100% 和 80 ％的动物没有狂犬病毒感染的迹象， 30 天后在幸存的动物的大脑未能检测到病毒 RNA 。与此相反，所有未使用单抗的动物死于狂犬病毒感染。这个实验表明，抗体能介导狂犬病毒从被感染的神经组织的清除，从而防止了致命的狂犬病毒脑脊髓炎导致的死亡。 5. 　有些正在试验中的新型狂犬病毒减毒活疫苗在小鼠已发病但处于发病早期时接种，仍能挽救小鼠的生命，这也证明抗体可能进入 CNS ，而且病毒本身可在 CNS 中产生抗体。（四）机理：抗体如何通过血脑屏障？抗体如何通过血脑屏障（ BBB ），达到感染的神经元？ BBB 的通透性是相对的而不是绝对的，会受很多因素影响而发生改变。新的资料证明抗体也可在脑脊液中检出，但由于 BBB 的存在，与外周血液中的抗体相比，在脑脊液中虽然也可检测到中和抗体，但出现的时间稍晚、浓度稍低。狂犬病毒的颗粒含有多种 ( 多个 ) 蛋白质和核酸大分子，每个病毒颗粒比单个的抗体分子的体积要大许多。比抗体分子大得多的狂犬病毒颗粒是怎样突破 BBB 进入 CNS 的呢？推测狂犬病毒作为嗜神经病毒，为能成功地入侵 CNS ，必然具有能主动地导致血 / 脑屏障破坏的功能。已知一种嗜神经的流感病毒在小鼠中就会显示这种功能。推测狂犬病毒也能破坏 BBB ，改变其通透性。据此也可推论狂犬病疫苗诱生的抗体也可能利用 BBB 在病毒感染状态下通透性的改变，乘机涌入 CNS ，追杀狂犬病毒。在前述证据 4 的实验中，狂犬病毒感染的大鼠用抗体治疗后，其大脑在显微镜下未发现神经细胞受损伤的迹象。在 CNS 中，狂犬病毒抗体介导的病毒清除机制，不同于抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或补体依赖的裂解作用。抗体可以在 CNS 遭受病毒入侵后，抑制病毒从细胞到细胞的传播，阻断病毒 RNA 的转录和复制，从而阻止病毒感染。除了抗体，病毒感染诱导的细胞因子、神经肽和神经递质等其他因素也可能参与清除过程。总的来讲，尽管目前可以肯定，狂犬病毒中和抗体在一定条件下也可能彻底清除 CNS 中的病毒，但与其他许多嗜神经病毒相比，对狂犬病毒抗体的相关作用机制的了解还不是很清楚，有待进一步深入研究。; 个人分类: 狂犬病防治|43423 次阅读|78 个评论

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