本文转载自嘉因微信公众号，已获得授权。查看最新文章，敬请关注嘉因，微信ID：rainbow-genome 作者：小丫来源： 嘉因 文中有【彩蛋】脑补2016年一篇Science paper作者的心路历程： MYC regulates the antitumor immune response through CD47 and PD-L1, Science , 2016. 我对 PD-L1、CD47 感兴趣，想知道 它们受哪个转录因子调控 。 Fig. S1 A. Two key immune regulatory proteins expressed on the cell surface of tumor cells, CD47 and PD-L1, and the immune cells that recognize them. 用《 他中了国自然，因为最后一周补了这张图 》的方法，获得了两个list，list 1 是 结合 PD-L1启动子的转录因子 ，list 2 是 结合 CD47启动子 的转录因子，取交集，发现 MYC既结合 PD-L1又结合CD47 ，如下图，这样我就 把免疫通路跟癌症通路联系起来了！！！ ChIP-seq数据提示：MYC结合在CD47和PD-L1的启动子上 Fig. 2 C. ChIP-seq analysis of MYC binding to the promoter sequence of the genes encoding CD47 and PD-L1 in mouse MYC T-ALL cells. ChIP-sequencing traces were generated from GSE44672. 没错， 这套ChIP-seq是已发表的 。 有了这么重要的发现，Key Figure就出来了，进而 提出假说 ： Fig. S17. MYC regulates the immune response against tumor cells via CD47 and PD-L1. Model demonstrating the regulation of immunological checkpoints in MYC-driven tumors. Following MYC inactivation, the expression of CD47 and PD-L1 is reduced, leading to an immune response and the subsequent induction of senescence and shutdown of angiogenesis 接下来，怎样设计方案，圆这个故事呢？ 套路： 先用《 他中了国自然，因为最后一周补了这张图 》找到 关键 调控关系；作为文章的第二部分的 Key Figure ； 用R2 platform或TCGA的RNA-seq数据证实转录因子-靶基因的表达相关性《 TCGA，她已经用了七年 | 资深用户深度点评 》；补RT-qPCR和Western blot实验，从RNA和蛋白质水平证实转录因子对靶基因的调控作用；作为文章的第一部分； 有了上面两个方面的研究基础，你就相当有信心，确定转录因子直接调控了靶基因的转录。老板会非常乐意花钱做ChIP-seq或ChIP-qPCR，探索更多处理条件或发育阶段结合关系/强度的变化；作为文章的第三部分； 细胞实验、小鼠实验探讨转录因子和靶基因的功能；作为文章的第四部分； 众多5分文章做了第2和第4步，加上第1和第3步，立刻给你的文章加5分。 如何实现？ 哪个转录因子调控我的基因？嘉因表观小助手帮你实现，72h交付结果，微信ID：epigenomics； 基因表达相关性分析，跟着嘉因公众号的帖子学着做； ChIP-seq，从ChIP实验、测序到多种数据整合分析和挖掘，嘉因生物帮你实现； 常规细胞生物学和分子生物学实验，包括细胞培养、过表达和敲降、肿瘤生长实验、小动物成像分析、RNA提取和RT-qPCR、流式分析、免疫组化；如果这些你也做不了，让我想想； 转基因和基因敲除细胞、小鼠，模式生物平台帮你实现。 下面详细解读，跟作者学学实验方案的设计： 第一部分：用最简单的实验初步证实靶基因被MYC调控 （shRNA knockdown MYC，RT-qPCR ，R2 platform） 先借助Tet-off 白血病 转基因小鼠模型，可以人为控制MYC表达或不表达（ON或者OFF）。用RT-qPCR，证实MYC调控了CD47和PDL1的表达。 Fig. 1. MYC regulates the expression of CD47 and PD-L1 in murine and human leukemia and lymphomas 白血病是这样， 实体瘤里什么情况呢？ 1. 先看Tet-off肝癌转基因小鼠模型，没有Tet-off模型也没关系，用 shRNAknockdown MYC或抑制剂处理的人肝癌细胞系HepG2、melanoma SKMEL28、非小细胞肺癌H1299，用RT-qPCR和流式分选的方法，证实了MYC对CD47和PDL1表达的影响。 Fig.2 A-B 2. 用R2 platform 挖掘已发表的human primary tumors基因表达数据。发现人HCC、肾癌、结肠癌中MYC与CD47和PD-L1的表达显著相关。 小丫想：用TCGA的RNA-seq数据也能得出相似的结论。可是，当我看到这句： R2 contains mRNA gene expression profiles for more than70.000 individual human samples ，TCGA也要自惭形秽了。R2是个超级强大的平台，不仅数据超级多，还能直接在线挖掘和可视化，由下图可见一斑，长按，识别二维码，直达R2网站。这是这篇Science paper里隐藏的【彩蛋】！ 结论： 多种人类癌症类型里，MYC都调控了CD47和PD-L1的表达。 在小鼠肿瘤和人肿瘤细胞中，抑制MYC会导致CD47和PD-L1的mRNA和蛋白质水平降低。 Fig. 2. MYC regulates CD47 and PD-L1 expression in human and mouse tumors and binds to the promoters of the corresponding genes. 第二部分：用公共数据证实 MYC结合 靶基因 （ChIP-seq） 用RNA-seq或RT-qPCR看到了调控关系，直接调控？间接调控？傻傻分不清，要做ChIP才能in vivo证实直接结合。 别上来就自己做ChIP-seq，先查已发表的数据能不能用，这里有方法《 转录因子调控了谁？挖全天下所有高通量实验数据，只为您解决这一个问题 》。找到了2014年发表的两篇文章产生的MYC ChIP-seq数据 ：Activation and repression by oncogenic MYC shape tumour-specific gene expression profiles. Nature 2014 Jul 24;511(7510):483-7. PMID:25043018；和BIM is the primary mediator of MYC-induced apoptosis in multiple solid tissues. Cell Rep 2014 Sep 11;8(5):1347-53. PMID:25176652 查看PD-L1和CD47、CD25等基因启动子区域的结合信号，画出开篇那个神图 Fig. 2 C和F ig. S7 and S8 。MYC对靶基因的调控有dosage-dependent specific effects。T-ALL和B cell line P493-6，MYC在CD47和PD-L1的启动子上有很强的结合信号，而在CD8a和CD25等基因的启动子上结合信号较弱。 结论： MYC直接结合CD47和PD-L1的启动子。 第三部分：in vivo，小鼠实验 作者2010年发现MYC inactivation in mouse tumor models results in recruitment of immune cells to the tumors。CD47和PD-L1在这一过程中起到什么作用呢？ 结论： 小鼠肿瘤中MYC的失活导致CD47和PD-L1下调表达，增强了抗肿瘤免疫应答。 在强制表达CD47和PD-L1的肿瘤里，MYC的失活会抑制免疫应答，肿瘤继续生长。 MYC通过调控免疫调控分子来起始并维持了肿瘤发生。 Fig. 3. Constitutive expression of CD47 and PD-L1 in mouse MYC T-ALL 4188 cells prevents recruitment of immune effectors after MYC inactivation. Fig. 4. Down-regulation of CD47 or PD-L1 is required for tumor regression, shutdown of angiogenesis, and induction of senescence upon MYC inactivation. 扩展阅读： PD-L1发现者陈列平教授谈肿瘤免疫治疗 | CSCO2017年会感受 最后分享生物通对这篇paper的介绍，节选自http://www.ebiotrade.com/newsf/2016-3/2016310102749212.htm 这一研究发现第一次将肿瘤发生发展中的两个关键步骤： 失控的细胞生长与能够瞒骗意图阻止它的免疫分子 联系到了一起。当Myc突变或失调控时，可导致促进细胞分裂的蛋白质水平升高。 “不要吃我”与“别找我” 其中的一个分子是 CD47 蛋白，斯坦福大学Irving Weissman博士实验室的研究人员曾发现它作为“ 别吃我 ”信号，挡开了吞食癌症的免疫细胞——巨噬细胞。几乎所有人类癌症细胞都在其表面表达高水平的CD47，当前有一种CD47蛋白靶向性抗体已进入1期临床试验治疗各种人类癌症。 另外一个分子是称作为 PD-L1 的“ 别找我 ”蛋白，已知在癌症及免疫疾病过程中PD-L1抑制了免疫系统，但它也存在于正常妊娠过程中。PD-L1常在人类肿瘤细胞表面过表达。一种结合PD-L1的抗体已获得美国食品和药物管理局批准用于治疗膀胱癌的非小细胞肺癌，研究证实它可以有效地治疗许多癌症。 在癌症中，Myc是嫌疑犯 十多年来Felsher实验室的研究人员一直从事Myc蛋白研究。Myc是由癌基因编码。癌基因通常履行一些至关重要的细胞功能，当发生突变或错误表达时它们会变成强大的癌症促进者。在一半以上的人类癌症中都存在Myc癌基因突变或失调控。 尤其是，Felsher实验室一直在研究一种称作为癌基因成瘾的现象——它是指肿瘤细胞完全依赖于癌基因的表达。在这些情况下阻断Myc基因的表达，可使得动物体内的肿瘤完全消退。 在2010年，Felsher和同事们证实这种消退现象只发生在免疫健全的动物中，但却不清楚其原因。 关闭Myc的表达 Casey和Felsher决定看看，Myc表达与癌细胞表面CD47 和PD-L1蛋白水平之间是否存在关联。为此，他们调查了当关闭小鼠或人类肿瘤细胞中的Myc表达时发生的事情。他们发现Myc下降导致了小鼠和人类急性淋巴细胞白血病细胞、小鼠和人类肝癌细胞、人类皮肤癌细胞及人类非小细胞肺癌细胞表面CD47和PD-L1蛋白水平类似地下降。 在来自成百上千患者公开的肿瘤样本基因表达数据中，他们发现了Myc表达水平与肝脏、肾脏和大肠癌中CD47和PD-L1基因的表达水平密切相关。 随后研究人员直接检测了D47和PD-L1基因的调控区域。他们发现高水平的Myc蛋白直接结合了小鼠白血病细胞及人类骨癌细胞系中D47和PD-L1的启动子区域。他们还证实这种结合提高了人类血细胞系中的CD47基因表达。 可能的治疗协同作用 最后，Casey和Felsher改造小鼠白血病细胞不管Myc的表达状态持续表达CD47或PD-L1基因。相比对照细胞，这些细胞能够更好地躲避巨噬细胞和T细胞一类免疫细胞的检测，但不同于Felsher实验室以往的实验，当失活Myc表达时这些细胞生成的肿瘤并没有消退。 Felsher说，研究表明， 组合靶向Myc和CD47或PD-L1的治疗方法有可能通过减慢或终止肿瘤生长，并向免疫系统挥舞红旗来产生协同效应 。
本文转载自嘉因微信公众号，已获得授权。查看最新文章，敬请关注嘉因，微信ID：rainbow-genome 作者：小丫 来源： 嘉因 国自然倒计时1个月，想挖机制，还想加个图，体现工作量，显得基础扎实，怎么办？ 比如说基因已经做了功能研究，需要挖机制，完善故事；再比如说lncRNA KO/KD已经看出表型，可是找它调控了谁太难了。那咱换个思路， 往上找，找它受哪个转录因子调控，参与哪个明星通路 。 这种图既能 讲机制 ，又能在 短时间内画出来： c-fos基因附近有 多个enhancer ， CBP、RNAPII、NPAS4结合在enhancer上 ，其结合强度跟细胞膜极性呈负相关。 出自例文一 Nature 2010 Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers Greenberg Michael E., Kreiman Gabriel, Worley Paul F., Bito Haruhiko, Kuhl Dietmar, Markenscoff-Papadimitriou Eirene, Kuersten Scott, Barbara-Haley Kellie, Laptewicz Mike, Harmin David A., Wu Jing, Bear Daniel M., Costa Allen M., Gray Jesse M., Hemberg Martin and Kim Tae-Kyung 这种图能回答什么问题？ 《 哪个蛋白质调控我感兴趣的基因？ 》一文的Plan A，最后画的就是这样的结果图。它能 回答七个问题 ： 您感兴趣的基因附近有哪些调控因子？ 转录起始位点在哪？ promoter在哪？ enhancer在哪？ 哪个enhancer最有可能调控我的基因？ 哪些转录因子在promoter区调控转录？ 哪些转录因子在enhancer区调控转录？ 这种图能揭示什么机制？ 基因附近多个位置有DNase/ATAC-seq的峰，推测这些位置有调控蛋白结合； 用H3K4me3和PolII的峰推测基因转录起始位点TSS的位置； TSS附近有转录因子ABC的峰，推测转录因子ABC结合在promoter，从而参与了基因X的转录调控； 用H3K27ac、EP300的峰推测基因附近存在enhancer； 用基因两侧CTCF的峰推测这一区域内enhancer上的转录因子参与调控基因X的可能性更大； Enhancer上有转录因子DEF的峰，推测转录因子DEF参与基因X的远距离调控。 这些调控因子的功能、它们在全基因组范围的分布规律，可回复“TF2”，用factorbook查看。 暂时不补实验，怎样完善故事？ 表达相关性分析和生存分析，推测转录因子ABCDEF和基因X的原癌/抑癌作用，推测转录因子ABCDEF对基因的调控作用是激活/抑制，参考《 TCGA，她已经用了七年 | 资深用户深度点评 》 查文献，转录因子ABCDEF在某癌症中的功能、参与的pathway，最好能跟明星分子或明星通路联系起来，参考《 国自然、毕业论文、遗传咨询一站搞定 | 最全的研究进展COREMINE 》 怎样开展下一步实验 1. 不同处理条件下转录因子ABC的结合强度变化； 前面用别人的ChIP-seq发现了转录因子ABC结合在基因X附近，下面自己做ChIP-qPCR，查看多种treatment条件下转录因子ABC的结合强度变化，例如野生型和突变型的对比，药物处理前后的对比。 例文二 PLoS Genetics 2010 GC-Rich Sequence Elements Recruit PRC2 in Mammalian ES Cells Madhani Hiten D., Bernstein Bradley E., Ku Manching, Chi Andrew S., Issac Biju, Zhou Vicky W., Truong Thanh, Koche Richard P. and Mendenhall Eric M. 2. 转录因子AB对同一通路其他重要基因的调控； 前面发现了基因X上游有转录因子ABCDEF结合，推测他们调控了基因X的转录。接下来通过查文献，选两个重要的转录因子AB做ChIP-seq，同时结合 motif分析 ，找到同一通路中，也被转录因子AB调控的其他重要基因，一起讲个Big story。 例文三 Nature 2012 Regulation of Circadian Behavior and Metabolism by Rev-erbα and Rev-erbβ Evans Ronald M., Panda Satchidananda, Downes Michael, Auwerx Johan, Liddle Christopher, Glass Christopher K., Atkins Annette R., DiTacchio Luciano, Chong Ling-Wa, Lam Michael T., Barish Grant D., Yu Ruth T., Hatori Megumi, Zhao Xuan and Cho Han 3. 位于enhancer区域的转录因子DEF对基因X的远距离调控的验证； 发现了enhancer，也找到enhancer上结合了哪些TF，就要问：这个enhancer调控的是基因X吗？用3C实验验证enhancer调控了基因X。 例文四 Nature 2010 Mediator and Cohesin Connect Gene Expression and Chromatin Architecture Young Richard A., Dekker Job, Taatjes Dylan J., Levine Stuart S., Rahl Peter B., Goossens Jesse, Ebmeier Christopher C., van Berkum Nynke L., Orlando David A., Zhan Ye, Bilodeau Steve, Newman Jamie J. and Kagey Michael H. 怎么画 这图 ？ 看过1-6步，就能画出这样的神图： 原理 在线快速查看结果 局限性 速查表 从哪里下载数据 怎样批量处理数据 怎样展示结果 《 Plan A详细步骤1234 》详细描述了1234； 《 Plan A详细步骤56 》详细描述了56； 本文解答了第7步。 小丫画的图长啥样？ 例文五 Nature biotechnology 2010 Transcript assembly and abundance estimation from RNA-Seq reveals thousands of new transcripts and switching among isoforms Pachter Lior, Wold Barbara J., Salzberg Steven L., van Baren Marijke J., Kwan Gordon, Mortazavi Ali, Pertea Geo, Williams Brian A. and Trapnell Cole 作者认为Fhl3有个 新的isoform（黄色） ，位于 RefSeq isoform（蓝色） 的第一个intron里。TAF1和PolII ChIP-seq的峰支持了Fhl3的这个新的转录起始位点（TSS）。 没错，这个方法还能帮你 鉴定lncRNA转录起始位点 。 Figure 3. Excluding isoforms discovered by Cufflinks from the transcript abundance estimation impacts the abundance estimates of known isoforms, in some cases by orders of magnitude. Four-and-a-half-LIM domains 3 (Fhl3) inhibits myogenesis by binding MyoD and attenuating its transcriptional activity. (a) The C2C12 transcriptome contains a novel isoform that is dominant during proliferation. The new TSS for Fhl3 is supported by proximal TAF1 and RNA polymerase II ChIP-Seq peaks . Paper里用的是Mouse skeletal muscle C2C12 cells，小丫好奇人的同源基因是不是也有个新的isoform，刚好手里有所有已发表的人Fetal Liver的ChIP-seq数据，找出哪些转录因子结合在FHL3附近，画出了下面这个图： 位于屏幕中间那个基因就是FHL3，参考基因组上认为它的转录起始位点TSS位于第一个黑框里，然而我们看到第2和第3个黑框里也有PolII的结合信号，难道这里也有两个新的isoform？另外，GATA1、NFE2和TAL1在相同的位置也有很强的结合信号，这里一定有故事。 本文这些例文都是用《 找到了motif，怎样展示结果？ 》介绍的工具找到的，文章有点老。明天找找新paper，再跟大家分享。
志贺氏菌毒力基因调控机制 — 从染色体 、质粒分配到转录调控 在现代社会中，细菌性痢疾仍然是全球公共卫生安全面临的重大威胁之一。在发展中国家，细菌性痢疾的危害尤为严重。志贺氏菌属于革兰氏阴性杆菌，是导致细菌性痢疾的首要病原体。细菌性痢疾每年造成数十万人死亡，尤其对儿童的威胁最大 。 福氏志贺氏菌 是引起细菌性痢疾的主要病原体之一。在过去十几年中，我国流行的福氏志贺氏菌优势株为福氏 2a 301株。然而，最近我国科学家研究表明，新发现的福氏Xv志贺氏菌已经成为我国流行的优势菌株 。在以往的研究工作中，我们于2001年完成了福氏志贺氏菌2a301株的全基因组序列测定，是我国首个独立完成的微生物基因组项目，为志贺氏菌的致病机理研究提供了完整的遗传背景信息 。 志贺氏菌的基因组序列与大肠杆菌高度同源，其致病性主要基于细菌中约 230Kb的侵袭性大质粒。志贺氏菌的毒力基因集中分布在侵袭性大质粒中约31Kb的“entry region”中。这些毒力基因编码了三型分泌系统（T3SS）的效应蛋白、结构蛋白、调控蛋白及伴侣蛋白等大量蛋白质。志贺氏菌感染引发的细胞内病理变化和细菌性痢疾的临床表现正是由于T3SS大量的细菌毒力蛋白综合作用结果 。毒力基因的表达无疑为细菌造成巨大的代谢负担。因此，在进化的过程中，志贺氏菌形成了一个精巧的毒力基因转录和表达调控体系，由来自侵袭性大质粒的调控系统和来自细菌基因组编码的全局调控系统共同组成。志贺氏菌只有在特定的环境信号的刺激下（如中性的pH值和生理温度等），侵袭过程才能够启动 。 在不适宜的环境条件下，志贺氏菌的毒力基因的表达受到抑制。染色体编码的 H-NS蛋白通过结合毒力基因启动子附近的AT富集区形成转录抑制复合物，阻止RNA聚合酶向启动子下游移动，从而在转录水平抑制毒力基因表达。在适宜环境因素的诱导下，即温度、pH值和渗透压等环境参数与小肠内环境接近时，志贺氏菌毒力基因的转录开始被激活。毒力基因的激活通过一系列级联调控步骤实现，首先包括了 virF 基因的转录激活，其产物VirF蛋白继而激活 virB 基因的转录，造成VirB蛋白的表达上调，VirB蛋白能够特异性结合位于毒力基因启动子上游的DNA顺式作用位点（ cis-acting site），从而解除H-NS介导的转录抑制作用 。最终导致位于侵袭性大质粒上的各种毒力基因转录的全面激活，引发志贺氏菌的侵袭。 VirB蛋白核心结构域（VirBcore）与毒力基因上游DNA顺式作用位点复合物晶体结构的解析为理解志贺氏菌转录调控机制迈出了坚实一步 (图1)，晶体结构显示VirB蛋白核心结构域直接结合毒力基因顺式作用位点DNA双螺旋结构的“大沟”（majorgroove），决定了VirB蛋白识别序列的特异性。此研究结果填补了国际科学界对VirB蛋白识别DNA的猜测和印证。VirB蛋白核心结构域（VirBcore）与DNA的晶体结构及其结合DNA的生物化学和生物物理学的特性进一步揭示了VirB蛋白解除H-NS蛋白抑制毒力基因转录的初步分子模型，即VirB蛋白通过C-端结构域发生寡聚化，形成VirB的多聚体。VirB通过核心结构域准确定位到启动子上游的顺式结合位点，造成DNA双链在顺式作用位点处发生弯曲；DNA的弯曲进而引起下游DNA结合到VirB多聚体的其他DNA结合位点；最终造成DNA在VirB多聚体上的缠绕。VirB诱导的DNA构象变化可破坏H-NS-DNA转录抑制复合物的稳定性，释放RNA聚合酶复合物，激活毒力基因的转录 （图2）。 然而，细菌的转录调控是一个复杂的系统过程，目前对志贺氏菌毒力基因激活的分子机制的了解仅仅是冰山一角，现有的知识不足以解释 VirB蛋白如何实现基因的全局调控。比如，VirB蛋白可以在目的基因上游几千bp处实现基因的转录。这种现象是如何发生的呢？现有对VirB结构的信息和功能的研究不足以解释该现象。目前的猜测认为VirB通过桥接机制引发DNA的构型发生巨大转变从而解除H-NS的抑制。这种猜测主要基于以下理论研究，首先，VirB蛋白可以特异和非特异的结合DNA，从而在DNA上形成纤丝 ，这与其同源蛋白ParB蛋白类似，各种ParB分子集结在染色体DNA上从而形成高聚物有利于下一步的质粒分离。其次，序列分析比较发现，VirB蛋白N端结构域含有“RRLR”精氨酸簇，此簇高度保守。最近对质粒分离蛋白ParB家族spo0j研究表明 ，spo0j通过其多变的N端参与分子间的相互作用和高度保守的HTH结构域参与parS结合从而形成长形状的分子结构。 spo0j 通过其N端可以水平和垂直的与邻近分子作用从而形成高聚体。这种作用主要通过其高度保守的精氨酸簇。这种作用对其形成高聚物和ParB的播散至关重要。最后，体内单分子研究表明，spo0j可以使DNA形成环。对精氨酸簇突变（RRLR）研究表明其完全破坏了DNA桥。以上研究解释了为什么有限的spo0j（每个parS位点只有20个分子）分子可以跨越几千bp从而利于parB分子装载SMC复合物参与了染色体的分离 。 因此， DNA桥接是多种parB同源物的共同特性，志贺氏菌VirB蛋白可能具有相同的特性，这也暗示了其进化的保守型。鉴于以上的分析比较parB和VirB,我们可以认为和推测尽管VirB与parB功能不同，但是保持了parB祖先的特有功能即DNA的结合和DNA桥接。因此，对于VirB蛋白N端结构域的结构解析及与DNA复合物结构的解析，进而对VirB全长蛋白以及与DNA复合物结构的解析将终结这些猜测。最终通过体内外单分子研究将进一步阐释VirB蛋白如何在宏观层面调节DNA，在体内如何调节毒力大质粒的分子机制。此研究将深入揭示质粒分离蛋白如何进化为毒力转录的分子机制。 PDB:3VWB 图 .1.VirB蛋白核心结构域与目标启动子DNA的晶体结构 图 .2. VirB蛋白拮抗H-NS转录激活机制初步模型 发表SCI论文链接： http://nar.oxfordjournals.org/content/41/22/10529.long 参考文献 1 Bardhan, P., Faruque, A., Naheed, A. Sack, D. Decrease inshigellosis-related deaths without Shigella spp.-specific interventions, Asia. EmergingInfect. Dis. 16, 1718-1723 (2010). 2 Ye, C. et al. Emergence of a new multidrug-resistant serotype X variant in an epidemicclone of Shigella flexneri . Journal of Clinical Microbiology 48,419-426 (2010). 3 Zhang, N. et al. A genomic portrait of evolution and epidemic spread of arecently emerged multidrug resistant Shigellaflexneri clone in China. Journal ofClinical Microbiology , doi:10.1128/jcm.02669-13 (2014). 4 Jin, Q. et al. Genome sequence of Shigellaflexneri 2a: Insights into pathogenicity through comparison with genomes of Escherichia coli K12 and O157. Nucleic Acids Research 30, 4432-4441(2002). 5 姜铮,王芳,何湘,黄留玉,袁静.志贺氏菌致病机制研究进展. 中国热带医学9, 1372-1383 ( 2009). 6 朱立, 王恒樑. 志贺氏菌三型分泌系统及其致病机理. 微生物学报 50, 1446-1451 (2010). 7 Kane, K. A. Dorman, C. J.VirB-mediated positive feedback control of the virulence gene regulatorycascade of Shigella flexneri . Journal of Bacteriology 194, 5264-5273(2012). 8 Gao, X. et al. Structural insights into VirB-DNA complexes reveal mechanism oftranscriptional activation of virulence genes. Nucleic Acids Research 41, 10529-10541 (2013). 9. Chen BW, Lin MH, Chu CH, HsuCE, Sun YJ Insights into ParB spreading from the complex structure ofSpo0J and parS. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 112(21):6613-6618 (2015) . 10. Graham TGW ,et al. ParB spreading requires DNA bridging. Genes Development 28(11):1228-1238 (2014) .
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