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Nat Comm | 赵文会/李大为揭示OTUD5-TRIM25通过去泛素化活性调控肿瘤增殖机制
PTMBio 2020-9-7 14:21
泛素（Ub）修饰蛋白 在许多细胞过程中起关键作用，其参与包括信号传递、转录调控、细胞周期、增值凋亡、DNA修复损伤、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控，并且与肿瘤、心血管等诸多疾病的发病密切相关。 卵巢肿瘤蛋白酶 （ovarian tumor，OTU）是 去泛素酶 （DUB）中被广泛关注的重点，其中 OTUD5 是多种细胞过程的关键调节剂，包括DNA损伤修复、转录和先天免疫等。然而迄今为止，OTUD5在肿瘤发生中的功能仍然未知。 近日，北京大学健康科学中心 赵文会 团队联合苏州大学附属张家港医院转化医学中心 李大为 团队在国际著名期刊 Nature Communications（IF=12.121） 发表了最新研究成果， 揭示了去泛素化酶OTUD5通过去除TRIM25泛素化进而参与转录调控，促进肿瘤进程的新机制。 小鼠异种移植模型和人类肿瘤细胞实验进一步证实了，OTUD5-TRIM25轴在调节肿瘤生长中起重要作用，为肿瘤的治疗提供了新的潜在靶标。 1、TRIM25介导了OTUD5缺失诱导的肿瘤增殖作用 研究人员首先发现，敲除去泛素化酶OTUD5能够显著促进肿瘤细胞增殖。而另一方面，三重基序蛋白25（Tripartite motif-containing protein 25， TRIM25 ）属于E3泛素连接酶家族，是可促进细胞增殖和迁移的一类蛋白。研究人员因此进一步探讨了TRIM25在敲除OTUD5诱导细胞增殖中的作用。结果表明，敲低TRIM25部分抑制了OTUD5敲除导致的细胞增殖，这表明 OTUD5缺失导致的细胞增殖促进作用可能是由TRIM25介导 。 进一步突变体实验（OTUD5、OTUD5/C224S、OTUD5/S177A）和体外去泛素化实验证明， OTUD5的去泛素化酶活性会使TRIM25 lys63去泛素化以调节TRIM25功能 ，在这一过程中，磷酸化对于OTUD5活性至关重要。所以，当OTUD5缺失时，TRIM25的自体泛素化与细胞增殖的关系，就是接下来研究的重点方向。 图1 OTUD5缺失下细胞以TRIM25依赖性方式加速生长，与TRIM25泛素化有关 2、TRIM25自体泛素化介导转录调控，抑制PML表达 那么，TRIM25是如何促进肿瘤发展的呢？转录组分析表明，TRIM25会使 肿瘤抑制蛋白 （promyelocyticleukemia protein， PML ）的表达下调，从而促进肿瘤细胞增殖。研究人员接下来对Huh7和Hep3B细胞进行了ChIP-qPCR分析，结果表明 TRIM25至少部分通过抑制IRF-8募集至PML启动子来抑制PML表达。 研究人员接下来测试了TRIM25在PML启动子上的富集是否受到RING域翻译后修饰的调控。结果证明，当RING结构域缺失（ΔRING）时，TRIM25突变体（TRIM25 / ΔRING）的泛素修饰较少，其向启动子的募集被大大抑制；而RING域结构完整的突变体（TRIM25 / WT）的泛素修饰表达，显著抑制了TRIM25缺失细胞中的PML表达水平。综上， TRIM25的自体泛素化对其在细胞增殖中的功能至关重要 。 图2 TRIM25的转录活性受RING域的调节 3、OTUD5-TRIM25轴调节肝癌的发展 研究人员测试了OTUD5-TRIM25轴是否会影响小鼠模型中的肿瘤生长。结果表明，来自OTUD5耗尽细胞和PML耗尽细胞的肿瘤球比对照肿瘤球生长更快且重量更大，而TRIM25敲低抑制了肿瘤球的形成。此外，OTUD5 / TRIM25双敲除细胞形成的肿瘤球体比OTUD5耗尽细胞的小，这表明 OTUD5-TRIM25轴在调节肿瘤生长中起重要作用 。 图3 OTUD5-TRIM25轴调控Hep3B细胞的肿瘤球形成 4、OTUD5显示出一般肿瘤抑制特性 最后，我们评估了OTUD5的表达及其在人类癌症中的临床意义。实验结果表明，敲低OTUD5在肺肿瘤细胞系中具有促进细胞增殖和降低PML表达的作用，而OTUD5在人非小细胞肺癌（NSCLC）中的转录水平较低，同时PML的表达也下调，均与上述结果具有一致性。此外，研究者通过TCGA数据库评估了OTUD5表达与临床病理状态、患者生存率之间的相关性，表明OTUD5表达升高的患者，其总生存期明显更长。综上，研究证明了 OTUD5有强的肿瘤抑制特性，并且在不同的肿瘤中均具有功能性后果。 图4 OTUD5表达与癌症患者的临床特征相关 本研究为去泛素化酶和泛素连接酶的协同作用提供了新的例证，揭示了OTUD5通过去泛素化TRIM25调节基因转录并抑制肿瘤发生的新机制，为肿瘤的有效治疗提供了潜在药物靶标。 图5 OTUD5通过调节TRIM25的泛素化和转录活性来调节PML表达和肿瘤发生 参考文献： 1. Fangzhou Li, et al., 2020. OTUD5 cooperates with TRIM25 in transcriptional regulation and tumor progression via deubiquitination activity. Nature Communications. 本文由 景杰学术 团队报道，欢迎转发到朋友圈。如有转载、投稿、等其他合作需求，请文章下方留言，或添加微信ptm-market咨询。
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【PROTAC】新药开发系列（九）里程碑之动物体内试验通用性
caixin5120 2019-3-2 12:31
近日，清华大学饶燏课题组在Nature子刊Cell Discovery上发表了一篇有意思的文章《 A chemical approach for global protein knockdown from mice to non-human primates》。他们将一种用雷帕霉素连接泊马度胺制成的PROTAC成功敲除小鼠、大鼠、猪和恒河猴体内的FKBP12蛋白。读者请自取亮点，个人认为这是小分子蛋白降解新药的又一个里程碑，因为它证明了其在动物试验中的通用性和有效性。 1 摘要 虽然 CRISPR/Cas9技术被使用得越来越多 ，用于蛋白质敲低的常规遗传修饰方法也非常成功。但我们还是缺乏用于在成年动物中实现蛋白质敲低的有效技术，特别是对于诸如非人类灵长类的大型动物。这里，我们报道了一种基于 PROTACs 技术的化学方法，该方法在体内有效且快速地敲除 FKBP12 蛋白。腹膜内和口服给药均导致小鼠的 FKBP12 快速、稳健和可逆的降解。在大型和小型动物（小鼠、大鼠、巴马猪和恒河猴）中均成功地证明了该方法的效率和实用性。此外，这种方法还可用于有效地敲除其它目标蛋白，如布鲁顿酪氨酸激酶（ BTK ）。 2 背景介绍 蛋白质敲低的动物模型是用于研究靶基因功能性丢失的后果的有力策略。传统上，研究基因功能性丢失的后果主要通过遗传修饰，如 RNA 干扰，转录活化剂样效应核酸酶，基于重组的基因敲除， CRISPR-Cas9 系统和其它基因组编辑策略。然而，将这些策略应用于大型动物仍具有很大的挑战性，特别是在非人灵长类动物中。这些动物在基础研究和新药发现中一直扮演着重要角色。但，上述这些方法在一定程度上无法控制基因功能的急性和可逆性变化。而且，潜在的遗传补偿在基因敲除模型中会产生自发突变的并发症，这可能会误导结果。此外，许多基因的缺失还导致动物的胚胎致死，这都阻碍了相关的科学研究。 蛋白降解靶向嵌合体（ PROTACs ）使用一个 Linker ，一端连接目标蛋白的抑制剂，另一端连接 E3 泛素连接酶的结合配体分子。 PROTAC 代表了一种化学敲低策略， PROTAC 分子将目标蛋白与 E3 连接酶拉拢，使得 E3 可以泛素化标记目标降解蛋白，然后通过蛋白酶体降解目标蛋白（图 1a ）。 Crews 研究组第一个报道基于多肽的 PROTAC 的开发，随后，越来越多研究者致力于通过 PROTAC 技术成功降解其感兴趣的蛋白质。目前， PROTAC 主要用于发现新的抗癌剂，因为它们具有优于经典抑制剂的独特优势。据我们所知，这种新策略尚未用于大型动物模型中去实现全局蛋白质敲低。与人类密切相关的模式物种恒河猴是一种独特的模型，常用于研究其类人基因组导致的各种疾病，环境因素的可控性以及实时监测代谢表型。然而，尚不清楚 PROTAC 是否在非人灵长类动物中起作用。 图 1 RC32 诱导细胞中 FKBP12 的降解 在这里，我们证明了 PROTAC 技术是一种方便、快速和可逆的化学方法，可以在活体动物（特别是猪和恒河猴）中全局和快速（ 24-72 小时）降解蛋白质。停用 PROTAC 后，蛋白质水平恢复，表明该方法在自我调节的动物体内具有成本效益和时间效率。此外，我们使用 PROTACs 在小鼠和恒河猴中敲低了 FKBP12 ，研究了 FKBP12 在维持心脏功能中的重要作用。 3 结果 3.1 降解 FKBP12 的 PROTAC 设计 在本研究中，我们选择 FKBP12 作为目标蛋白，理由如下： 首先， FKBP12 蛋白在哺乳动物中广泛表达。通过结合 Ca 2+ -release channel( RyR 受体 ) ， FKBP12 调节 Ca 2+ 信号传导来行驶重要功能，特别是在心脏。其次，因为 FKBP12 是高度保守的蛋白质，这种化学敲低策略有望用于产生具有靶向蛋白质敲低的大型动物模型（例如，猪和非人类灵长类动物）。第三，通过普遍的方法对 FKBP12 的全局敲除会因为严重的发育性心脏缺陷（例如，高血压，心室不紧密和室间隔缺损）导致胚胎致死。 FKBP12 在成人心脏功能和疾病发展中的作用仍然难以捉摸。已经证明雷帕霉素是 FKBP12 的一种有效的特异性配体，它以高亲和力（ kd=0.2nm ）调节 mTOR 信号传导。因此，我们通过聚乙二醇连接雷帕霉素（一种 FKBP12 特异性配体）和泊马度胺（一种与含 CRBN 的 E3 蛋白连接酶结合的特异性配体）设计了降解 FKBP12 的 PROTAC 分子（图 1b ）。该异双功能分子通过含 CRBN 的 E3 连接酶将 FKBP12 泛素化标记，并通过蛋白酶体途径降解 FKBP12 。因此，我们合成了一系列的 PROTACs ，并测定了它们降解 Jurkat 细胞中 FKBP12 的潜力。 我们将具有雷帕霉素和泊马度胺的嵌合体分子名为 RC32 （图 1c ）其显示出最有效的 FKBP12 降解能力，用其处理细胞 12 小时后，导致 50 ％蛋白质降解， DC50=0.3 nM 。 为了确定 RC32 诱导的泛素化降解是否是通过泛素 - 蛋白酶体途径导致 FKBP12 降解（图 1e ）。我们在添加 RC32 之前，用蛋白酶体抑制剂硼替佐米或卡非佐米处理细胞。实际上，蛋白酶体的抑制完全阻断了 RC32 诱导的 FKBP12 降解，表明这种降解是通过泛素 - 蛋白酶体途径。加入 FKBP12 抑制剂雷帕霉素或 CRBN 抑制剂泊马度胺，均有效地阻断了 RC32 对 FKBP12 的降解，进一步证实了这种降解需要 RC32 与 FKBP12 和 CRBN 的结合。值得注意的是，在降解 FKBP12.6 时， RC32 在 Jurkat 细胞中没有诱导 FKBP51 和 FKBP11 的明显降解（图 1h ）。使用一定剂量的 RC32 可以控制 FKBP25 的降解。但 RC32 对 S6K 和 S6 的磷酸化没有影响，这可能对划分 FKBP12 的 mTOR 独立功能有益处。当 RC32 被洗掉后， FKBP12 蛋白水平在 96 小时内完全恢复（图 1g ）。为了进一步评估 RC32 的效率，使用来自不同物种和原代细胞的不同细胞系进行检测（图 1i ）。 FKBP12 在来自人，大鼠，小鼠和鸡的细胞中以高度一致的模式被 RC32 有效降解。重要的是， RC32 在原代心肌细胞中表现出高降解效率，这表明其在体内降解 FKBP12 的潜力。 3.2 通过 RC32 快速有效降解小鼠和大鼠中的 FKBP12 在确认细胞系和原代细胞中的高降解效力后，我们又在小鼠、大鼠、猪和非人灵长类动物模型中利用 RC32 诱导蛋白质敲低。这些模型是研究人类疾病的宝贵工具。虽然小鼠和大鼠已广泛用于科学研究，但在猪和非人灵长类动物中构建蛋白质敲低模型要困难得多。猪的异种移植在生物医学研究中特别有吸引力。虽然非人灵长类动物与研究人类疾病和制定治疗策略更相关，但猴子的遗传修饰非常昂贵，且耗时，同时技术上具有挑战性。些在大型动物模型中的限制严重阻碍了它们在生物医学研究中的应用。因此，我们尝试应用 PROTAC 这种化学方法构建代表性的蛋白质敲低动物模型并研究靶蛋白的功能。 图 2 腹腔注射 RC32 在小鼠体内全面敲低 FKBP12 我们首先研究了 RC32 对小鼠的影响。令人惊讶的是，用 RC32 治疗仅 1 天（腹腔注射， 30mg/kg ，每天两次）后，在治疗小鼠大部分器官中检测不到 FKBP12 蛋白，大脑除（图 2a ， b ）。有趣的是， FKBP12 的显著降解也发生在眼睛中。相反， RC32 对脑组织中 FKBP12 的降解没有影响，这可能是由于 RC32 无法通过血脑屏障。很有意思的是，在治疗 1 天后（ 30mg/kg ，每天两次）， RC32 能够降解 FKBP12 约 1 周。此外，在停用 RC32 后，不同器官 / 组织中的 FKBP12 得到恢复（图 2c ， d ）。有趣的是， FKBP12 在心脏中的恢复率是 RC32 停用后 13 天内最慢的。停用 PROTAC 后， FKBP12 的 mRNA 水平表现出急性和代偿性增加，然后迅速恢复并保持在接近正常的水平。为了降解脑中的 FKBP12 蛋白，我们使用脑室内（ i.c.v. ）给药。正如所料，来自 i.c.v. 处理脑的组织中的 FKBP12 被降解（图 3a ， b ），而其它器官 / 组织中的水平没有受到影响。 FKBP12 在神经系统中普遍表达，并且已知调节淀粉样蛋白前体蛋白的定位和加工。我们的研究结果表明，脑内局部蛋白质敲低可能为治疗阿尔茨海默病开辟了一条新途径。当口服递送 RC32 时， FKBP12 在小鼠体中显着降解（图 3c ， d ），这突出了口服 PROTAC 的临床潜力，这比先前报道的依赖性注射更方便。此外，每 12 小时仅两次腹腔注射（ 20mg/kg； 图 3e ， f ），在 Sprague-Dawley 大鼠中发现高降解效率。 图 3 口服给药后 RC32 对 FKBP12 的敲低和小鼠 i.c.v. 和大鼠腹腔注射结果 3.3 用 PROTAC 生成的 FKBP12 敲低小鼠的应用 FKBP12 是心脏发育所必需的，但其在心脏稳态中的生理重要性仍不清楚。因此，我们在小鼠中使用这种新方法进一步探索了它在成人心脏中的功能。当 FKBP12 耗尽时，兰尼碱受体保持在开放状态，导致 Ca 2+ 流失。我们检查了响应 RC32 给药的 Ca 2+ 火花的特性，发现它们的持续时间在 RC32 处理组中大大延长，如用载体或 RC32 处理的小鼠心肌细胞的共聚焦显微镜线扫描图像所示（图 4a ， b ）。与对照相比， Ca 2+ 的性质在 RC32 处理的小鼠心肌细胞中火花显著改变。火花的半峰全宽从 1.80±0.22 增加到 1.97±0.26μm （图 4c ）。在 PROTAC 治疗组中发现较长的半衰期持续时间（图 4d ）。上升时间从 14.3±4.67 延长到 17.2±5.85ms ，半衰期从 34.5±12.7 衰减到 44.5±13.5ms （图 4d ）。这些结果表明 RC32 诱导小鼠细胞 Ca 2+ 流失。持续的 Ca2+ 流失是导致心脏功能障碍，并且是心脏肥大的主要原因。接下来，我们使用超声心动图检查对照组和 RC32 治疗小鼠的心脏形态和功能。如图 4e ， f 所示， RC32 治疗组与对照心脏相比，射血分数减少（ EF;14.1 ％），缩短分数缩短（ FS;18.0 ％），表明心室收缩活动减弱。第 11 天，用 RC32 处理的心脏壁试验显示，小鼠的 EF 减少 14.9 ％， FS 减少 18.0 ％。此外，左心室（ LV ）质量（图 4g ， 19.9 ％）， LV 后壁厚度，舒张压（ LVPW;d ）（图 4h ， 12.5 ％）和心室舒张期间室间隔宽度（ IVS;d ）随着 RC32 处理显着增加。 RC32 处理的小鼠在第 30 天出现心肌肥大。然而， LV 质量， LVPW;d 和 IVS;d 在载体组中没有变化。由于心肌肥大的发展， RC32 治疗组在第 30 天的 EF 和 FS 高于第 11 天。超声心动图表征的数据表明 FKBP12 在成人心脏中起关键作用，其降解导致心脏病。总之，这些结果表明使用 PROTAC 敲除 FKBP12 的小鼠是研究 FKBP12 功能有价值的模型，特别是在心脏中。 图 4 RC32 给药对小鼠心肌细胞和心脏功能的影响 3.4 巴马猪 FKBP12 的有效降解 鉴于上述小鼠和大鼠的成功，我们在随后的实验中建立了蛋白质敲低猪模型。当巴马猪（ 20 千克）给予 RC32 （ 8 毫克 / 千克，每天两次） 2 天时， FKBP12 蛋白在大多数检查的器官中被有效降解（图 5a ， b ）。 RC32 给药后，在心脏、肝脏和肾脏中仅检测到残留水平。与我们在小鼠中的发现一致，腹膜注射 RC32 对猪脑中的 FKBP12 降解没有影响。尽管如此，我们在大型动物中使用 PROTAC 化学策略，并在如此短的时间内建立蛋白质敲低模型方面取得了显著进步。因此，我们认为受 RC32 成功启发的化学方法可能会产生有价值的特定蛋白质敲低猪用于人类疾病和异种移植的研究。 图 5 RC32 对巴马猪 FKBP12 的敲低 3.5 验证 FKBP12 在恒河猴中的降解和功能 受猪模型结果的鼓舞，我们将研究扩展到恒河猴（图 6 ）。给药 3 天后（ 8mg/kg ，腹腔注射，每天两次），通过 RC32 有效降解猴子的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺和胃中的 FKBP12 。在脂肪组织、膀胱和肠中可检测到很少或没有 FKBP12 （图 6a ）。 RC32 未能降解大脑中的 FKBP12 ，与小鼠和猪的结果一致。此外，我们在 RC32 给药后 3 天和 15 天，以及在停用 RC32 后 7 和 21 天进行功能性心脏研究。类似于 FKBP12 敲低对小鼠的作用， RC32 处理降低 EF （第 15 天为 6.7 ％，图 6b ）和 FS （在第 15 天 13.4 ％，图 6C ）以及收缩压线（图 6D ）。另外，心率随着治疗而降低。停用 RC32 后，心脏功能逐渐恢复， 22 天后恢复到接近正常状态，伴随着 FKBP12 蛋白水平的恢复（图 6e ）。这些结果表明化学蛋白质敲低方法可用于进行自我对照研究。由于心血管疾病（ CVD ）是全世界死亡的主要原因，使用这种化学方法来敲除 CVD 相关蛋白为研究 CVD 的致病因素和潜在疗法提供了一种新策略。更重要的是，我们降解 FKBP12 的 PROTAC 研究为该策略提供了原理验证，用于在猴子模型中创建高效和可逆的蛋白质敲低。 图 6 RC32 对恒河猴 FKBP12 的敲低及其功能效应 3.6 扩大化学敲低策略在 BTK 中的适用性 最后，为了拓宽这种化学敲低方法的适用性，基于我们先前的研究（图 7a ），使用进一步优化的 BTK 降解剂产生 Bruton 酪氨酸激酶（ BTK ） - 敲除小鼠。用 P13IS （腹腔注射， 33mg/kg ，每天三次）处理 11 天后，脂肪、胸腺、腹部淋巴结和腋窝淋巴结中的 BTK 有效降解（图 7b ， c ）。此外，在骨髓、肺和肠淋巴结中观察到 BTK 的显着降解（图 7b ， c ）。与降解 FKBP12 的 PROTAC 类似，在停用 P13IS 后 7 天恢复 BTK 水平（图 7d ）。 图 7 P13IS 对小鼠 BTK 的敲低 4 讨论 总之，这些体内蛋白质降解结果表明 PROTAC 方法可用于在蛋白质水平上建立动物敲低模型。这种方法只需几天的给药即可实现蛋白质敲低。该技术大大减少了建立临床前研究动物模型的时间和成本，特别是对于较大的非人类哺乳动物模型。 我们已经开发出一种用 PROTAC 全局敲低目标蛋白的化学方法。它是一种新颖、快速和有效的方法，用于产生蛋白质耗竭的动物模型，如小鼠、大鼠、猪和恒河猴。此外，该策略还可以通过 i.c.v. 给药实现大脑中的目标蛋白质敲低。当口服给予 PROTAC 时，这种方法也非常有效。停用 PROTAC 后， FKBP12 蛋白水平在一定时间内恢复。该模型适用于自我控制的生物医学研究，通过化学策略将 FKBP12 敲低的小鼠和恒河猴表现出 Ca 2+ 流失和 Ca 2+ 增加心肌细胞产生火花，从而导致心脏功能障碍。因此，可以开发这些模型用于心脏药物筛选。另外，该方法也可以应用于其它目标，例如 BTK 。对于那些没有充分记录的特异性结合物的靶蛋白，开发 PROTAC 可能是一个挑战。然而，由于配体只需与靶蛋白具有较低亲和力就足以应用 PROTAC 进行蛋白降解， PROTACs 策略将提供更多实现有效蛋白质敲低的方法。总而言之， PROTAC 有望作为现有工具的补充方法，以快速、可控和可逆的方式用于体外和体内研究。 参考文献 doi: 10.1038 / s41421-018-0079-1 【分迪科技 PRODED践行者】 基于前期的成功实践， 分迪科技 构建了从药物分子设计、合成到生物测活的小分子降解蛋白先导化合物开发整体体系。 期待与您合作！ 028-85160035 sales@moldesinger.com www.moldesigner.com PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列 1、 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 2、 【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2 3、 【PROTAC】新药开发系列（三）降解雌、雄激素受体 4、 【PROTAC】新药开发系列（四）透膜降解AR和FKBP12 5、 【PROTAC】新药开发系列（五）降解AR的“整体小分子”设计 6、 【PROTAC】新药开发系列（六）双功能分子的优势 7、 【PROTAC】新药开发系列（七） 磷酸化多肽PROTACs设计 8、 【PROTAC】新药开发系 列（八） 利用Cereblon降解BRD4 欢迎阅读成功案例 1、 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 2、 “解密”纳米材料包载药物的机制：分子模拟研究嵌段共聚物包载多西他赛 3、 食品加工工艺机制研究: 高密度CO2诱导肌球蛋白自组装（上） 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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【PROTAC】新药开发系列（八）利用Cereblon降解BRD4
caixin5120 2019-3-2 12:28
继前面的研究，Craig crews课题组又提供了一种新策略，通过利用E3连接酶Cereblon的PROTAC技术设计了有效的BRD 4 降解剂。这为一类新的药物分子奠定了基础，这些药物分子主动募集E3连接酶以靶向特定的病理蛋白质进行降解，从而更广泛的利用许多“未成药”蛋白开发药物。 BRD 4 及其抑制剂 BRD 4 因其作为多种疾病环境中新靶点的巨大潜力而受到学术界和制药业的极大关注，特别是在癌症方面。BRD 4 作为肿瘤学靶标的一个关键优势是它被鉴定为优先聚集在超增强子区域以控制关键癌基因如c-myc，bcl-xl和pax5，提供了一种替代策略，用于靶向那些难以通过传统策略抑制的癌蛋白。此外，BRD 4 在特定致癌基因附近的基因组位点的独特高占据率提供了治疗窗口的潜力，其可以允许特异性靶向肿瘤细胞，同时保留正常组织。实际上，BRD 4 抑制剂在不同的小鼠肿瘤模型中显示出具有良好耐受性的抗肿瘤活性。并且，对BRD 4 抑制剂（如JQ1）的高度敏感性与不同肿瘤类型中c-MYC或n-MYC的高水平相关，包括c-MYC驱动的BL。目前， 四种BETBromodomain抑制剂正处于I期临床试验中，主要集中在中线癌和血液系统恶性肿瘤 （CPI-0610，NCT01949883；GSK525762，NCT01587703；OTX015，NCT01713582；TEN-010，NCT01987362）。 但，研究者发现BRD 4 抑制剂JQ1和OTX015可在所有测试的BL细胞系中快速而稳健地累积BRD 4 蛋白。 Shimamura等人在一组肺癌和前列腺癌细胞系中发现了类似的观察结果。 一种可能的解释是抑制剂与BRD 4 的结合导致构象变化，这导致蛋白质的热力学稳定性增加。类似地，抑制剂结合可能阻碍BRD 4 对内源性细胞降解机制的可及性，从而使其在动力学上稳定。或者，BRD 4 抑制剂可能会中断调节BRD 4 蛋白水平的BRD 4 介导的负反馈环。BRD 4 水平的这种显着增加以及抑制剂结合的可逆性质可以阻止有效的BRD 4 抑制 。事实上，临床前和临床研究都表明， BRD 4 抑制剂的作用主要是细胞抑制作用，细胞凋亡仅限于少数细胞系和I期患者的肿瘤。 这可能会显着限制患者在临床可达到的BRD 4 抑制剂浓度下的潜在受益。实现更有效的BRD 4 抑制的一种策略是设计不可逆/共价抑制剂，它们可以在较低的药物浓度下实现期望的药理学效果。然而，共价抑制剂具有其自身的局限性，最显着的是蛋白质结合物的潜在免疫原性和高选择性障碍。 小分子抑制剂，通过抑制酶活性（如激酶抑制剂）或干扰蛋白-蛋白相互作用（如BRD 4 抑制剂），已成为肿瘤学药物开发的大方向。 然而，鉴于大多数小分子抑制剂的可逆结合，通常需要较大的全身药物浓度和持续暴露以确保足够的功能抑制。 在许多情况下，维持体内足够高的药物浓度具有挑战性的。作为替代方案，通过RNAi或小分子诱导的蛋白质降解来消除引起疾病的异常蛋白质的方法正在发展为针对“未成药”靶点的新策略。于是，研究者开发了一种诱导蛋白质降解策略，利用蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），将靶向蛋白质募集到E3泛素连接酶VHL（VonHippel-Lindau）进行泛素化标记和随后的蛋白酶体介导的降解。 降解BRD 4 的PROTAC分子优势 图一 小分子BRD 4 抑制剂导致显着的BRD 4 积累和低效的c-MYC抑制 研究者设计了一种新型PROTAC分子（ARV-825），它一段连接临床批准的IMiD治疗药物pomalidomide利用E3连接酶Cereblon起作用，另一端使用BRD 4 的蛋白抑制剂，使其快速降解BRD 4 。该方法可做为靶向BRD 4 药物开发的另一种新策略。 他们首次证明了E3连接酶Cereblon在PROTAC技术范例中的应用，成功地通过ARV-825实现了BRD 4 快速和显着的降解，从而导致强大且持久的下游c-MYC抑制。 最重要的是，与高浓度的JQ1和OTX015相比，ARV-825导致更显着的增殖抑制和强烈的细胞凋亡诱导。BRD 4 降解剂相对于抑制剂改善的功能效应可部分归因于对BL中驱动蛋白c-MYC的更完全和持续的抑制。 BRD 4 也可能具有支架功能，因为它是具有许多结合配偶的大蛋白质，其中许多仍有待鉴定和阐明。可以理解的是，消除BRD 4 会产生比仅仅抑制其与含乙酰赖氨酸的伴侣结合的更深远的影响。BRD 4 敲除（例如通过CRISPR或shRNA）的表型与抑制剂对BRD 4 抑制的表型的比较将有助于提供这种可能性。 图 2 利用 E3 泛素连接酶 Cereblon 以设计 PROTAC 以有效降解 BRD 4 此外，为了进一步证实ARV-825的降解机制是通过Cereblon，研究者通过甲基化哌啶二酮片段中的NH基团制备了ARV-825的类似物。由于该NH基团在与Cereblon的His380的结合中是至关重要的，因此推测N-甲基化后会导致Cereblon结合亲和力的显着丧失。后续试验证明，正如预期的那样，N-甲基化的ARV-825不会降解BRD 4 。Cereblon是普遍表达的蛋白质，因此当附着不同的靶蛋白质募集配体时，该方法可潜在地应用于各种器官/组织中的多种疾病治疗。有人已经提出将Cereblon下调作为多发性骨髓瘤中IMiD抗性的机制。在这种情况下，具有已知结合分子的备选E3连接酶可用于设计PROTAC疗法。 图 3 ARV-825比 小分子抑制剂具有 更显着和更持久的 c-MYC 抑制 OTX015和泊马度胺与它们各自的靶标BRD 4 和Cereblon的结合亲和力分别为10nM和3μM。令人兴奋的是，基于这两种配体的ARV-825在低于1nM时达到BRD 4 的DC 50 ，这有力地表明作用于BRD 4 的PROTAC能够参与蛋白质降解的多个循环，并且开发了由靶配体组成的功能性降解物的方法。 所述靶配体虽具有较低的亲和力，但可提供功能效应。 因此，许多缺乏酶活性位点但可被小口袋中的小分子结合的靶标可能变成具有PROTAC介导的降解的“可药物”。 图4 ARV-825比 BRD 4 抑制剂对BL细胞增殖抑制具有更好的效果 PROTAC等蛋白降解或屏蔽方法的 不足 PROTAC或其它方式对BRD 4 功能的更完全和更持久的破坏将有益于患者，因为其更有效的靶向和更少的给药方案。 但它也可能与更严重的副作用相关，因为BRD 4 以细胞背景依赖的方式调节多种生物过程。 使用诱导型和可逆转基因BRD 4 靶向RNAi小鼠模型的最新发现阐明了有效和持续的BRD 4 靶向的潜在局限性， 包括表皮增生，脱发和小肠中的细胞多样性和干细胞减少。 这代表了药物开发中常见的两难问题，即确定是否以及如何在临床中实现最佳治疗指数。 可喜的是，这些Brd 4 抑制的靶向副作用似乎是可逆的，可以设置一个治疗窗口来更好地管理BRD 4 靶向治疗。 图5 ARV-825比 小分子抑制剂对BL细胞凋亡诱导具有更好的效果 由于BET家族BD1和BD2结构域的高度同源性，目前临床开发中的BET抑制剂（包括OTX015）在结合和抑制BRD2/3/4/T（BRDT仅在睾丸中表达）方面没有选择性。 我们还检查了ARV-825对BRD2和BRD3的作用。由于OTX015对所有BET家族成员的相似亲和力，以及所有BET成员上的大量重叠表面赖氨酸，BRD2/3/4都可被ARV-825降解。 然而，通过仔细设计可以增加/降低对各种结合靶标的亲和力的“接头”区域，PROTAC可以提供更多的机会来实现更好的选择性，或者可以定位其E3连接酶部分以获得特定靶标的最佳表面赖氨酸泛素化。 这些假设需要通过建模和实验测试进行广泛的调查。如果属实，PROTACs作为一类新的药物分子，可以使未来多个疾病领域的患者受益匪浅。 参考文献 Doi: 10.1016 / j.chembiol.2015.05.009 【分迪科技 PROTAC践行者】 期待与您合作！ 028-85160035 sales@moldesinger.com www.moldesigner.com PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列 1、 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 2、 【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2 3、 【PROTAC】新药开发系列（三）降解雌、雄激素受体 4、 【PROTAC】新药开发系列（四）透膜降解AR和FKBP12 5、 【PROTAC】新药开发系列（五）降解AR的“整体小分子”设计 6、 【PROTAC】新药开发系列（六）双功能分子的优势 7、 【PROTAC】新药开发系列（七） 磷酸化多肽PROTACs设计 欢迎阅读成功案例 1、 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 2、 “解密”纳米材料包载药物的机制：分子模拟研究嵌段共聚物包载多西他赛 3、 食品加工工艺机制研究: 高密度CO2诱导肌球蛋白自组装（上） 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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【PROTAC】新药开发系列（七） 磷酸化多肽PROTACs设计
caixin5120 2019-3-2 12:27
1 导读 前面五篇文章介绍了 Craig M. Crews 等人在 2001-2008 年的开创性工作。他们合理地利用与泛素连接酶 E3 体系相互作用的分子与蛋白受体的激动和抑制剂结合，设计合成了用于降解 MetAP2 、 ER 、 AR 和 FKBP12 等的 PROTACs 分子。蛋白和细胞试验证明了 PROTACs 可快速降解目标蛋白并抑制细胞增殖。 图 1 磷酸化多肽 PROTACs 作用机制 本期，我们介绍该研究组针对磷酸依赖性蛋白的 磷酸化多肽 PROTACs 设计。研究者设计了两种 磷酸化多肽 PROTACs ，是将神经生长因子受体 TrkA （原肌球蛋白受体激酶 A ）或神经调节蛋白受体 ErbB3 （成红细胞增多症癌基因 B3 ）的酪氨酸磷酸化序列与 E3 泛素连接酶 Von Hippel Lindau 的肽配体偶联。这两种 磷酸化多肽 PROTACs 多肽分别募集神经营养信号效应子 成纤维细胞生长因子受体底物 2α 或促生存 磷脂酰肌醇 -3 激酶 ，在E3泛素连接酶 VHL 的作用下被泛素化和降解，如图1。研究人员证明了这两种 磷酸化多肽 PROTACs 在体外和体内抑制各自的活化受体酪氨酸激酶途径的短期和长期作用的能力，如图2。此外，研究显示 磷酸化 多肽PROTACs 的活化完全依赖于它们的激酶介导的磷酸化，含有苯丙氨酸的无效变体是无活性的。且刺激不相关的生长因子受体不会诱导靶蛋白敲低，说明了 磷酸化多肽 PROTACs 的选择性。 图 2 磷酸化多肽 PROTACs 降解蛋白效果 2 本文亮点 1 、两个水平的选择性。 磷酸化多肽 PROTACs 可抑制酪氨酸激酶途径，该途径可利用每种信号传导途径固有的内在选择性。这种 PROTACs 所利用的第一个特异性来自个体酪氨酸激酶对其各自底物的特异性，已知被特定激酶磷酸化的肽序列。该方法还抑制特定的信号传导级联，不是通过靶向激酶本身，而是通过诱导特定下游信号传导组分如 FRS2α 和 PI3K 的降解。同样，通过使用含有磷酸酪氨酸的肽中固有的天然亲和力作为这些含 SH2/PTB 结构域的蛋白质的配体，可以有效地将它们的降解与细胞内同源信号级联的活化状态相结合。因此，这两个水平的选择性，即在激酶 / 底物水平和效应蛋白 / 磷酸化多肽 PROTACs 结合水平，共同选择特定信号通路。 2 、该 磷酸化多肽 PROTACs 可区分正常和患病组织。 由于各种酪氨酸激酶途径的失调导致不受控制的细胞增殖， 磷酸化多肽 PROTACs 将蛋白质降解偶联至特定生长因子 - 信号传导途径的使得其具有细胞类型选择性。活化的条件性质使得 磷酸化多肽 PROTACs 适合于恶性细胞的选择性治疗。例如，人们可以设想普遍存在的 PROTACs 介导的参与细胞生长或存活的蛋白降解可能具有全身性毒害作用（例如，已经发现小分子抑制剂 LY294002 对 PI3K 的抑制在动物研究中是有毒的）。研究者给小鼠使用 磷酸化多肽 POPTACs ，可抑制肿瘤生长，但对动物生存（体重和毒性症状）没有明显的不良影响。 磷酸化多肽 PROTACs 优先降解在那些具有高水平 ErbB2/ErbB3 信号传导的细胞中的 PI3K ，优先抑制乳腺癌或卵巢癌或胰腺癌细胞增殖。 3 、使用 磷酸化多肽 PROTACs 的另一个优点是它不太可能引发耐药性突变。 目前的抗肿瘤酪氨酸激酶抑制剂如 Tarceva 和 Iressa 通过抑制受体酪氨酸激酶活性来阻止细胞增殖。但这种生存斗争为靶突变提供强大的选择压力，为保持激酶活性，细胞表达突变蛋白用以抵抗药物结合。相反， 磷酸化多肽 PROTACs 依赖于在许多肿瘤类型中发现的错误调节的激酶活性以阻止细胞信号传导和生长。如果，激酶结构突变以阻止 磷酸化多肽 PROTACs 结合可能会导致激酶信号传导的丧失。既然都会导致死亡，故细胞对 磷酸化多肽 PROTACs 不太会产生突变引发耐药。 4 、最后，这种方法的一个关键优势是可针对“未成药”靶蛋白。 磷酸化多肽 PROTACs 可降解不同信号传导途径的靶蛋白，因为许多重要的酪氨酸激酶，如含有 SH2 或 PTB 结构域的蛋白质相互结合是已知的，它将在“未成药”靶蛋白的药物设计领域独领风骚。 下一周，将和大家分享 Crag Crews 研究组利用 E3 泛素连接酶 Cereblon 降解 Brd4 的小分子 PROTACs 设计的故事，敬请关注分迪科技微信公众号。 参考文献 1. Hines, J.; Gough, J. D.; Corson, T. W.; Crews, C. M.,Posttranslationalprotein knockdown coupled to receptortyrosinekinaseactivation withphosphoPROTACs. Proc Natl Acad Sci, 2013,110(22), 8942-7. DOI ： 10.1073/pnas.1217206110 【分迪科技 PROTAC践行者】 期待与您合作！ 028-85160035 sales@moldesinger.com www.moldesigner.com PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列 1、 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 2、 【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2 3、 【PROTAC】新药开发系列（三）降解雌、雄激素受体 4、 【PROTAC】新药开发系列（四）透膜降解AR和FKBP12 5、 【PROTAC】新药开发系列（五）降解AR的“整体小分子”设计 6、 【PROTAC】新药开发系列（六）双功能分子的优势 欢迎阅读成功案例 1、 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 2、 “解密”纳米材料包载药物的机制：分子模拟研究嵌段共聚物包载多西他赛 3、 食品加工工艺机制研究: 高密度CO2诱导肌球蛋白自组装（上） 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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【PROTACs】新药开发系列（六）双功能分子的优势
caixin5120 2019-3-2 12:25
1 概述 前面四篇文章介绍了 Craig M. Crews 等人在 2001 、 2003 、 2004 和 2008 年的开创性工作。接下来， 研究者 总结了现有 双功能分子 的故事。 双功能分子 可以特异性地将两种或多种蛋白质分子结合在一起，从而获得增强的或新的生物效应。第一类双功能分子是 雷帕霉素 和 FK506 ，其可以诱导 FKBP12 与 雷帕霉素蛋白 （ mTOR ）或者 FK1012 “二聚化”。随着化学遗传学和细胞生物学的新应用， 双功能分子 的应用扩展到介导 促 旋酶 B 二聚化的 香豆素 （ Coumermycin ），诱导蛋白水解的 靶向嵌合分子 （ PROTACs ）， 药物杂合体 （ Drug Hybrids ），以及 抗体偶联分子 （ ADC ）等方向。 图 1 双功能分子的作用机制 双功能分子 可像与两种蛋白相互作用的天然产物一样简单，如 香豆素 （ Coumermycin ）或 真菌毒素 （ Brefeldin A ）。它们通过稳定非激活的 GDP-Arf 和鸟嘌呤核苷酸交换因子的复合物来抑制小 G 蛋白 Arf 。但大多数 双功能分子 是由结合两个蛋白的分子通过中间适当长度的 Linker 组成。如分子与蛋白结合的接头相同，则该分子可使两个相同的蛋白单体二聚化；如接头不同，则可以将两种不同的蛋白结合在一起。这些分子的应用与设计多种多样。两种或更多蛋白的结合可以引起受体或二分转录因子的配体非依赖性激活，而 双功能分子 可隔离蛋白与蛋白的结合，或诱导靶向蛋白的降解，或产生其它蛋白识别的结合表面，使得信号可正负调节。 双功能分子 还可特异性定位毒素，如“ Drug Hybrids ” 可以使两种蛋白不形成二聚体。更重要的是，这些效应可通过改变小分子浓度而调节，也是可逆的。 “ 二聚化学诱导剂 ”（ CID ）的概念是 Schreiber 等人提出的。他们利用天然产物 FK506 与 FKBP12 蛋白 特异性结合，募集蛋白磷酸酶神经钙蛋白形成 FK506-FKBP12 复合物。他们还发现结合 FK1012 的 FK506 二聚体会促使 FKBP12 同源二聚化。类似地，天然产物 雷帕霉素 可促进 FKBP12 与 mTor 的 FKBP- 雷帕 霉素（ FRB ） 结合。故， 雷帕霉素 可用于异源二聚化含有 FKBP 和 FRB 结构域的蛋白质复合物，也可用于诱导 FK506- 环孢菌素复合物 的异二聚化，其将 FKBP12 和 亲环蛋白 结合在一起。 图 2 酵母三杂交系统 接下来，研究者对 FKBP 的 CID 应用多样性进行了全面评估。一个重要的方向是用于鉴定小分子蛋白靶标的“ 酵母三杂交 ”系统。与检测蛋白 - 蛋白相互作用的酵母双杂交方法类似，该方法使 转录激活域 与 DNA 结合域 接触，使得报告基因转录。该方法不依赖于蛋白 - 蛋白相互作用来激活转录，而是使用 CID ，其具有与 DNA 结合域 作用的接头，以及与 激活域 作用的接头。如果后者的接头是匹配未知目标蛋白的小分子， 激活域 -cDNA 结合 文库可用于鉴定可能作用的蛋白靶标。该系统的第一个实例是将 FK506 与 地塞米松 连接 ，其可将 FKBP12 和 糖皮质激素受体 结合在一起。 2 实例 接下来详细地讨论三类双功能分子： 1 、仅用于细胞外研究的； 2 、细胞中使用，但需要对蛋白进行基因操作的（本文简略）； 3 、靶向内源蛋白，不需要遗传操作的。 1 、仅用于细胞外研究的双功能分子 图3 DHFR双功能分子 Kopytek 等人在体外研究的 甲氨蝶呤 （ MTX ）的二聚化系统是最早被淘汰的 FK506/ 雷帕霉素 的 CID 之一。 叶酸类似物 与 二氢叶酸还原酶 （ DHFR ）结合异常紧密，可抑制关键酶在核苷酸生物合成中的功能。研究者基于 MTX-DHFR 相互作用的结构信息，选择对结合不重要的 MTX 区域，并设计适当长度的 Linker ，将第一个接头与第二个 MTX 上相同位点的分子接头连接起来。遗憾的是，这几种有趣的小分子仅在体外实验有效。 图4 PLA2双功能分子 接下来，又有人提出了类似的同源二聚体系统。 人非胰腺磷脂酶 A2 （ PLA2 ）是参与 花生四烯酸 和 溶血磷脂 代谢的酶，涉及炎症过程。酶的扁平面与磷脂双层紧密相互作用。使用已知的 i-face 结合吲哚抑制剂， 研究者 构建了具有各种接头的 双吲哚配体 ，此 双功能分子 能二聚化该酶，且对 PLA2 活性的抑制比 单体吲哚 高 5 倍，不仅可作为 PLA2 过表达 类风湿性关节炎 的治疗剂，也是新型的 CID 系统。 图5 SAP双功能分子1 另外两个例子也是建立在 CID 范例之上，但它是从一个小分子 / 两个蛋白质（三元）系统扩展到多元系统，导致更紧密的蛋白 - 蛋白相互作用。 霍乱毒素 B 和人类先天免疫系统 蛋白血清淀粉样蛋白 P （ SAP ）以五聚体形式存在； 霍乱毒素 可能通过与 SAP 聚集而被解毒。研究者推断每个霍乱毒素五聚体可以结合五个 双功能分子 ，每个分子都会与 SAP 结合，从而产生高亲和力相互作用。故使用基于结构的设计，利用已知的 SAP 配体 （ D- 脯氨酸）和 霍乱毒素配体 （ m- 硝基苯 -α-D- 吡喃半乳糖苷 ， MNPG ），合成了一种同时结合 SAP 和 霍乱毒素 的化合物。它比单用 MNPG 更能有效地抑制 霍乱毒素 与 其它 受体的结合。 图6 SAP双功能分子2 同样， Solomon 等人将 志贺毒素 靶向 SAP 。然而，他们不是依赖于五个二聚体分子的结合，而是构建了一个五臂树枝状大分子，每个连接臂以 异双功能 “糖簇”结束。每个糖簇由 志贺毒素 结合三糖和 SAP 结合组成甘油的环状丙酮酸。在 志贺毒素 竞争性结合试验中，树枝状大分子比单体糖簇能更好地破坏 志贺毒素 - 靶标 结合。 2 、需要遗传操作的技术 在活细胞中起作用的二聚化技术与仅在体外测试的相比更接近于生物体测试或临床应用。然而，许多方法（包括原始 CID ）需要遗传操作来掺入二聚化物靶标和目标蛋白质的嵌合蛋白质。因此，其在临床的应用是有限的，尽管它们肯定是强大的研究工具。这里我们就简略了！ 图7 需要遗传操作的双功能分子 3 、不需要遗传操作的技术 临床上我们不能轻易地对患者的细胞进行遗传操作，开发双功能小分子的吸引力在于不需要对处理过的细胞进行遗传操作就能发挥作用。 图8 DNA烷化剂类靶向乳腺癌的双功能分子 最早的两个例子主要是为非选择性的化合物提供选择性，它们靶向细胞内 雌激素受体 （ ER ）。其一， Rink 等人发现的一种系统，是将 DNA 烷化剂 与识别 ER 的部分连接上，从而赋予其选择性。 氮芥 以非特异性方式烷基化 DNA ，对细胞具有普遍的毒性。 2- 苯基吲哚 与其靶标 ER 特异性结合可让氮芥靶向肿瘤细胞。发现对 ER 没有亲和力的化合物对两种细胞（来自 乳腺肿瘤 的 ER 阳性 MCF7 细胞和 ER 阴性 MDA-MB-231 细胞）都显示出毒性，而对 ER 具有亲和力的双功能分子对 MCF7 细胞的毒性高于 MDA-MB-231 细胞。用药后，再使用雌二醇处理，发现其对 MCF7 细胞的毒性降低，这表明 雌二醇 与双功能分子对 ER 有竞争性结合。研究者提出了对选择性的各种解释，并随后优化了它们的结构，改变了接头长度并使用 雌二醇 作为 ER 配体。其中最合理的解释是结合 2- 苯基吲哚 的 ER 屏蔽了 受损 DNA 与 修复酶 的结合。 图9 降解ER的双功能分子 第二个双功能分子则是改变了 格尔德霉素 的毒性。 格尔德霉素 是与分子伴侣 Hsp90 结合并诱导蛋白酶体依赖性降解一系列蛋白的天然产物。但这非选择性降解导致了严重的毒副作用。研究者利用这种 毒性策略 ，将与 ER 结合的 雌二醇 与 格尔德霉 素衍生物 连接起来。在 MCF7 细胞中， 格尔德霉素 诱导 ER ， HER-2 ， Raf-1 和 IGF1R 的快速降解。 化合物 11 仅诱导 ER 的降解，对 Raf-1 或 IGF1R 没有影响，对 HER-2 降解的速率也较 格尔德霉素 低。化合物的活性依赖于蛋白类型和 Linker 长度。还有一种双功能分子，将 雌二醇 与可光活化的 卟啉 连接起来，该分子可杀死暴露于红光中的细胞。这些研究表明，将有毒性化合物与靶向部分连接，可以极大地改善毒性的选择性。 类似的方法用于靶向 雄激素受体 （ AR ）的降解。 雄激素受体 是与 前列腺癌 相关的重要靶点。用 AR 的配体 睾酮 制备 格尔德霉素 双功能分子 ，研究者发现该分子对 LNCaP 前列腺癌细胞具有与 格尔德霉素 相当的细胞毒性。试验显示，在 AR 依赖性细胞中，其具有与 格尔德霉素 相当的 IC 50 。相反，在 AR 非依赖性细胞中，发现双功能分子 比格尔德霉素 弱十倍以上，因此提供了有希望的治疗策略。 图10 PROTAC类的双功能分子作用机制 异双功能分子 在 泛素依赖 的 蛋白降解 领域发挥了重要作用：通过诱导目标蛋白与 泛素连接酶 接近，让目标蛋白被 泛素化标记 ，标记后的蛋白将被蛋白酶体降解。 PROteolysis TArgeting Chimeras （ PROTACs ）利用泛素化蛋白 - 蛋白酶体途径，清除目标蛋白质。 图11 PROTAC类的双功能分子 最初的概念验证是设计了 PROTACs 降解 甲硫氨酸氨肽酶 -2 （ MetAP-2 ）。 这在我们的【 PROTACs 】新药研发系列（二）中详述了。 从这个体外试验开始， PROTAC 概念已朝着作为治疗药物的潜在用途发展。随后的论文分别使用 雌二醇 和 二羟基睾酮 的 PROTACs 来降解 雌激素 和 雄激素受体 。与 VHL 结合的 7 肽 被简化为可透膜的 五肽 。接下来，研究者还设计了一种针对 AR 的小分子（非肽） PROTAC ，使用 MDM2 结合的 nutlin 衍生物作为 E3 连接酶结合部分。 图12 连接细胞表面受体与抗体的双功能分子作用机制 近年来， 异双功能分子 在 免疫系统 领域也充分地展示了巨大的潜力，这是 20 世纪 90 年代早期提出的一种策略。 Kiessling 等人合成了一个小分子，其能够选择性地将常见的人类抗体招募到细胞表面 α v β 3 整合素受体 上，该受体在癌细胞表面过度表达，而在正常组织细胞中大量缺失。这种策略可引导 免疫系统 特异性靶向杀死癌细胞。 图13 连接Anti-Gal与Integrinαvβ3的双功能分子 作为初始步骤，有两个配体分子均表现出潜力（低 nM 浓度）和针对 α v β 3 良好的特异选择性，这两个分子用以构成双功能分子的一端。从 α v β 3 整合素受体 与其中一个配体（环状 RGD 肽）的晶体复合物结构可知，该分子连接一个 Linker 不会阻碍其与受体的结合，分子的另一端则需要去识别抗体表位。碳水化合物的 α-Gal 对抗体表位具有免疫原性。因为于细菌的 α-Gal 暴露于细菌外部，抗 Gal 抗体在人体中高表达。因此，另一端我们可选择适当功能化的三糖部分用于抗体的招募。这两个 双功能分子 阻碍了 α v β 3 整合素受体 与其天然结合底物 纤维蛋白原 的结合， IC 50 达到了纳摩尔。但它们与 α v β 3 整合素受体 结合的 IC 50 值仅在微摩尔，这表明所述双功能分子具有对抗体的特异选择性。化合物 15 还显示出同时结合 α v β 3 整合素受体 和 抗 Gal 的 IgG 特性，这证明了该策略有可能提供特异性靶向肿瘤细胞的新疗法。后续试验证实，化合物仅杀灭高水平表达 α v β 3 整合素受体 的细胞，而低受体表达水平的细胞存活了。 图14 连接CD22与Anti-nitrophenol的双功能分子 在类似的方法中， O'Reilly 等人将抗原 硝基酚 （人体中存在其内源性抗体）与能结合 CD22 的三糖配体连接。 CD22 是在 B 细胞表面表达的蛋白。这样的双功能分子能够诱导十聚体 抗 硝基酚 IgM 与 B 细胞的 CD22 分子簇形成复合物，使得这些原本低亲和力的受体能与抗体相互结合，导致 B 细胞被免疫系统杀死。 图15 连接P-Selectin与Integrinβ1的双功能分子 使用不同的方法， Matsuda 等人对淋巴细胞 - 内皮细胞相互作用进行了研究，这对于抗炎和抗转移治疗干预作用巨大。他们发现一些化合物可结合 选择素 和 整合素蛋白 ，因此他们设计了一种嵌合分子，将与 P- 选择素蛋白 结合的四糖与柔性的的 KG 二肽 Linker 和与 整合素蛋白 结合的四肽 RGDS 融合成一体。该化合物可以形成与 P- 选择素 和 整合素 β1 的三元复合物。在初步测试中，该异双功能分子抑制 T 细胞与胶原涂层板的结合，而单个四肽和四糖则不能。 图16 连接μ与δ阿片受体的双功能分子 Portoghese 实验室（他们长期研究 阿片受体 的作用），报道了一种异双功能分子，在小鼠试验中观察到：它不仅比吗啡作用强 50 倍 ，具有良好的 耐受性 ，且 无依赖性 。所谓的“ MDAN ” 配体（ μ-δ 激动剂 - 拮抗剂 ）包含 μ 阿片受体 （ 羟吗啡酮 ）的激动剂和 δ 受体 （ 纳曲吲哚 ）的拮抗剂。 MDAN-21 ，在两个药效团之间含有 21 个原子的 Linker ，既不产生耐受性也不产生依赖性，但较短的 Liner 则会产生依赖性和耐受性。研究者总结，这种生物学效应可能是因为 μ 和 δ 受体之间形成异二聚体的结果。 帕金森氏症 和 阿尔茨海默氏症 等 神经退行性疾病 通过尚未完全了解的复杂机制起作用，这导致许多人认为药物混合物可能是实现改善治疗效果的必要条件。而双功能分子可以代替多种药物混合使用治疗疾病，因此该领域和其他领域的研究人员正在转向双功能分子的研发。与本综述中讨论的许多其它双功能分子不同，这些“ 药物杂合体 ”倾向于将两种功能元件结合到单一框架中，可得到比通过长接头连接两个不同片段更小的药物分子。 虽然该策略适合于实现两种不同的生物效应，但它不可能成功诱导形成具有两种生物分子的三元复合物。 图17 帕金森氏症和阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病的双功能分子 在 帕金森氏病 患者的脑中， 单胺氧化酶 （ MAO ）活性和铁的水平增加。研究发现神经保护作用可能与 8- 羟基喹啉的铁螯合剂和 MAO 抑制炔丙基胺有关，故 Youdim 等人将这两种成分结合成一系列具有两种功能的分子。获得了化合物 19 的最佳结果，其在体外表现出良好的铁螯合水平，并且在 P19 细胞中提供针对氧化应激的神经保护作用，而抑制 MAO 活性的能力相对较弱。类似地，研究者在 阿尔茨海默病 的试验中，将模拟 NO 作用的硝酸酯与具有简单神经保护性的 γ- 氨基丁酸受体激动剂氯美噻唑中的杂环连接起来，构成一种双功能分子，其中一个分子 GT1061 ，是一种口服有效，且能透过血脑屏障的分子，其已在大鼠中广泛研究，并已被批准用于 阿尔茨海默病 的 I 期 临床试验。 有研究者在 C ＆ ENews 中发表了用于 治疗疟疾 的 Drug Hybrids 的例子。与上面讨论的神经退行性疾病的治疗一样，这些杂合体不与两个单独的生物分子形成三元复合物，而是充当结合两个不同靶标的双功能分子。尽管在给药、递送和定位方面它们可能比药物鸡尾酒更具优势，但是杂合体在体内是否保持完整尚不清楚。目前，已经有几种靶向 疟疾 的双功能分子。比如，利用速效 青蒿素 和缓慢作用奎宁之间的协同作用，设计了一种杂合体，其 IC 50 和单独使用其中一种药物或同时使用两种药物一样。此外， Peyton 实验室已将已知 抗疟氯喹 的 喹啉 部分与已知阻断从其作用位点除去氯喹的转运蛋白作用的三环“逆转剂”连接。这使得杂合体在培养物中表现出对恶性疟原虫的有效生长抑制，并且在小鼠中观察到了有希望的早期结果。 3 总结 在过去的十年中，异双功能小分子的使用取得了重大进展。已经成熟的 FK506/ 雷帕霉素系统得到了最广泛的研究和验证，预示着它们有可能解决生物医学研究中的许多突出问题，并在未来转向治疗应用。 模块化合成的好处不容小觑： 如果采用冗长的线性合成路 线，微调异双功能分子任一端，可能需要重新设计合成路线。 许多报道的双功能分子是利用已知与特定蛋白结合的小分子（抑制剂或激动剂），故很少需要从头开始合成。 实际上，可从大量的药物发现文献中获得与蛋白质结合的小分子，使得这些蛋白可以在异双功能分子的未来研究中容易地被靶向。此外，值得注意的是， 小分子不一定必须与蛋白的活性位点结合才有用：任何高亲和力配体都能够促进所需的相互作用。 Linker 连接的位点是至关重要的： 特别是要避免破坏药效团或诱导损害结合亲和力的构象变化。 尽管 Linker 组成通常受可合成性的限制，但确定最佳 Linker 的长度至关重要（这通常根据经验确定，较小的长度差异能够导致显著的活性变化）。 合适的 Linker 足够长且足够灵活，以使分子的两端能够与其结合的蛋白靶标自由相互作用。合适的 Linker 也足够短，以确保蛋白质足够接近所需的二聚化效应。 Linker 不应过度疏水（这会促进水溶液中的分子内相互作用），或过于活泼（例如，酯类可能在体内裂解）。 作为潜在治疗剂的双功能分子的主要缺点之一是它们的大尺寸。 庞大的分子可能不溶，故不能口服吸收，同时透膜性也差，药代动力学性质也不理想。 将来，在临床应用双功能分子之前，最小化配体和接头大小，以及整体结构的优化将是克服上述问题的关键。 DrugHybrids 的成功表明这是可能的。 参考文献 1.Corson, T. W.; Aberle, N.; Crews, C. M.,DesignandApplications of Bifunctional Small Molecules: Why Two HeadsAreBetterThan One.ACSChem Biol 2008 , 3(11), 677-692. DOI: 10.1021/cb8001792 【分迪科技 PROTAC践行者】 期待与您合作！ 028-85160035 sales@moldesinger.com www.moldesigner.com PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列 1、 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 2、 【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2 3、 【PROTAC】新药开发系列（三）降解雌、雄激素受体 4、 【PROTAC】新药开发系列（四）透膜降解AR和FKBP12 5、 【PROTAC】新药开发系列（五）降解AR的“整体小分子”设计 欢迎阅读成功案例 1、 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 2、 “解密”纳米材料包载药物的机制：分子模拟研究嵌段共聚物包载多西他赛 3、 食品加工工艺机制研究: 高密度CO2诱导肌球蛋白自组装（上） 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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【PROTAC】新药开发系列（五）降解AR的“整体小分子”设计
caixin5120 2019-3-2 12:21
前面三篇文章介绍了 CraigM. Crews 等人在 2001 、 2003 和 2004 年的开创性工作。他们合理地利用与泛素连接酶 E3 体系 SCF （ Skp1-Cullin-Fbox ）、 VonHippel-Lindau tumor suppressorprotein （ VHL ）与甲硫氨酰氨肽酶 2 （ MetAP2 ）、雌雄激素受体（ ER 和 AR ） 和 抗免蛋白 FKBP12 （ FK506bindingprotein ）的激动和抑制剂，设计合成了用于降解 MetAP2 、 ER 、 AR 和 FKBP12 的 PROTAC 分子。蛋白试验验证了 PROTACs 可快速降解目标蛋白。 图 1PROTAC 泛素化降解机制 但以前的 PROTAC 均使用了多肽，虽然已经可以透过细胞膜，但多肽 PROTAC 本身分子量高、且肽键不稳定，导致合成、纯化和稳定性方面的诸多问题。为了克服这一系列问题，研究者采用了“整体小分子”的 PROTAC 设计。 “整体小分子” PROTAC 设计是一端采用了选择性雄激素受体调节剂（ SARM ）如图 2 中的分子， Ki=4nM ，一种非甾体 AR 配体；另一端利用了另一个 E3 体系 MurineDouble Minute 2 （ MDM2 ）抑制剂 Nutlin ，如图 3 中的分子， IC50=90nM 。 图 2 AR 与 SARM 的结合模式 图 2 中的红色圈，显示了 SARM 与 PEGLinker 连接的位置。图 3 中的红色圈，则显示了 Nutlin 与 PEGLinker 连接的位置，环酰胺的 N 处。 图 3 MDM2 与 Nutlin 的结合模式 MDM2 是一个已知的抗癌靶蛋白，其抑制剂作用机制是是竞争性结合在其与 p53 结合的位置（如图 4 ， Nutlin 和 p53 与 MDM2 结合在同一位点），从而阻止 p53 被泛素化标记，使得 p53 不被蛋白酶体降解。 图 4 MDM2 （绿色）与 Nutlin （白色）和 p53 （紫色）的结合模式 到目前为止， MDM2 的抑制剂还未有获批上市的。推进最快的两个化合物是 RG7112 和 RO5045337 也只是完成了一期临床，如图 5 。国内江苏亚盛医药的 MDM2 抑制剂在 2017 年 7 月获 CFDA 一期临床批件。 图 5 MDM2 抑制剂研究进展 研究者采用图 6 的路线合成了“整体小分子” PROTAC 。接下来使用 10μM 的 PROTAC 与 Hela 细胞在 37℃ 下共孵育。 7 小时后制备细胞裂解物，通过 SDS-PAGE 分离，并转移到硝酸纤维素膜上，使用 AR 抗体评估 Western 印迹以确定 AR 蛋白水平。 图 6“ 整体小分子” PROTAC 的合成路线 试验结果显示，与空白试验对比，用 PROTAC 处理的细胞中 AR 明显降低（图 7 ）。为了验证 PROTAC 诱导雄激素受体降解是通过蛋白酶体途径，研究者用 10μM 蛋白酶体抑制剂环氧酶素预处理细胞 1 小时，然后进行空白试验和 PROTAC 降解试验。结果如图 7 所示， PROTAC 介导的降解具有蛋白酶体依赖性，环氧酶素与 PROTAC 竞争性结合 AR ，导致 AR 降解减少。 图 7 “ 整体小分子” Protac 降解 AR 的效果 下一周，将和大家分享一篇 PROTAC 设计的综述： Designand Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two HeadsAreBetterThan One ，敬请关注分迪科技微信公众号。 参考文献 1. Schneekloth,A. R.; Pucheault, M.;Tae, H. S.; Crews, C. M., Targetedintracellularproteindegradation induced by a small molecule: En route tochemicalproteomics. Bioorg Med Chem Lett 2008 , 18(22), 5904-8. 【分迪科技 PROTAC践行者】 期待与您合作！ 028-85160035 sales@moldesinger.com www.moldesigner.com PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列 1、 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 2、 【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2 3、 【PROTAC】新药开发系列（三） 降解雌、雄激素受体 4、 【PROTAC】新药开发系列（四） 透膜降解AR和FKBP12 欢迎阅读成功案例 1、 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 2、 “解密”纳米材料包载药物的机制：分子模拟研究嵌段共聚物包载多西他赛 3、 食品加工工艺机制研究: 高密度CO2诱导肌球蛋白自组装（上） 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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【PROTAC】新药开发系列（四） 透膜降解AR和FKBP12
caixin5120 2019-3-2 12:12
上两篇文章介绍了RaymondJ. Deshaies和CraigM. Crews等人在2001和2003年的开创性工作。他们合理地利用与泛素连接酶E3体系SCF（Skp1-Cullin-Fbox）结合的10肽，加上甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）共价抑制剂Ovalicin、雌雄激素受体（ER和AR）底物雌二醇（Estradiol,E2）和二氢睾脂酮（Dihydroxytestosterone, DHT），设计合成了用于降解MetAP2、ER和AR的PROTAC分子。蛋白试验验证了PROTACs可快速降解目标蛋白。 图 1 PROTAC 泛素化降解机制 但遗憾的是， 由于使用的10肽上有磷酸化的丝氨酸，导致PROTAC分子都无法透过细胞膜 ，为了验证细胞内的目标蛋白降解活性，研究人员不得不采用显微注射法，把PROTAC分子溶液注射到每个细胞中，然后观察目标蛋白降解效果。 图 2 PROTAC 的合成路线 图 为了解决这个问题，研究者继续探索。 他们发现一个7肽（ALAPYIP）链接上一个D-Arg精氨酸多聚体可以使得PROTAC成功透过细胞膜，且不被非特异性蛋白水解。 研究者利用另外一个E3体系 Von Hippel Lindau tumor suppressorprotein(VHL) 准备降解 AR 和另外一种新的蛋白—— 抗免蛋白FKBP12(FK506 binding protein) 。根据PROTAC的设计方式，他们采用AR的天然底物DHT和FKBP12（F36V突变体）抑制剂 AP21998 ，用Linker将其与多聚精氨连接的7肽组合起来，形成了 PROTAC-4 和 PROTAC-5 。 图 3 FK506 与 FKBP12 的结合 研究发现， FKBP12和各类心血管疾病有关 。抗免蛋白FKBP12与FK506他克莫司（免疫抑制剂）形成的复合物可抑制 钙调神经磷酸酶（Calcineurin） 活性，从而阻断T淋巴细胞转导途径中的信号转导。FKBP12与 雷帕霉素 （免疫抑制剂）形成的复合物可抑制mTOR活性。去年Blood文章报到， 雷帕霉素和他克莫司 可以阻断FKBP12与ALK2的结合，用以增加 铁调素 ，并增强受体对炎性配体激活素A的反应性。 铁调素 是一种小分子多肽，主要由肝细胞合成，作用于肝脏、小肠和网状内皮系统，传递铁代谢调节信号，调控机体铁平衡。 图 4 AP21998 类似物与 FKBP12 的结合 为降解 AR 和 FKBP12 ，研究者分别利用了 AP21998 和 二氢睾脂酮 (Dihydroxytestosterone, DHT)，通过中间的Linker连接 多聚精氨酸的7肽 ，设计了 PROTAC-4 和 PROTAC-5 。 降解AR的PROTAC设计类似上篇文章，只是多肽段换成了7肽。 降解FKBP12的PROTAC则是从抑制剂AP21998含有羧基的一端链接Linker的。从AP21998类似物与FKBP12的晶体复合物，如图4，可以发现Linker应该是从红色圈部分链接出。因为分叉的芳环另外一边是一个大的疏水空腔，用来匹配AP21998的疏水芳环端。 这次，研究者并没有采用显微注射法，而是直接在细胞培养皿中加入药物。 对于PROTAC-4的细胞内降解试验，他们使用了稳定表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）融合的突变体（F36V）FKBP12的HeLa细胞系，通过细胞内荧光的损失来监测FKBP12的蛋白水解。 在细胞试验中，仅加入DMSO的前后2.5小时观察细胞荧光没有变化，如图5中A、B所示，说明DMSO不降解目标蛋白。但在加入25uM的PROTAC-4的前后2.5小时观察到了明显的细胞荧光变化，如图5中C、D所示，说明PROTAC-4诱导了蛋白降解。仅加入FKBP12抑制剂 AP21998 和结合VHL的多聚精氨酸7肽的前后2.5小时，细胞荧光也没有变化，如图5中E、F所示。紧接着，加入PROTAC-4，前后2.5小时荧光也没有显著变化，说明 AP21998 和7肽与PROTAC-4有竞争性，如图5中E、F所示 。蛋白质印迹分析显示，与仅用DMSO 处理的细胞相比，加入PROTAC-4后2.5小时的EGFP-FKBP12（F36V）显著消除，如图5中K所示。 图 5 DMSO 、 Protac-4 、 AP21998 和多聚精氨酸 7 肽细胞内蛋白降解试验结果 对于PROTAC-5的细胞内降解试验，他们仍旧使用稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的HEK293细胞，通过细胞内荧光的损失来监测AR的蛋白水解。 仅加入DMSO的细胞荧光1小时候未变暗，而加入50、100uM的PROTAC-5后1小时荧光明显消失。仅加入环氧酶素（epoxomicin）和加入环氧酶素+PROTAC-5的细胞，1小时候荧光没有消失，仅加入PROTAC-5的细胞荧光消失，如图6（D、E、F、J、K、L）。显微光场观察到的细胞密度变化说明了PROTAC-5可使细胞数量减少，如图6（A、B、C、G、H、I），环氧酶素对于细胞数量的减少是因为其本身对细胞的毒性而非蛋白酶体抑制。蛋白质印迹试验验证了PROTAC-5通过蛋白酶体途径降解GFP-AR。 图 6 Protac-5 通过蛋白酶体途径降解细胞内 AR 在另外一个细胞试验中，研究人员分别对空白试验（图7A）、加入等体积DMSO（图7B）、25uM的PTOTAC-3（图7C）、25uM的PTOTAC-5和10倍过量睾酮（图7D）、25uM的PTOTAC-5和10倍过量多聚精氨酸7肽（图7E）、25uM的多聚精氨酸7肽和睾酮（图7F）、25uM的DHT（图7G）和多聚精氨酸7肽（图7H）细胞荧光的变化进行了比较。 只有仅加入PROTAC-3的细胞荧光完全猝灭。 也证实了，DHT、睾酮、多聚精氨酸7肽与PROTAC-5竞争性结合AR和VHL，从而阻断荧光猝灭。 图 7 Protac与AR、VHL抑制剂等的对比 细胞荧光试验 下一周，将和大家分享利用 MDM2 泛素降解 雄激素（AR） 的 第一个“整体小分子”的PROTAC的设计 ，敬请关注 分迪科技 微信公众号。 参考文献 1. Schneekloth,J. S., Jr.; Fonseca, F. N.; Koldobskiy, M.; Mandal, A.; Deshaies, R.;Sakamoto, K.; Crews, C. M., Chemical genetic control ofproteinlevels: selective in vivo targeted degradation. J Am Chem Soc 2004, 126(12),3748-54. 【分迪科技 PROTAC践行者】 期待与您合作！ 028-85160035 sales@moldesinger.com www.moldesigner.com PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列 1、 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 2、 【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2 3、 【PROTAC】新药开发系列（三） 降解雌、雄激素受体 欢迎阅读成功案例 1、 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 2、 “解密”纳米材料包载药物的机制：分子模拟研究嵌段共聚物包载多西他赛 3、 食品加工工艺机制研究: 高密度CO2诱导肌球蛋白自组装（上） 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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【PROTAC】新药开发系列（三） 降解雌、雄激素受体
caixin5120 2019-3-2 12:06
上篇文章介绍了 RaymondJ. Deshaies和CraigM. Crews等人在2001年的开创性工作。他们合理地利用与泛素连接酶E3体系SCF（Skp1-Cullin-Fbox）结合的10肽，加上甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）的共价抑制剂Ovalicin（天然产物），设计并合成了首个用于降解MetAP2的PROTAC-1。蛋白试验验证了PROTAC-1可快速降解MetAP2，且它与Ovalicin和10肽竞争性结合MetAP2和SCF。 图 1 PROTAC 通过 SCF 复合物 Box 泛素化降解 ER 和 AR 的机制 这个开创性的工作并没有就此结束，研究者提出了更进一步的问题。 利用SCF的E3体系，是否可以设计不同的PROTAC用于降解其他致病蛋白？共价键蛋白抑制剂可以设计PROTAC，非共价键的天然底物能否用于设计PROTAC？PROTAC在蛋白水平试验有效，在细胞内是否也能产生同样的降解作用？ 带着这些问题，研究者开始了新的 PROTAC设计与验证。这次，他们选择了与前列腺癌相关的雄激素受体（ AndrogenReceptor, AR）和与乳腺癌相关的雌激素受体（ EstrogenReceptor,ER）作为降解的目标蛋白。 很有意思是，这两个靶蛋白成为了后来Arvinas公司也是目前全球推进最快的PROTAC降解的蛋白。 因此，2003年的这个研究是一个具有里程碑意义的工作。 回顾一下上一篇里面提到的，研发最靠前的则是Arvinas公司的两个口服PROTAC（AVS-110，AVS-378），预计在2018年的10月份进入Ⅰ期临床试验，用于治疗耐雄激素限制疗法的前列腺癌和乳腺癌。 图 2 Arvinas 研发管线上的两个 PROTAC 药物 耐雄激素限制疗法的前列腺癌医学上叫 去势抵抗性前列腺癌（CRPC ）是指经过初次持续雄激素剥夺治疗（ADT）后疾病依然进展的前列腺癌。 ADT包括最大限度雄激素阻断、药物去势、手术去势治疗。通过这种治疗方法通常可以抑制肿瘤的进展，但经过一段时间的治疗后，几乎所有的患者均发展为CRPC，一旦到CRPC就很容易发生前列腺癌的转移称为转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC），这是前列腺癌的主要致死因素，mCRPC患者平均中位生存时间仅12.3个月。 被誉为癌症治疗新希望的 免疫 疗法目前对mCRPC 一点办法也没有，二期 临床 实验（NCT02601014 ）表示CTLA-4／PD-1抗体对mCRPC没有很大的作用。 目前，美国泌尿外科协会（AUA）、欧洲泌尿外科学会（EAU）等推荐的首选治疗药物是阿比特龙（雄激素合成抑制剂）和恩杂鲁胺（雄激素受体阻滞剂）。 2015年LANCETONCOL报到对于疾病早期的未化疗mCRPC患者早期使用阿比特龙+波尼松治疗，能把患者的中位总体生存期提高到53.6个月。 恩杂鲁胺2017年销售额为28.65亿元，位居全球抗肿瘤药物销售前20位，也可以见医生和患者对其效果的肯定。 但遗憾的是2012年获FDA批准，到现在还没有进口，所以出现了比《我不是药神》更复杂的情况，只能买国外版的药品，希望国家药品进口政策的开放可以让恩杂鲁胺尽早进入我国，造福CRPC患者。 图 3 降解 ER 和 AR 的两个 PROTAC 的合成路线 为了降解 ER和AR，研究者分别利用了其天然底物（激动剂）雌二醇（Estradiol,E2）和二氢睾脂酮（Dihydroxytestosterone,DHT），通过中间的Linker连接IκBα磷酸化的10肽，设计了PROTAC-2和PROTAC-3。 请注意，这次用来设计PROTAC的小分子为天然底物的激动剂，而非抑制剂，这说明设计PROTAC不一定非要选择抑制剂，激动剂也是可以滴，最重要的是特异性识别目标蛋白。 从ER与E2和AR与DHT的蛋白晶体复合物结构来看，这两个分子都结合在受体蛋白的内部，完全被受体包裹。 这非常有意思，Linker穿过了受体蛋白，制造出了空洞，这提示在设计PROTAC的时候，可以基于受体大胆的假设——没洞，我们可以打洞。 不要让固定的结构限制了我们活跃的思想！ 图 4 E2 与 ER ， DHT 与 AR 的结合模式，橙色和蓝色圈为接 Linker 的地方 试验上，这次研究者采用了裂解 293T细胞进行蛋白降解验证和显微注射293细胞观察降解效果。他们在论文中直接写出由于重组AR遇到问题，故只做了ER的细胞外蛋白实验。在后面的显微注射细胞内试验中，由于只有现成的含绿色荧光蛋白（GFP）AR的细胞，没有ER的，故他们只做了AR的降解试验。 这样的方式，提示我们在科学研究中，试验不是一定非要全部做出来，合理的推导也是可以代替试验滴。 PROTAC-2降解ER的细胞外试验结果如图5 ，+表示添加了对应的物质，-表示没有添加，UbER表示泛素化的ER。 UbER的产生对PROTAC-2有剂量依赖关系，如图5中A所示。PROTAC的确可以增加UbER，E2和 IκBα 磷酸化的10肽不能促进UbER的形成，且E2和 IκBα 磷酸化的10肽与PROTAC-2是竞争性的与ER结合，影响UbER的形成，如C、D、E所示。PROTAC-2特异性的降解ER，其它PROTAC不能诱导ER的泛素化，如F所示。 图 5 Protac-2 降解 ER 的细胞外试验结果 PROTAC-3降解AR的 显微注射细胞 内试验结果如图6 ，显微注射10uM浓度的PROTAC-3到293细胞（GFP-AR）后1小时，绿色荧光蛋白标记的AR蛋白完全消失，如A所示。重复试验总共注射了200多个细胞，每次30-50个，分4-6天完成。结果显示，有51%的细胞中的绿色荧光完全消失，29%的部分消失，16%的荧光降低较小，4%的荧光不消失，如B所示。C、D、E、F、G则是除了PROTAC-3外，还分别加入了 IκBα 磷酸化的10肽、睾酮、蛋白酶体抑制 剂环氧酶素（ epoxomicin ）和PROTAC-2，结果观察到绿色荧光没有减弱或消失。 细胞试验也验证了PROTAC-3的确是通过泛素化-蛋白酶体降解途径诱导AR降解，同时也从细胞层面验证了PROTAC-3降解AR的专一性。 图 6 Protac-3 显微注射 293 细胞后的 AR-GFP 降解试验结果 下一周，将和大家分享利用 VonHippel-Lindau tumor suppressorprotein（VHL） 泛素连接酶诱导 降解 雄激素受体（AR） 的 可透膜 PROTAC 设计，敬请关注。 【分迪科技 PROTAC践行者】 期待与您合作！ 028-85160035 sales@moldesinger.com www.moldesigner.com 参考文献 1. Sakamoto,K. M.; Kim, K. B.; Verma, R.; Ransick, A.; Stein, B.; Crews, C. M.;Deshaies, R. J., Development of Protacs to target cancer-promotingproteinsfor ubiquitination and degradation. Mol Cell Proteomics 2003, 2 (12), 1350-8. PROTAC蛋白降解药物【前世今生】系列 1、 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 2、 【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2 欢迎阅读成功案例 1、 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 2、 “解密”纳米材料包载药物的机制：分子模拟研究嵌段共聚物包载多西他赛 3、 食品加工工艺机制研究: 高密度CO2诱导肌球蛋白自组装（上） 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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【PROTAC】新药开发系列（二）降解MetAP2
caixin5120 2019-3-2 11:58
图 1 Ovalicin 与 MetAP2 共价键结合 甲硫氨酰氨肽酶（MetAP）在细胞内的基本功能是切除细胞内新合成蛋白质的N端甲硫氨酸，为蛋白质后续功能的发挥奠定基础。真核细胞中该蛋白有两种亚型：MetAP1、MetAP2。 研究表明，抑制MetAP2可以调控内皮细胞的生长周期，抑制新生血管生成，如其共价键抑制剂烟曲霉素（Fumagillin）和卵假散囊菌素（Ovalicin） 。 此外， 抑制MetAP2，还能够减少人体脂肪的产生，并增加消耗，还能够减轻饥饿感，减少因脂肪过多而造成的炎症反应。 Zafgen公司针对此靶点，开发了第一代减肥药Beloranib，但因在100多人的临床试验中造成2名病人因血栓死亡，2016年未获FDA批准。该公司继续研发了第二代MetAP2抑制剂ZGN-1061，2017年5月Zafgen公司公布该抑制剂的1期临床结果显示：ZGN-1061可快速吸收和清除，耐受性好且安全，克服了第一代抑制剂导致血栓形成的副作用，且参与试验的患者平均每周体重可以下降约1磅（约合0.45公斤）。 图2 PROTAC通过SCF复合物Box泛素化降解目标蛋白的过程 17年前（2001年）RaymondJ. Deshaies（美国院士）和CraigM. Crews（Arvinas公司创始人）等人首次提出了 蛋白降解靶向嵌合分子（PROteolysis TArgeting Chimericmolecules，PROTACs） 这一概念。 他们第一次成功设计与合成了PROTACs双功能分子用于降解甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）。 研究者选择了含有 Hrt1（SCF）的Skp1-Cullin-Fbox 作为催化泛素与蛋白连接的复合物，选择 甲硫氨酸氨肽酶-2（MetAP-2） 作为降解蛋白（因其表面含有 35 个 赖氨酸残基 ，更容易被泛素化标记）。设计的PROTACs用来募集MetAP2靶向SCF复合物以进行泛素化标记和降解。 PROTACs结合MetAP2的部分是与其共价结合的血管生成抑制剂Ovalicin，PROTACs结合SCF复合物的部分是一个被F-box蛋白β-TRCP特异性识别IKBα上的磷酸肽。 最终的试验结果证明Protac-1可以募集MetAP2到SCFβ-TRCP进行泛素化标记并降解。 图3 第一批PROTACs的合成路线 研究者使用 Ovalicin 和 IKBα上的磷酸肽（IPP） 来验证Protac-1是与其 竞争性的结合MetAP2 。如下图，+表示添加了IPP或OVA，-表示没有添加。结果可以看出，Protac-1在10um的浓度下可以形成MetAP2-Protac-1复合物。 图4 Protac-1与Ovalicin和IPP竞争性结合MetAP2 研究者还使用 LLnL 和 Epoxomicin（二者为蛋白酶体抑制剂） 来证明Protac-1是通过 泛素化降解途径降解MetAP2 的。令人惊讶的是， 15分钟MetAP2-Protac-1复合物开始明显降解，30分钟基本清除完全 。 这一点也证明了泛素化降解过程是一个快速的 生物催化反应 ，快速清除目标蛋白是 蛋白降解机制的特色。 图5 Protac-1通过蛋白酶体途径降解MetAP2 下一周，我将继续与大家分享利用 Skp1-Cullin-Fbox泛素降解雌激素（ER）和雄激素受体（AR）的PROTAC设计 。 分迪科技 PROTAC践行者！ 参考文献： 1. Sakamoto,K. M.; Kim, K. B.; Kumagai, A.; Mercurio, F.; Crews, C. M., Protacs: chimeric molecules that target proteins to theSkp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. ProcNatl Acad Sci U S A 2001, 98 (15), 8554-9. 相关阅读 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 【科普】PROTAC：来看双面胶如何治疗纤维化和癌症 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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【PROTAC】新药开发系列（一）序言
caixin5120 2019-3-2 11:52
蛋白降解靶向嵌合体（PROteolysis TArgetingChimeria, PROTAC） 源于2004年诺贝尔化学奖——以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose共同发现了细胞是如何摧毁有害蛋白质的，即泛素（Ubiquitin, Ub）调节的蛋白质降解过程。 利用泛素调节蛋白质降解这一机制，Raymond J. Deshaies（美国两院院士）和Craig M. Crews（Arvinas公司创始人）等人在2001年最早提出了PROTAC这个概念，并成功地设计和合成了第一批PROTAC双功能分子用于降解甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP-2）。无独有偶，病毒和癌细胞也利用该机制降解细胞内对其抵抗的蛋白，如：SAMHD1、APOBEC3G、p53等。 Raymond J. Deshaies Craig M. Crews 接下来，人们设计了更多的PROTAC分子，从第一代基于多肽片段的PROTAC设计，到2008年开始的第二代小分子PROTAC设计。降解的靶蛋白从最早的甲硫氨酰氨肽酶2、雄激素受体、细胞视黄酸结合蛋白等，到最近的雌激素受体、Tau微管相关蛋白、激酶类等。涉及的疾病包括癌症、类风湿、神经退行性疾病等。 研发最靠前的则是Arvinas公司的两个口服PROTAC（AVS-110，AVS-378），预计在2018年的10月份进入Ⅰ期临床试验，用于治疗耐雄激素限制疗法的转移性前列腺癌和乳腺癌。 PROTAC的优点是可以有效地抑制目标蛋白，又可以快速降解清除。其理论上只需要催化量的药物，就可以降解细胞内几乎所有的蛋白质（包括膜蛋白），故具有较高的安全性、耐药性和广阔的应用前景。 PROTAC的不足是它的高分子量导致其水溶性、口服吸收和透膜性都较差，PK更是一个主要障碍、化学合成成本较高。其脱靶毒性更是值得关注，因为泛素化标记不仅涉及到蛋白质的降解，还关系到甲基化、乙酰化、磷酸化等过程；不仅涉及蛋白质，还涉及到了DNA。就像沙利度胺对胎儿的致畸性一样，其脱靶效应在临床前毒性筛选中不易检测、跟踪，其长期和生殖毒性是一个严峻的问题。 泛素化蛋白质降解的新药开发标志着一个新兴的小分子药物研究领域冉冉升起，吸引了众多学术机构、多家大型药企和投资机构的青睐。除了Arvinas公司，还有C4 Therapeutics、Kymera Therapeutics、Vividion Therapeutics、Warp Drive Bio和Cullgen等生物技术公司正在如火如荼的开展蛋白质降解新药的开发。当然，国际大型制药企业也不能错失机会，基因泰克、辉瑞、Atlas、诺华、默沙东等都已纷纷进军该领域，要么与这些公司合作，要么挖来他们的高管自己开发。这些是否预示着小分子蛋白抑制的研发“黄金时代”即将逝去，蛋白降解时代已经悄然来临？而您做好准备了吗？ 分迪科技 PRODED践行者！ 参考文献： 1. Sakamoto,K. M.; Kim, K. B.; Kumagai, A.; Mercurio, F.; Crews, C. M., Protacs: chimeric molecules that target proteins to theSkp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. ProcNatl Acad Sci U S A 2001, 98 (15), 8554-9. 相关阅读 千里姻缘一线牵：设计PROTAC治疗纤维化疾病 【科普】PROTAC：来看双面胶如何治疗纤维化和癌症 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）新药开发系列【一】 本文版权属于分迪科技，转载请注明出处，商业使用需取得分迪科技书面同意！ 扫描二维码关注分迪科技 微信公众号 ，更多前沿资讯！
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内部翻译资料：泛素与苏木在DNA损伤响应中发挥的调控作用
pujvzi 2018-9-8 11:31
《分子细胞》杂志综述 泛素与苏木在 DNA 损伤响应中发挥的调控作用 （ Regulationof DNA Damage Responses by Ubiquitin and SUMO ） 作者：英国剑桥剑桥大学戈尔登研究所与生物化学部，杰克逊史蒂芬 加拿大多伦多西奈山医院伦恩菲尔德塞缪尔研究所，多伦多大学分子遗传部，堵罗赫丹尼尔 通讯邮箱： s.jackson@gurdon.cam.ac.uk (S.P.J.),durocher@lunenfeld.ca (D.D.) 摘要： 以泛素与苏木多肽共价结合靶蛋白著称的泛素化与苏木化，是细胞功能控制中普遍存在的机制。在此，我们总结了，在泛素与苏木共轭结合底物过程中的关键步骤和关键酶，并概述它们何以在维持基因组稳定性方面发挥紧要的作用。特别的，我们综述了泛素化与苏木化在 DNA 损伤识别、送信和修复的生化、细胞与整个机体层面发挥的调控与协调机制。此综述除了对 DNA 损伤与相关通路的调控和重要性做深入剖析外，由此建立的范式也可普及到其它的细胞进程，或可为更好理解与治疗人类疾病提供裨益。 泛素化与苏木化之基本原理 泛素化者，是将 76 氨基酸长的残余蛋白泛素共价结合到其它蛋白上的过程，起初被认为是靶向目的蛋白，并转交蛋白酶体毁解的机制，现在则认为它还参与蛋白的活性、定位于互作 (Berginkand Jentsch, 2009; Komander and Rape, 2012) 。除了泛素，细胞内还存在甚多与泛素蛋白结构相关的类泛素蛋白（ ubiquitin-likeproteins ， UBL ）。泛素和多数 UBL 都是依赖 E1 ， E2 ，和 E3 连接酶将其碳末端的甘氨酸残基连接到靶蛋白上的（图一）。 UBL 中被广泛研究的是大约 100 个氨基酸长短的苏木蛋白（小泛素相关调节子）。真核生物通常是多个基因表达一种类型的泛素。但是脊椎动物的苏木却有两种： SUMO-1 和高相关度且功能允余的 SUMO-2 与 SUMO-3 （ SUMO2/3 ）。低等生物里，例如酿酒酵母和裂殖酵母，它们中只存在一种苏木蛋白（分别是 Smt3 和 Pmt3 ）。在哺乳动物中，泛素化涉及 2 种 E1 ，超过 35 种 E2 和超过 600 种 E3 酶，而苏木化则由一种异二聚体 E1 ，一种 E2 （ UBC9/UBE2l ）和大约 10 种 E3 介导。 泛素和苏木通常通过它们的碳端与靶蛋白赖氨酸残基上的ε NH2 基团发生异肽键连接而与底物结合的。某些情况下，一个靶蛋白结合一个泛素或苏木，另有一些情况下，靶蛋白的不同赖氨酸残基可以分别结合各自的泛素或苏木。此外，由于泛素和某些苏木也具有可修饰的赖氨酸残基，因此反复共轭结合后可形成多聚体链 (Berginkand Jentsch, 2009) 。对于泛素，氮端甲硫氨酸后的七个赖氨酸残基（ Lys6 ， Lys11 ， Lys27 ， Lys29 ， Lys33 ， Lys48 ， 和 Lys63 ）可以被用来形成泛素链。 SUMO2/3 内部存在可苏木化的赖氨酸残基，因此可形成苏木链。而 SUMO1 内部不具此等赖氨酸残基，因此可以作为链终结子，被整合到底物上去。这些泛素链与苏木链不仅存在结构与物理特征的差异，也存在功能上的差异。例如， Lys48- ， Lys49- ，和 Lys11- 连接的泛素链借到靶蛋白的蛋白酶体降解。而由 Lys-63 形成的泛素链则与蛋白间互作相关。此外，还有资料表明存在不同赖氨酸残基连接的泛素链 (Komander and Rape, 2012) 与泛素苏木共同连接成的链 (Praefcke et al., 2012) 。 与其它翻译后修饰类似，泛素化与苏木化也是可逆的。虽然苏木靶蛋白异肽键只能被一个小的肽酶家族（ SENP1-SENP3 和 SENP5-SENP7 ）断裂，但去泛素化酶（ DUB ）却已经被发现了大约 100 种。 DUB 又被进一步分为 5 种：泛素碳端水解酶（ UCH ），泛素特异蛋白酶（ USP ）和卵巢瘤蛋白酶（ OTU ），约瑟夫素（ Josephin ），以及 Jab1/MPN/Mov34 家族（ JAMM/MPN+ ）。其中前四者为半胱氨酸蛋白酶，最后一个是锌离子依赖的金属蛋白酶 (Nijman et al., 2005) 。除了反作用于泛素苏木连接酶活性， DUB 和 SENP 也参与泛素与苏木前体的加工，而且某些 DUB 是蛋白酶体的内部组分。 \0 \0 图一：泛素与类泛素共价结合循环 泛素和苏木最先被翻译为前体多肽，前体多肽首先在碳末端的双甘基序处被加工（ 1 ）。之后 E1 酶利用 ATP ，将这个基序转换为具有腺苷酸化衍生物的高能键，这个键短暂存在后，立即与 E1 酶上的一个半胱氨酸结合形成 E1- 泛素或 E1- 苏木硫酯中间产物（ 2 ）。泛素或苏木反应基团随后通过转酯反应，被转移到 E2 酶的一个半胱氨酸上，形成 E2- 泛素或 E2- 苏木中间产物（ 3 ）。多数情况下， E3 连接酶作为底物接应子，接应具电荷的 E2 酶与底物的联系（ 4 ）。泛素化和苏木化可以被 DUB （对应泛素）或 SENP （对应苏木）介导逆向反应（ 5 ），否则连续的修饰会形成不同拓扑结构的链（ 6 ）。（ * ）标注其它酶可以移走类泛素（ UBL ）修饰。 DNA 修复与 DNA 损伤响应 基因组的完整性不断地受到外源性和内源性的 DNA 损伤化学物、电离辐射（ IR ）和紫外线（ UV ）辐射、以及 DNA 复制错误的破坏。为纾解此困，细胞具有高效的 DNA 损伤识别、传信和修复的机制，总称为 DNA 损伤响应（ DDR ）机制。这些响应机制对细胞和机体生理具有深刻影响，它的损坏和缺失导致的基因组不稳定，与癌症、干细胞耗损、发育缺陷、不育、免疫缺陷、神经退行性疾病以及早衰皆有关联 (Jack- son and Bartek, 2009) 。 各种不同的 DNA 损伤由各自对应的修复机制修复。 DNA 双链损伤（ DSB ）被非同源末端连接（ NHEJ ）、备选 NHEJ 或者同源重组（ HR ）三种方式修复。 UV 导致的 DNA 损伤，以及其它大块 DNA 加合物可被核酸切除修复（ NER ）机制修复。简单的碱基损伤可以被碱基切除修复（ BER ）机制修复， BER 的组分和反应与 DNA 单链断裂损伤修复重叠。 DNA 碱基错配可以被错配修复（ MMR ）机制矫正。 DNA 的交联，可以被范可尼贫血（ FA ）途径修复。 DNA 损伤首先被识别蛋白识别，识别蛋白可以介导并协调后续 DNA 修复蛋白的募集和活化。 DNA 损伤会诱发磷酸化、泛素化和苏木化等蛋白翻译后修饰的级联反应，这些反应除了协调前述诸多通路，还会协调 DDR 的其它方面，包括调节脱氧核糖核酸的供应，引发细胞周期的延迟（细胞周期检验点）。这些事件大多起始于最顶端的 DDR 激酶 ATM 和 ATR ，它们在 DDR 中的重要性可以从它们的突变疾病，共济失调 - 毛细血管扩张症（ A-T ）和赛科尔（ Seckel ）综合征的表型展现出来 (Durocher andJack- son, 2001; Kerzendorfer and O’Driscoll, 2009) 。在这篇综述里，我们关注泛素与苏木在 DDR 的各个方面被发现的新功能，并着重关注它们响应 DSB 的机制，因为 DSB 是所有 DNA 损伤中细胞毒性最大的。 泛素化与 DNA 复制后修复 最初将泛素化与 DNA 修复联系起来，是因为在酵母中发现具有复制后修复（ PRR ）功能的 Rad6 蛋白是一种 E2 泛素酶 (Jentschet al., 1987) 。 PRR 是一种 DNA 损伤容忍性通路，它通过泛素化和苏木化 DNA 聚合酶延续性因子 PCNA 来调控 DNA 复制机器通过大块 DNA 损伤（图二）。真核生物的 PRR 具有两个亚途径：跨损伤合成（ TLS ）和与 HR 相关的模板切换机制 (Ulrich, 2011) 。在酵母中， PRR 的早期步骤是由 E2 酶 Rad6 和指环型（ RING-type ） E3 酶 Rad18 介导的 PCNA 的单泛素化 (Hoege et al., 2002; Stelter and Ulrich, 2003) 。 PCNA 最初在 Lys164 处单泛素化，这一修饰可以被特殊的 TLS 聚合酶如 Pol η （伊塔）， Pol ι （妖塔）， Pol κ （卡帕），和 Pol ζ （泽塔） 识别，这种识别是通过这些聚合酶上的 UBM 和 UBZ 家族的泛素结合结构域（ UBD ），以及与 PCNA 其它位点互作的基序（如 PIP 盒）来实现的 (Lehmann, 2011) 。与典型的高保真聚合酶不同， TLS 聚合酶的催化位点虽然能通过 DNA 损伤位点，但它却是以序列保真度为代价，使 DNA 复制产生复制错误倾向。酵母 PCNA 还可以被 E3 酶 Rad5 ，联合二聚体型 E2 酶 Ubc13-Mms2 ，在其 Lys164 处多聚泛素化。 Rad5-Ubc3-Mms2 催化形成的 PCNA 的泛素 Lys63 链，可以推动与新合成的姐妹染色单体和 HR 机制相关的模板切换途径修复 DNA 损伤。虽然目前尚不清楚 PCNA 泛素化如何推动模板切换，但哺乳动物的 ZRANB3 转置酶被确定影响 PCNA 的多泛素化 (Zeman and Cimprich, 2012) 。 虽然 PRR 在酵母与人类之间可能存在差异，不过这一通路大体上是进化上保守的，哺乳动物具有 Rad6 （人 HR6A/UBE2A 和 HR6B/UBE2B ）， Rad18 （ RAD18 ）和 Rad5 （ SHPRH 和 HLTF ）的同源基因。对于大多数物种，敲除或降低 RAD18 会导致 PRR 缺陷、 PCNA 单泛素化以及在复制叉阻滞点 TLS 聚合酶如 Pol η （伊塔）的积累 (Lee and Myung, 2008) 。此外 RNA 干扰研究表明人的 HLTF 和 SHPRH 负责 PCNA 的多泛素化，以响应复制叉诱发的损伤 (Motegi et al., 2008) 并抑制突变的发生 (Lin et al., 2011) ，此表型与 E3 连接酶在 无错 PRR 中发挥的作用一致。 除了被泛素化，出芽酵母 PCNA 的 Lys164 （ Lys127 程度略低）还可以被 E3 酶 Siz1 和 E2 酶 Ubc9 苏木化 (Pfander et al., 2005;Stelter and Ulrich, 2003) 。 PCNA 的苏木化，通过募集 Srs2 可以防止 DNA 复制过程中盲目的重组。 Srs2 是一种 UvrD 型解旋酶，它可以将同源重组关键酶 Rad51 从染色质上移除 (Krejci et al., 2003; Pfander et al., 2005; Veauteet al., 2003) 。 Srs2 具有 PCNA 结合结构域 PIP 和苏木互作基序（ SIM ），两者都促使 Srs2 结合苏木化的 PCNA (Arm- strong et al.,2012) 。虽然人细胞中很难检测到 PCNA 的苏木化，但是 最近被报道揭示人细胞中存在一个类 Srs2 蛋白 PARI(Moldovan et al., 2012) 。 \0 \0 图二：泛素与苏木在复制后修饰中发挥的作用。（ A ） PCNA 的 Lys164 处的单泛素化，是在复制叉遇到 DNA 损伤（图中五角星标记）时获得的。单链 DNA 被 E3 连接酶 Rad18 识别， Rad18 与 E2 酶 Rad6 一起将 PCNA 泛素化。泛素化的 PCNA 募集 Y 家族 DNA 聚合酶如 Pol η （伊塔），通过跨损伤合成（ TLS ）过程使复制进程通过损伤位点。在脊椎动物中，去泛素化酶 USP1-UAF1 可以抗拒 PCNA 单泛素化。（ B ）第二种 DNA 损伤容忍型修复方式是模板切换机制。这种机制在 PCNA 被 E3 酶 Rad5 和二聚体 E2 酶 Ubc13/Mms2 多泛素化后发生。模板切换机制需要同源重组。（ C ）在酵母中， PCNA 的 Lys164 苏木化可以募集 Srs2 ， Srs2 可以通过解除 Rad51 核酸蛋白丝而抑制同源重组的发生。 泛素化调控核酸切除修复（ NER ） NER 修复大块 DNA 碱基加合物以及紫外线造成的 DNA 损伤。先天性 NER 因子缺陷会导致皮肤色素沉着病（ Xeroderma pigmentosum ， XP ）、磕磕尼综合征（ Cockayne syndrome ， CS ）和毛细血管营养不良（ Trichothiodystrophy ， TTD ）等疾病。这些疾病通常具有日光超敏，皮肤癌倾向（如果为 XP 的话），认知障碍（ cognitiveimpairment ），早衰，或者发育不良等特征 (Hoeijmakers, 2009) 。 NER 包含两大类：泛基因组修复（ global genome repair ， GG-NER ），作用于全部细胞核 DNA ；伴转录修复（ transcription-coupledrepair ， TC-NER ），特异的作用于转录基因的模板链。在人的 GG-NER 修复过程中， DNA 损伤可以被 DDB1-DDB2/XPE 和 XPC-RAD23 这两组复合物各自独立的识别 (Scrima etal., 2011) （图三）。但是之所以认为 DDB1-DDB2 在 NER 中起到独特作用，是因为研究者观察到 DDB1-DDB2 是 XPC 被募集到染色质上这个过程所需的 (Fitch et al., 2003) 。从机理上讲， DDB1-DDB2 以 E3 链激酶的形式，联合 CUL4A/B ，介导组蛋白的单泛素化和 DDB2 与 XPC 的多泛素化 (Scrima et al., 2011) 。虽然 DDB2 的自我泛素化使其被靶向降解，而 XPC 的泛素化则因为受到蛋白酶体互作蛋白 RAD23 的保护而免于被蛋白酶体降解 (El-Mahdy et al., 2006;Sugasawa, 2006; 以及其中的文献 ) 。 RNA 聚合酶（ RNAPII ）在遇到 DNA 损伤导致的转录停滞，可以触发两种独立的级联反应。第一是 TC-NER ，第二就是将 RNAP II 泛素化，并将之从染色质上卸下，降解（图三）。 TC-NER 依赖于与 RNAP II 关联的 SWI/SNF 家族的染色质重塑蛋白 CSB （ ERCC6 ） (Gaillardand Aguilera, 2013) 。除了具有染色质重塑活性， CSB 还可将 CSA （ ERCC8 ）募集到 DNA 损伤位点。 CSA 与 DDB1 和 CUL4 一起形成 E3 连接酶。 CSB 和 CSA 的作用可能是对 TC-NER 进程的许可指令，使得 RNAP II 后撤与 NER 核心组分募集等事件得以实现 (Gaillard and Aguilera, 2013) 。虽然到底哪个泛素化事件启动了 TC-NER 尚未确认，但 RNAP II 与 CSB 的泛素化最有嫌疑。考虑到此， CSB 具有一个功能重要的 UBD （泛素结合结构域），说明 CSB 可以识别这一关键泛素化事件 (Anin- dya et al., 2010) 。进一步的， DUB （去泛素化酶） USP7 被 UVSSA （在类 CS 的 UV 敏感综合症患者中发生突变）募集到停滞的聚合酶处 (Cleaver,2012) 。 UVSSA-USP7 与 RNAP II 互作，并延迟了 CSA 依赖的蛋白酶体对 CSB 的降解。 蛋白酶体降解 RNAP II 可以被视为 TC-NER 修复的最终方案，它可以作为一个案例，来研究泛素链的编辑。在酵母中，这些过程涉及 E3 酶 Rsp5 （哺乳动物的 NEDD4 ）， Rsp5 催化 RNAPII 上泛素的 Lys63 连接链的形成 (Anindya etal., 2007; Wilson et al., 2013) 。这种泛素链又可以被一种 DUB 酶 Ubp2 剪短，导致 RNAP II 的单泛素化。而后，单泛素化的 RNAPII 又可以在 Elongin/Culin 3 复合体的作用下长出泛素的 Lys48 连接链，这种链可以在 RNAP II 被 Cdc48 分离酶（酵母的 VCP/p97 同源蛋白）从染色质上卸载下来后，促进 RNAPII 的降解 (Harreman et al., 2009; Verma et al., 2011; Wilsonet al., 2013) 。 \0 \0 图三：泛素在核酸切除修复过程中发挥的作用。（ A ） GG-NER 促进基因组 DNA 上的大块损伤的修复。这种损伤可以被 DDB1-DDB2 和 XPC-RAD23 复合体识别。 DDB1-DDB2 与 CUL4 和 RBX1 （未标出）一起组成 E3 酶，导致 DDB2 的自我泛素化及其降解，也导致了 XPC 的多泛素化。 XPC 可以被 RAD23 保卫住。 RAD23 具有类泛素结构域，可以与蛋白酶体互作，使得 XPC 免于被降解。也正因此，后续的 NER 过程，如 XPA 的募集，才得以继续进行。（ B ） TC-NER 修复在转录的 DNA 链上的大块损伤。当 RNA 聚合酶在遇到损伤而停滞时，两种独立的修复途径可以发生：第一（右侧），在 CSB 和 CSA 发挥了关键作用后， TC-NER 被激活。 CSB 与 RNA 聚合酶相连，募集 CSA ， CSA 与 DDB1 组成基于 CUL4 的 E3 酶。具体的 CSA 关联 E3 酶的关键底物是什么还不清楚，但 CSB 是被泛素化的，且泛素化的 CSB ，被由 UVSSA 募集到停滞的聚合酶处的 USP7 护卫住，使其降解得以延迟。第二（下部），作为最终方案， RNA 聚合酶可以被泛素化，从染色质上卸载，并被蛋白酶体降解。在酵母中，这一步骤由 Rad26-Def1 （未标出）起始， Rad26-Def1 导致 Rsp5 依赖的 RNA 聚合酶的泛素化。 Rsp5 可以促使泛素形成 Lys63 链，而 DUB 酶 Ubp2 可将之剪短为单泛素化。单泛素化的 RNA 聚合酶成为 Elongin-Cullin 3 复合物的底物。在 RNA 聚合酶上新形成的泛素 Lys48 链，可以协助 Cdc48 将停滞的聚合酶从染色质上卸下来， RNA 聚合酶被卸下来之后被降解。 由 RNF8 和 RNF168 组织的基于泛素的 DSB 传信 泛素和苏木在细胞内传信的重要例证，是其在募集 53BP1 和肿瘤抑制蛋白 BRCA1 到 DSB 位点外围染色质的过程中展现的协调作用 (Lukas et al.,2011) （图四）。这些事件由组蛋白变体 H2AX 的磷酸化（形成γ H2AX ）起始的，γ H2AX 随后被 MDC1 识别 (Stuckiet al., 2005) 。 MDC1 随即被 DSB 响应激酶 ATM 磷酸化，这些磷酸化位点与指环型 E3 连接酶 RNF8 的 FHA 结构域结合 (Huenet al., 2007; Kolas et al., 2007; Mailand et al., 2007) 。此后， RNF8 借助与大 HECT 型连接酶 HERC2 的互作，将 DSB 位点的蛋白泛素化 (Bekker- Jensen et al., 2010) 。随后，指环型 E3 酶 RNF168 通过它的 UBD 结构域（可以识别被 RNF8 泛素化的底物，以及被其自身泛素化的底物），被募集而来。（ The UBDs of RNF168 are notequivalent and are integrated in functional modules containing targetingmotifs, the LRMs that are also present on RAD18 and RAP80 ） RNF168 上的 UBD 结构域与其它 UBD 并不相同，它们被整合到包含靶向基序的功能模块（ LRM ）中，这种 LRM 也存在于 RAD18 和 RAP80 中 (Panier et al., 2012) 。应对 DNA 损伤时， RNF8/RNF168 依赖的泛素化的结果是将 DNA 损伤修复或传信蛋白如 53BP1 、 RAD18 、 BRCA1 、 RAP80 复合体（或称之为 BRCA1-A ）、 HERC2 、 BMI1 、 RIF1 、 RNF169 、 NPM1 、 FAAP20 以及 NIPBL 等募集抑或维持在 DNA 损伤位点周围的染色质上 (Lukaset al., 2011) 。在正常细胞生理层面， RNF8/RNF168 依赖的泛素化，促进了在免疫球蛋白种类切换和非功能性端粒融合过程中的 NHEJ(Krackerand Durandy, 2011; Peuscher and Jacobs, 2011; Rai et al., 2011) 。除了 NHEJ ， RNF8 也可促进 HR 。 RNF168 灭活性突变会在临床上表现出相应 DNA 损伤修复的缺陷。这种突变发生于与 A-T 相关的免疫缺陷和细胞辐射敏感综合征 RIDDLE 的患者上 (Stewart et al., 2009) 。 \0 \0 图四：泛素在基于染色质的 DNA 双链损伤响应中的作用。（ A ） DSB 导致 H2AX 的 ATM 依赖的磷酸化，磷酸化的 H2AX 被 MDC1 识别。 ATM 也磷酸化 MDC1 ，以促进 E3 连接酶 RNF8 的募集。 RNF8 将染色质（ X ）上的未知因子泛素化，此泛素化随后被 RNF168 的氮端泛素结合结构域结合。 RNF168 泛素化 H2A ，这位 RNF168 提供了第二个聚集信号。除了 RNF8/168 ， DSB 还刺激 BMI1-RING1B 的募集，这一复合体泛素化 H2A 的碳端。图中也标出去泛素酶（ DUB ）对此泛素化过程的抵抗。（ B ） OTUB1 通过与 E2 酶结合抵抗 RNF168 依赖的泛素化。 RNF8/168 也刺激了染色质上 63 位赖氨酸泛素链的形成。（ C ）染色质上 RNF168 依赖的泛素化募集了许多效应因子，包括 53BP1 （促进 NHEJ ）和 BRCA1 （促进 HR ）。 在有丝分裂时， RNF8途径将会被关闭，这可能与有丝分裂过程中染色质难以泛素化相关(Giuntaet al., 2010)。 In another striking example of regulation, itrecently emerged that RNF168 is a limiting factor in the RNF8 pathway, with theE3 ubiquitin ligases TRIP12 and UBR5 collaborating to regulate RNF168 levels,thereby preventing excessive histone ubiquitylation at DSB sites (Gudjonsson etal., 2012).在另一个引人注目的案例里，泛素连接酶TRIP12与UBR5一起调节RNF168的蛋白含量，从而使RNF168表现为RNF8通路的限速因子，这样可以防止DSB位点过多的组蛋白泛素化(Gudjonsson et al., 2012)。如能揭示TRIP12与UBR5是如何影响RNF168的蛋白含量的，并弄明白有哪些生理条件影响这一调节机制，那这将是非常有意义的一件事。在这点上，TRIP12具有一个WWE结构域，这一结构域在其它蛋白上表现为聚ADP核糖结合活性，因此RNF168的蛋白含量可能受到聚ADP核糖基化的调控。单纯孢疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）感染也能调控RNF8通路。HSV的ICP0蛋白（在病毒由潜伏期向裂解期转变的过程中发挥关键作用），是一种E3酶，它可以靶向RNF8和RNF168，导致其降解(Chaurushiya et al.,2012; Lilley et al., 2010)。比较特别的是，ICP0以一种“方向降解子（degron）”的机制，与RNF8的FHA结构域通过磷酸化依赖的方式互作，从而达到靶向降解RNF8的目的(Chaurushiya et al., 2012)。RNF8和RNF168的降解不仅干扰了HSV单链DNA起始的DDR过程，也使得RNF8/RNF168依赖的病毒基因组转录抑制得以解除。 虽然早期工作认为 RNF8/168 的初级靶蛋白是 H2A 型组蛋白，不过突变实验发现 RNF8/168 的靶位点有异于经典的 H2A 的 K119 泛素化位点 (Huen et al., 2007) 。确实，最近的证据显示 RNF168 靶向 H2A 的氮端的 Lys13/15 位点 (Gatti et al., 2012;Mattiroli et al., 2012) 。一个重要的问题是，我们需证明 H2A 的 Lys13/15 的泛素化是否或如何促进 DSB 位点侧翼染色质对蛋白的募集，以及这种调节怎样与其它的响应 DSB 的组蛋白修饰相互协调的。对于这点，我们联想到，虽然 H2A 的 Lys13 与 Lys15 ，在核小体的立体结构里远离 H2A 的 K119 位点，可是它们却与 H2B 的 K120 位点离得很近。 H2B 的 K120 位点被 E3 连接酶 RNF20 和 RNF40 ，在 E2 连接酶 RAD6 的协助下泛素化 (Zhu et al., 2005) 。 RNF20 与 RNF40 也是通过 ATM 依赖的机制，被募集到 DSB 位点，将 H2B 单泛素化的 (Moyal et al., 2011; Nakamura et al., 2011) 。这一联想，可能可以解释为什么 Rnf8 突变的小鼠胚胎成纤维细胞表现为 H2B 的 K120 泛素化正常水平的下降 (Wu et al., 2009) 。因为哺乳动物的 H2B 泛素化可调节转录和染色质凝聚 (Weake and Workman, 2008) ， H2A 的 K13/K15 与 H2B 的 K120 的泛素化之间可能的联系，可能在某种程度上解释为何 DSB 位点附近会发生 RNF8/RNF168 依赖的转录失活 (Shanbhag et al., 2010) 。 DNA 损伤导致的组蛋白泛素化并不局限在 H2A 的 K13/K15 和 H2B 的 K120 上。 DSB 位点也会聚集 E3 酶 BMI1-RING1B ，这种 E3 酶被认为可以提高 H2A/H2AX 的 K119 位单泛素化，此种泛素化可能参与 DNA 损伤诱导的转录沉默 (Gieni et al., 2011; Shanbhag et al., 2010) 。此外，蛋白质组学数据揭示，所有核心组蛋白，以及 H1 、 H2AZ 、 H2AX 和 macro-H2A 在很多位点都能发生泛素化 (Kim et al., 2011; Wagneret al., 2011) 。如能发现这些位点的泛素化可以影响 DNA 损伤或被 DNA 损伤影响，那这也是很有意思的实验。 53BP1 和 BRCA1 对 DSB 响应的调控 53BP1 和 BRCA1 是 RNF8 通路的两个主要效应因子，但它们却具有截然相反的作用： 53BP1 抑制 DNA 末端的切割，以此促进 DNA 损伤的 NHEJ 修复 (Noon and Goodarzi, 2011) ，而 BRCA1 促进 DSB 的 HR 修复，并在一定程度上与 DNA 断裂末端的切割的起始相关 (Li and Greenberg, 2012) 。因此 53BP1 与 BRCA1 ，在 NHEJ 和 HR 两种修复机制的拔河比赛中，发挥了关键性的作用。因为 53BP1 的失活抑制了与 BRCA1 功能缺失相关的致死、癌变和大多数突变剂的敏感性，此种功能拮抗对我们理解为何 BRCA1 具有肿瘤抑制因子的功能有很大帮助 (Bouwmanet al., 2010; Bunting et al., 2010) 。另一种拮抗效果表现在， BRCA1 可能是一种 53BP1 的竞争者或抑制剂，特别是在 HR 修复明显上调的 S/G2 期 (Chapman et al., 2012) 。 53BP1 聚集到 DSB 位点的机制，到目前还不是很清楚，因为 53BP1 没有可识别的泛素结合区域。反之， 53BP1 有一个可以与组蛋白 H4 的 Lys20 单或二甲基化（ H4K20me1/2 ）结合的串联都铎结构域（ tandem Tudor domain ），以及一个与蛋白蛋白互作相关的 BRCT 结构域 (Botuyanet al., 2006) 。需要注意的是， 53BP1 需要都铎结构域，而不是 BRCT 区，来完成在 DSB 位点的聚集 (Pryde et al., 2005) 。近来的实验说明， L3MBTL1 与 JMJD2A 两个蛋白平时与 H4K20me1/2 结合，但是当 DNA 发生损伤时，这两个蛋白会从染色质上被卸载下来 (Acs et al., 2011; Mallette et al., 2012) 。 L3MBTL1 的卸载需要分离蛋白 VCP/p97 ， VCP/p97 可以通过 K48 连接的泛素与其辅助因子 NPL4 来靶向聚集到 DSB 位点 (Acs et al., 2011) ；而 JMJD2 则受 RNF8 通路影响而降解 (Mallette et al., 2012) 。 Meerang et al. (2011) 发现了另外一种机制，也证明 VCP/p97 参与维持 53BP1 在 DSB 位点的定位。虽说单单通过泛素化，就可以将 JMJD2A/L3MBTL1 卸载的说法很吸引人，但是尚难将这一理论与 53BP 依赖其结构、其都铎结构域与染色质产生联系的理论 (Bothmeret al., 2011) ，以及 H2A 的 K13/15 泛素化在 53BP1 向 DSB 位点聚集具有紧要作用的理论 (Mattiroliet al., 2012) 整合。如果不能在生化层面重建 RNF168 依赖的 53BP1 染色质结合，那么就解释不清 53BP1 向 DSB 位点聚集的具体机制。 BRCA1 与 RARD1 一起组成一个二聚体的环型 E3 酶， BRCA1 除了作用于 HR ，也与伴转录 DNA 修复、 DNA 交联修复和检验点控制相关。虽然确知 BRCA1 聚集到 DSB 位点是凭借 RNF8 和 RNF168 依赖的泛素偶合物的形成而完成的 (Lukas et al., 2011) ，但到底 BRCA1 是如何识别这一泛素偶合物的还尚在研究当中。 BRCA1 在 DSB 位点的长期维持依赖它与 RAP80 复合体（以及 RAP80 的泛素结合 UIM 模块）的互作，但是 RAP80 对 BRCA1 向 DSB 的起始募集是非必需的 (Hu et al., 2011; Yin etal., 2012b) 。目前，在 BRCA1 的 E3 连接酶活性是否对 DNA 修复和肿瘤抑制至关重要这个问题的看法上，尚存大量歧见，折中的观点认为这一活性对 HR 修复并不重要 (Liand Greenberg, 2012; Shakya et al., 2011; Zhu et al., 2011) 。确实，当 BRCA1 的环结构域被突变（ BrcaI26A ）后，它与 E2 连接酶的联系被阻断，但是细胞依然可以用 HR 修复 DSB ，而且突变鼠表型正常，肿瘤潜伏时间正常 (Li and Greenberg, 2012; Shakya et al., 2011) 。但是，鸡的 DT40 细胞的类似突变，导致细胞对拓扑异构酶一毒物喜树碱（ camptothecin ）引发的 DNA 损伤极为敏感 (Sato et al., 2012) 。因此，尚需更多的工作来破解 BRCA1 的 E3 连接酶活性的特殊功能。 范可尼贫血通路中的泛素控制 范可尼贫血（ FA）是一种罕见的，以发育异常、癌症倾向、慢性骨髓缺陷、以及阻断转录和复制的DNA链间交联（ICL）损伤修复的缺陷等为特征的隐性遗传病 (Garner and Smogorzewska,2011; Kim and D’Andrea, 2012)。目前已知有15个基因（FANCA到FANCP）的双等位基因突变会导致FA，它们对应的蛋白参与S期发生的FA通路的三个基本事件：ICL识别与切除，跨损伤合成与HR介导的修复 (Knipscheeret al., 2009)。复制叉与ICL的相遇，导致FA核心复合体与染色质的结合，这就激活了FA通路（图五）。核心复合体中的FANCL亚基是一个E3连接酶，它与E2酶UBE2T合作，将异二聚体FANCD2-FANCI的两个亚基全部单泛素化，单泛素化的FANCD2-FANCI为后续的修复提供了一个平台(Joo et al., 2011)。特别的，泛素化除了帮助将FANCD2-FANCI挂到染色质上，泛素化的FANCD2也可以被结构特异核酸酶FAN1的名为UBZ4的泛素结合结构域（UBD）识别，也有人说泛素化的FANCD2也可以与核酸酶骨架SLX4（FANCP）互作(Sengerová et al., 2011)。这些因子被募集到DNA损伤位点后，核酸酶剪断损伤的DNA链，引发了后续的包括本综述到处提及的跨损伤合成和HR事件。其它的FA通路与泛素的联系，还包括FA核心复合体相关因子FAAP20借助其自身的UBD与RNF8介导的泛素化的底物结合，与RNF8一起促进FA核心复合体与FANCD2向ICL的募集(Yan et al., 2012)。 在 DNA 损伤响应中的去泛素酶作用 一个熟知的去泛素酶（ DUB ）是 USP1 ，它是 FANCD2 的主要去泛素酶，将其灭活会导致许多范可尼贫血的表征，说明范可尼贫血通路的有效运作既需要控制泛素化，也需要适当的控制去泛素化 (Kimand D’Andrea, 2012) 。在这点上， USP1 的激活因子 UAF1/WDR48 ，具有两个串联的类 SUMO 结构域，可介导其与 FANCI 上的 SIM 相关序列互作，从而将 USP1 引向 FANCD2/FANCI(Yanget al., 2011) （图五）。其它去泛素酶诸如 USP3 ， USP16 ， BRCC36 ， POH1 和 OTUB1 都参与 RNF8 通路的反向调控，其中 USP3 和 USP16 就是因为具有反作用于 H2A 泛素化的活性 (Weakeand Workman, 2008) ，且 USP3 过表达可阻断 RNF168 向 DSB 位点的募集 (Doil et al., 2009) ，才被认为与 RNF8 通路相关的。在另一方面， USP16 反作用于 RNF8/168 介导的 DSB 引发的转录抑制 (Shanbhaget al., 2010) 。 BRCC36 （ BRCC3 ）是一个 JAMM/MPN(+) 异肽酶，对 63 位赖氨酸连接的泛素链具有很强的选择性，它是 BRCA1-RAP80 复合体的一个组分，可在 RNF8/168 启动后聚集到 DSB 位点 (Cooper et al., 2009; Donget al., 2003; Shao et al., 2009; Sobhian et al., 2007; Wang and Elledge, 2007) 。此外，另一个选择性针对 63 位赖氨酸泛素链的 JAMM/MPN(+) 蛋白是蛋白酶体相连的去泛素酶 POH1/PSMD14 ，它与 RNF8 通路的反向调节相关 (Butler et al., 2012) 。总结起来，这些发现表明蛋白酶体相连的 POH1 和 BRCA1/RAP80 相连的 BRCC36 可能联合起来限制 RNF8/168 依赖的 63 位赖氨酸泛素链在 DSB 位点形成。值得注意的是， OUT 家族去泛素酶 OTUB1 ，虽然是 RNF168 依赖的泛素化的反向调节子，但奇怪的是，这与它的异肽酶活性是无关的 (Nakada et al., 2010) 。相反的， OTUB1 是通过它的催化位点与一段伪酶解产物的组合而结合并抑制 RNF168 相关的 E2 酶（ UBC13/UBE2N 和 UBE2D/UBE2E 家族的 E2 酶）的 (Juang et al., 2012; Wieneret al., 2012) 。 DUB 们无疑还影响了很多其它的 DRR 过程，比如 USP1-UAF1 也可调节 PCNA 的泛素化与 TLS(Huang et al., 2006) 。其它值得关注的 DUB 还有： USP47 ，它可以通过调节 DNA 聚合酶β的水平而影响 BER(Parsonset al., 2011) ；肿瘤抑制子 BAP1 ，调节 H2A 的 K119ub(Scheuermann et al., 2010) ；还有 USP7 ，它调节许多 DDR 蛋白的稳定性，包括 p53 和 ERCC6(Fraile et al., 2012) 。由于这些 DUB 更易于被开发的小分子调控，因此评估这些不同 DUB 作为药物研发的潜在靶点是比较有意义的事。 \0 \0 图五：泛素在范可尼贫血通路中的作用。 DNA 链间交联（ ICL ）是可以阻断复制叉的损伤。 DNA 复制叉的停滞以及 FANCM 及相关因子（未示）的存在，促进了多亚基的 FA 核心复合体的募集，这一复合体是一个 E3 连接酶。这一 E3 的催化亚基是 FANCL （它的 E2 是 UBE2T ）。 FA 核心复合体单泛素化 FANCD2-FANCI 。 FANCD2-FANCI 的反诉胡被 FAN1 （也可能是 SLX4 ）识别， FAN1 和 SLX4 都含有 UBZ4 型的泛素结合结构域。去泛素酶 USP1-UAF1 可以反转 FANCD2-FANCI 的泛素化，这对 FA 通路甚为重要。核酸酶（ FAN1 或 SLX4 ）的募集可以切割、解脱 ICL ，引发后续的 TLS 或 HR 。 泛素化调控 p53 对 DNA 损伤的响应 脊椎动物的 DNA 损伤响应的一个主要执行者就是转录因子 p53 ，它的突变与各种类型的人类癌症相关。许多实验室的大量研究都说明 p53 的含量和功能的调节是为了响应 DNA 损伤，而泛素化与苏木化在这些调节反应中都起了关键作用。鉴于这方面研究的广度，我们这里只能对它进行粗略的综述（想读全面的综述，请看 Laneand Levine, 2010 ）。简短的说，已发现的参与 p53 调控的 E3 酶就超过十个，其中被研究最多的是环型 E3 酶 Mdm2/HDM2 （前为小鼠后为人类的基因名） (Brooks and Gu, 2011) 。 Mdm2 可形成同二聚体，也可以与相关 E3 酶 Mdmx/HDMX 组成异二聚体，结合并泛素化 p53 ，促进蛋白酶体介导的 p53 降解，以使 p53 在正常时保持比较低的含量。然而，当响应 DNA 损伤时，施加于 p53 ， Mdm2 和它们的调节子身上的各类修饰，包括那些被检验点激酶 ATM 、 ATR 、 CHK1 和 CHK2 催化或促进的，会抑制 p53 的泛素化和降解，并促进 p53 的转录活性，使它和它的辅助因子一起促进其靶基因的表达。这些基因又会产生各类响应，包括细胞周期延迟、襄助 DNA 修复蛋白、以及在某些案例中维持细胞周期停滞或引起凋亡。还有就是，最近的研究强调了各类去泛素酶，包括 USP7/HAUSP 、 USP10 、 USP29 和 USP42 在调节 p53 含量和活性上起到了重要作用 (Hock et al.,2011) 。 BER 中苏木化的事例 苏木化与 DNA 修复的联系首先在 BER 的研究中被确认（图六）。 BER 通路由 DNA 糖苷酶识别各类碱基损伤起始，这些糖苷酶将损伤的碱基移除，留下了无碱基位点，这些位点随后被处理并修复。胸腺嘧啶 DNA 糖苷酶（ TDG ）可以移除由 5 甲基胞嘧啶或胞嘧啶脱氨基产生的 G:T 或 G:U 错配中的胸腺嘧啶或尿嘧啶。生化研究表明，与某些其它 DNA 糖苷酶类似， TDG 会强烈的结合到它产生的物碱基位点， TDG 与其产物的结合抑制了其自身活性，这会损害 BER 的后续步骤。值得注意的是， SUMO1 与 TDG 的碳端结合，并与 TDG 蛋白其它区域的 SIM 基序发生互作，导致 TDG 氮端的构象变化，使之与产物结合的能力下降，从而使 TDG 的酶活性得以恢复 (Baba et al., 2005; Steinacher and Scha ̈r, 2005) 。这些研究得出一个分子交接模型：未与 SUMO 连接的 TDG 结合并接到碱基水解，而之后的 SUMO 结合与 TDG 的苏木化，将 TDG 从靶位点移走。这促进了无碱基 BER 中间物向 APE1 核酸内切酶的交接，促使修复过程后续步骤的进行。 DSB 修复中的苏木与泛素的对谈 一个被详述的苏木化与 DSB 响应的直接关联来自对酿酒酵母 HR 关键因子 Rad52 的研究。 Rad52 的苏木化需要 Mre11 复合体、 Ubc9 和与哺乳动物的 PIAS 蛋白（见下文）相关的 E3 酶 Siz2 。 Rad52 的苏木化除了保护 Rad52 免于被降解，也使 Rad52 免于进入核仁以防止核糖体 DNA 重复序列之间的不正常重组 (Torres- Rosell et al., 2007) 。苏木化也以其它方式控制酵母的 HR 。黏连素是扣住姐妹染色单体的多蛋白复合体，黏连素扣住姐妹染色单体可以促进有丝分裂时染色体的平均分配，并促进 DNA 复制后的姐妹染色单体间的同源重组修复。在酿酒酵母中，姐妹染色单体之间的黏连，除了于 S 期产生，还会在 G2/M 期因 DSB 而被局部的和全局的进一步加强。黏连素亚基 Mcd1 会因 DSB 的形成而苏木化，这依赖于黏连素相关 Smc5-Smc6 复合体的组分苏木 E3 酶 Mms21 （ Nse2 ），且促进了 DNA 损伤引发的黏连 (McAleenan et al.,2012) 。相关通路在脊椎动物中可能也存在，因为人的 Smc5-Smc6 向 DNA 损伤位点的聚集（以促进姐妹染色单体同源重组）至少部分的需要 MMS21/NSE2 对人的 SCC1 （ Mcd1 同源蛋白）的苏木化及其对黏连素反向因子 WAPL 的抵制作用 (Wu et al., 2012) 。对酵母中各类 HR ， NHEJ ， BER ， NER ， MMR 以及检验点组分的 DNA 损伤诱导的苏木化的探究强化了如下问题，苏木化是如何影响各类 DDR 响应组分的 (Cremona et al., 2012) 。确实， (Psakhyeand Jentsch, 2012) 最近的酿酒酵母的工作揭示，虽然不同 HR 因子的苏木化集合起来对 DSB 修复是重要的，但任何单一苏木化的缺失，却只对 DSB 修复造成轻微影响。这可能是苏木化作用的一个原则，即“蛋白群体修饰”原则，这不仅在 DNA 修复通路上如此，其它通路也如此。 在哺乳动物中，将苏木化与 DSB 响应联系在一起，缘起于研究发现 SUMO1 、 SUMO2/3 、 UBC9 以及 PIAS 和 MMS21 苏木 E3 酶可向 DSB 或复制阻滞位点聚集 (Galanty et al., 2009; Morris et al., 2009) （图六）。此外， PIAS4 的灭火严重损害了 DSB 位点 RNF168 的集聚和 63 位赖氨酸泛素的累积，以及 53BP1 和 BRCA1 的聚集，而 PIAS1 的确实只阻止了 RAP80 和 BRCA1 的聚集。与此一致， PIAS1 或 PIAS4 确实严重损害了 HR 和 NHEJ 对 DSB 的修复，并导致细胞对 DSB 诱导试剂的高度敏感性 (Galanty etal., 2009; Morris et al., 2009) 。虽然 RNF8 或 RNF168 的确实并不妨碍 PIAS1/4 向 DNA 损伤位点的募集，但它显著的减少了 SUMO1 和 SUMO2/3 的聚集。这可能是因为 RNF8/168 介导了 BRCA1 和 53BP1 等因子的聚集，而这些因子将会被苏木化，当然， RNF8/168 直接作用于 PIAS1/4 的可能性也是有的。进一步的，虽然 PIAS1/4 不是 RNF8 向 DAN 损伤位点聚集所需要的，但 PIAS4 （不关 PIAS1 ）的缺失会损害 RNF168 的聚集。值得注意的是， RNF168 和 HERC2 是以 DNA 损伤和 PIAS4 依赖的方式被苏木化的， PIAS4 的缺失不仅降低了 RNF148 的量，也损害了 HERC2 向 RNF8 结合，并波坏了 IR 引发的 HERC2 向染色质的聚集 (Danielsen et al., 2012) 。当 BRCA1 定位到 DSB 位点后即被 PIAS1 亦或 PIAS4 苏木化，这加强了 BRCA1 的泛素连接酶活性 (Morris et al.,2009) ，这种作用可能是因为苏木化可帮助 BRCA1 与 E2 酶亦或其它含有 SIM 的靶蛋白的关联。 PIAS1 和 PIAS4 的其它功能可能是通过其对 53BP1 等因子的苏木化实现的 (Galanty et al., 2009) 。苏木 E3 连接酶在 DDR 中的功能还表现在如下两点： PIAS1 余 SNM1A 之间的互作促进了 ICL 的修复 (Ishiai et al., 2004) ，酪氨酸 DNA 磷酸二酯酶（ TDP1 ）的苏木化增强 DNA 单链断裂的修复 (Hudson et al., 2012) 。此外，虽然在 S 期 SUMO 蛋白酶 SENP6 可与 RPA70 互作，保持 RPA70 低苏木化，但 DNA 复制的压迫将这一复合体解离，允许 SUMO2/3 修饰的 RPA70 的积累，苏木化 RPA70 的积累又可以将 RAD51 募集到损伤的 DNA 处，从而促进 HR (Dou et al., 2010) 。在人的布鲁姆综合征（ Bloom’ssyndrome ）存在缺陷的 RecQ 家族 DNA 解旋酶 BLM ，也可以被苏木化，如引入突变，阻断 BLM 之苏木化，就会引起 S 期 DNA 损伤的产生、 DNA 损伤的高度敏感性并损害 RAD51 向复制阻滞位点的定位 (Ouyang et al., 2009) 。 \0 \0 图六：苏木在各类 DNA 损伤响应通路中的作用之实例。（ 1 ） BER 中的胸腺嘧啶 DNA 糖苷酶（ TDG ）被它的产物抑制。 TDG 的苏木化使其构象发生变化，从而使其从其产物上解脱下来。（ B ）在基于染色质的 DSB 响应中的，苏木化在各步骤里的作用。详见正文。（ C ）苏木化也可以促进泛素化。比如 STUbL 蛋白，它是一类 E3 泛素连接酶，可通过识别被苏木化的底物上的苏木将底物泛素化。在实例中， RNF4 在 DSB 响应时促进 MDC1 的周转（或重复利用）。 其它泛素化与苏木化之间的联系可以通过靶向苏木的泛素连接酶（ STUbL ）来说明，它们包括人的 RNF4 ，裂殖酵母的 Rfp1/2-Slx8 和酿酒酵母的 Slx5-Slx8 (Prudden et al., 2007) 。 STUbL 含有 SIM 基序，可以结合靶蛋白上的耦合的苏木或者其中的类苏木结构域，然后将靶蛋白泛素化，这通常会导致靶蛋白被蛋白酶降解。虽然研究表明酿酒酵母的 Slx5-Slx8 和裂殖酵母的 Rfp1/2-Slx8 调节 HR ，但是其具体机制至今未明。相反，近期研究显示，在人和鸡的细胞中， RNF4 的灭活不仅引起 DSB 的 HR 修复缺陷，也导致 NHEJ 修复的缺陷 (Galanty et al., 2012; Luo et al., 2012; Yin et al., 2012a) 。还有就是， RNF4 向 DSB 位点的募集是依赖它自身氮端的 SIM 基序以及被苏木化的 DSB 响应蛋白，诸如 53BP1 ， MDC1 和 RPA ，被募集之后， RNF4 介导靶蛋白的泛素化的积累（图六）。虽然 RNF4 的功能底物有很多，但其中主要的应该是 MDC1 和 RPA ， RNF4 可以促进这些底物在 DSB 位点的周转率。例如，由 RNF4 缺失或 RPA 苏木化位点的突变造成的 RPA 周转率下降，会导致 RAD51 替换 RPA 的效率下降，因而损害 HR(Galanty et al.,2012) 。因为 RNF4 促进蛋白酶体向 DSB 位点的聚集，如将蛋白酶体的亚基去除，就会引起与 RNF4 缺失类似的表型，这说明 RNF4 介导的靶向苏木的 DDR 因子的泛素化导致这些底物被蛋白酶体识别，以此造成它们在所在位置的周转，以协助 DNA 损伤修复各个阶段的逐步运行。考虑到此，裂殖酵母 VCP/p97 的对应蛋白 Cdc48 ，通过它的辅因子 Ufd1 的一个 SIM 基序，与 SUMO 偶合物结合 (Nie et al., 2012) 。因为 VCP 也可以与泛素结合， VCP 可能通过与 STUbL 的靶蛋白（被泛素和苏木双重修饰）的结合促进 DNA 修复。既然酿酒酵母的 Ufd1 也可结合苏木且人类的 VCP/p97 在 DSB 位点发挥作用（见前文），那么， STUbL 靶蛋白、 VCP/p97 复合体和蛋白酶体之间的联系可能在真核生物细胞中都存在。 运用于治病 致 DNA 损伤的化学疗法与辐射疗法被广泛用于癌症治疗且大多有效，它们的效果反映了它们对癌细胞造成的 DNA 损伤的致死强度。不幸的是， 由于 DNA 损伤对正常组织有损害且涉及毒理反应，这限制了治疗癌症时施加于癌细胞的 DNA 损伤的程度，因为程度不足，癌细胞内在机制经常会对这些治疗性 DNA 损伤产生耐性，或者将之修复，致使癌症复发。致 DNA 损伤药物治疗癌症的疗效，可能是因为癌细胞较大多数正常细胞增殖要快，因此会面对更大的 DNA 损伤负担，也因为它们某一 DDR 成分受损而使它们特别的依赖这一组分 (Helleday et al., 2008; Jackson and Bartek,2009) 。除了可以改善致 DNA 损伤疗法在特种癌症上疗效，对癌细胞与正常细胞 DDR 差异的研究，也为以组合致死为理论基础的癌细胞选择性消灭的疗法提供待选的靶点。组合致死概念最初是从 PARP1/2 抑制剂杀死 HR 缺陷（ BRCA1/2 突变）的肿瘤的实验阐述出来的 (Bryantet al., 2005; Farmer et al., 2005) 。对泛素化和苏木化如何影响 DDR 过程的理解的加深，可能为我们控制肿瘤提供新方案。例如，遗传导致的泛素化缺陷可致 DDR 缺陷，从这可以推测癌症演变的过程中泛素化的缺陷可能在体细胞中发生，而这就提供了新的检测靶点和可能的治疗靶点。进一步的，泛素和苏木系统的一系列蛋白，其中许多可作为天然的药物酶，这为新药物靶点的研发提供了大量的未开发资源。值得注意的是，硼替佐米（ bortezomib( 完克 Velcade) ）可以使细胞对放射治疗和致 DNA 损伤化学治疗更加敏感 (Motegi et al., 2009) ，而且近期研究揭示完克能造成多种骨髓瘤细胞（ myeloma cells ）处于 HR 受损状态，因而使细胞高敏于 PARP 抑制剂，这点也说明多种试剂组合使用可能具有潜在临床价值 (Neri et al., 2011) 。研发靶向泛素苏木系统的 DDR 特异组分的试剂可能也具有抗癌能力，其中，针对某些 DDR 事件的靶蛋白的试剂，可能比那些针对泛素蛋白酶体系统的一般性抑制剂的毒性更小。对泛素苏木与 DDR 的了解，也可能为 DNA 损伤亦或 DDR 失调所致衰老相关疾病的诊断和治疗带来更好的方案。 展望 过去的几年见证了我们对泛素和苏木偶合物调控 DNA 损伤响应的研究结果的急速积累。这一积累因我们对泛素和苏木系统的普遍认知的加深、新技术方法的涌现、以及参与这一重要领域研究的大量科技工作者而加速。除了鉴定参与 DNA 修复和相关事件的泛素和苏木系统的组分，另一未来研究的重要领域就是评判其它类泛素调节子是否或如何参与到 DDR 的。而在未来的挑战中，我们认为最重要的工作将会是清晰的阐明泛素化、苏木化和相关事件如何控制 DDR 进程。如前文所讲，某些时候，泛素和苏木除了通过单体耦合、单独形式或两者组合的方式控制 DDR 外，也可以通过不同的连接方式组成针对特殊靶蛋白的不同形式的链拓扑结构。已知的证据指出，这些不同的生物学特异作用是通过被泛素苏木修饰的蛋白被解读因子结合实现的，这些解读因子包含泛素 / 类泛素结合基序和靶向序列，因此它们可以在特异蛋白底物的情况下识别特殊的泛素 / 苏木链或链间键。泛素 / 苏木 / 类泛素密码的生化和功能多样性的程度确实是极大的，而如果将可能与这些修饰一同起作用的磷酸化和聚二磷酸腺苷核糖基化（ poly(ADP) ribosylation ）整合起来的话，其多样性程度就更大了。我们对泛素化或苏木化的认知中与 DDR 相关的其它领域还有 VCP/p97 的功能以及泛素链的编辑。鉴于其深度和广度， DDR 研究共同体可能还将发现关于泛素化和苏木化的更多的原则和实例，其中的很多也会出现于被此二物翻译后修饰控制的其它细胞活动中。 致谢 对未曾引用亦或因篇幅限制而未引之重要发现之作者深以为歉。对某，某，某，某，某，某和某之版前交流、建议亦或讨论深以为谢。杰克逊史蒂芬实验室受联合王国癌症研究（ CRUK ）项目之某号，欧洲研究协会（ European Research Council ）之某号以及欧洲共同体第七框架计划之某号之资助。核心基础设施资金由 CRUK 之某号及惠康信托之某号资助。杰克逊史蒂芬由剑桥大学支付薪水， CRUK 提供补贴。 堵罗赫丹尼尔实验室对泛素和 DNA 损伤的研究由 CIHR 之某号资助。堵罗赫丹尼尔为 D 关于 NA 损伤响应的分子遗传学加拿大研究协会（ CanadaResearch Chair ）主席（一级）也是癌症发生机理研究的季兰思托马斯主席（ Thomas KieransChair ）。杰克逊史蒂芬无利益纠纷，但他透漏他是使命治疾有限公司（ Mission TherapeuticsLtd ）的创始人及股东。 参考文献 Huen, M.S., Grant, R.,Manke, I., Minn, K., Yu, X., Yaffe, M.B., and Chen, J. 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BRCA1通过异染色质介导的沉默抑制肿瘤（CNS翻译练习）
热度 1 pkucarer4300 2011-9-13 09:00
BRCA1 通过异染色质介导的沉默抑制肿瘤 Abstract 抑癌基因 BRCA1 的变异导致乳腺和/或卵巢癌症。 这里我们显示缺失 Brca1 的小鼠去抑制串联重复卫星DNA转录。 Brca1 缺失伴随了基因组内致密 DNA 区域的减少和卫星重复序列组蛋白 H2A 泛素化的丢失。 BRCA1 在体内结合到卫星 DNA 区域并泛素化 H2A 。异位表达的H2A融合到泛素抵消了BRCA1丢失的效应，表明BRCA1通过泛素化组蛋白H2A保持了异染色质结构。卫星 DNA 去抑制现象也可以在老鼠和人类 BRCA1 缺失的乳腺癌中观察到。异位表达卫星 DNA 能够表型模拟BRCA1丢失后导致的中心体扩增，细胞周期检验点缺陷，DNA损坏和基因组不稳定。我们认为BRCA1在保持全异染色质完整的角色在其肿瘤抑制功能方面起作用。 原文摘要 BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Zhu Q, Pao GM, Huynh AM, Suh H, Tonnu N, Nederlof PM, Gage FH, Verma IM. Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, California 92037, USA. Abstract Mutations in the tumour suppressor gene BRCA1 lead to breast and/or ovarian cancer. Here we show that loss of Brca1 in mice results in transcriptional de-repression of the tandemly repeated satellite DNA. Brca1 deficiency is accompanied by a reduction of condensed DNA regions in the genome and loss of ubiquitylation of histone H2A at satellite repeats. BRCA1 binds to satellite DNA regions and ubiquitylates H2A in vivo. Ectopic expression of H2A fused to ubiquitin reverses the effects of BRCA1 loss, indicating that BRCA1 maintains heterochromatin structure via ubiquitylation of histone H2A. Satellite DNA de-repression was also observed in mouse and human BRCA1-deficient breast cancers. Ectopic expression of satellite DNA can phenocopy BRCA1 loss in centrosome amplification, cell-cycle checkpoint defects, DNA damage and genomic instability. We propose that the role of BRCA1 in maintaining global heterochromatin integrity accounts for many of its tumour suppressor functions. Nature. 2011 Sep 7;477(7363):179-84. doi: 10.1038/nature10371.
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