（新版实验方法原文见后附文） 解析韩春雨新版实验方法，其中增加了什么内容？ 2016-08-09 科研圈 收藏，稍后阅读 已收藏 2016年8月8日，韩春雨向非盈利性质粒共享信息库 Addgene 提交了其 NgAgo 技术的新版详细实验方法。同时，一项已有近200名科研人员参与的在线调查显示，目前有 9 人声称在实验中观察到 NgAgo 的基因编辑效果。科研圈对比分析了韩春雨新公开的实验细节，并对相关事件进行简要解读。 整理 赵维杰 张帅琰 吴兰 三个月前，河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文（F. Gao et al. Nature Biotechnol . 34, 768–773; 2016）。文章介绍了一种新型的基因编辑方法，迅速引起广泛关注。 然而，随着时间推移，研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。8月2日，《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。8月8日，韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法，其中补充了数项应特别注意的问题。 （新版实验方法全文，可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下载） 见后附文 。 新版实验方法具体分为细胞培养、质粒/gDNA 共转染，以及基因组提取三个部分。对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods（详见 http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information ），新实验步骤有几处改变： 1 血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。 2 增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，换液时要小心操作”的小提示。 3 建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或24小时后，补转一次 gDNA；旧版方法中只提及了“24小时”。 4 旧版方法中，溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE（5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0），而新方法中则变更为水（pH 8.0）。 最后一处缓冲液配方的改变尤其引人注意——在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中， EDTA 再次出现： 其中一条注意事项专门提到，应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入 EDTA。这四条注意事项分别是： 1 NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感，在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。 2 由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子，在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。 3 转染试剂 Lipofectamine 3000会阻碍 gDNA 进入细胞，不能用于转染。可以使用转染试剂 Lipofectamine 2000。其他转染试剂是否可用还有待验证。 4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5’端磷酸化处理，处理体系如下：（体系略）处理后的 gDNA 无需再次纯化，直接用水（pH 8.0）稀释至300 μl，终浓度10 nM。 据 Nature 报道，韩春雨近来每天都会收到很多骚扰电话和短信，但他始终坚信自己的研究成果没有问题。 Nature 将喜爱茶叶、古琴，并且从未出国的韩春雨称为“隐士”，而今这位隐士不得不走上风口浪尖，直面质疑。 据新华网消息，河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，并邀第三方证实。 为什么 NgAgo 会“不好使”？ NgAgo 之所以引起广泛关注，在于其作为基因编辑工具显现出的一些令人激动的新特性，赋予了其可观的应用潜力。例如，NgAgo 系统没有 PAM 序列依赖性，与 CRISPR 系统只能识别附近有 PAM 序列的靶点相比，NgAgo 理论上可切割的序列更多。其次，NgAgo 系统用以识别靶基因的先导物为 DNA（gDNA），与 CRISPR 使用的 gRNA 相比，易用性更强，成本更低。另外，NgAgo 系统可以作用于很难被 CRISPR 切割的 GC 富集区域。 与此同时，NgAgo 系统也表现出一些劣势。NgAgo 系统使用 5’ 端磷酸化 gDNA ，这种先导物无法从质粒里表达获得，不能在靶细胞里产生，只能在细胞外合成后输入细胞内；研究者在执行基因编辑时，可能还需要持续向细胞内补充 gDNA。并且，gDNA 只能与新生的未成熟 NgAgo 蛋白结合形成复合物。 爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 专门研究基因编辑系统的优化，他表示，NgAgo 系统的目前的可重复性难题，无疑说明了这一系统的优化工作非常困难；他同时认为，NgAgo 系统难以优化的原因，可能就包括 s' 端磷酸化后的 gDNA 在哺乳细胞中不能稳定持续存在，以及 NgAgo 蛋白无法在成熟状态下与 gDNA 形成复合物。 已有9人声称 NgAgo 有效 自韩春雨2016年3月在线发表论文后，来自全世界的科研人员共发出将近400次获取 NgAgo 质粒的请求。Pooran Dewari 面向正在重复 NgAgo 的科研人员发起了一项调查。调查发现，截至2016年8月8日，193名被调者中，各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象（indels and knock-in），100人声称无法观察到剪切，47人声称无法观察到基因插入。 （调查全部内容见链接 ： http://blog.addgene.org/google-forums-round-up-first-impressions-of-ngago ，不过需要翻墙； 后台回复 NgAgo ，可获取调查最新结果完整截图 ） 然而，调查还显示，大部分被调者仍未对 NgAgo 丧失耐心，其中66%的被调者表示会等待他人对这一系统的优化结果，10%的被调者表示会自己优化 NgAgo，24%的人表示将继续使用 CRISPR。 附：NgAgo 可重复性问题事件节点 · 2016年6月，网络上逐步有传言称，国内外有多家实验室重复不出韩春雨论文的实验结果，引起部分科学家的质疑。韩春雨在回复中表示，新系统刚出来都会“不好使”，他也认同目前 NgAgo 系统不够稳定，等2.0版本出来会找专门机构免费发放。 · 7月2日，方舟子公开质疑该实验的可重复性，NgAgo 研究可重复性问题自此规模化发酵，韩春雨也立刻进行了实验方法上的回应，称实验重复失败可能是由于支原体污染、试剂保存等问题。 · 7月28日，先前声称 NgAgo 有效的澳大利亚遗传学家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示，经进一步检测，该技术无法进行基因编辑。他表示，NgAgo 也许会奏效，但鉴于其不稳定性，它并没有 CRISPR 实用。 · 7月29日，西班牙遗传学家 Lluís Montoliu 向国际转基因技术协会 （ISTT） 的同僚群发邮件，建议“放弃所有NgAgo相关项目”。与此同时，之前声称 NgAgo 有效的印度分子生物学家 Debojyoti Chakraborty 及德国癌症研究中心的遗传学博士生 Jan Winter 也都表示先前结论有误；Jan Winter 同时表示，自己并不认可韩春雨此前做出的回应。 · 截至8月8日，爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 发起的一项针对 NgAgo 研究可重复性的线上调研已经收到近 200 位研究者的回复，其中各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象（indels and knock-in），100人声称无法观察到剪切，47人声称无法观察到基因插入。 · 据新华网消息，河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，并邀第三方证实。 内容合作请联系 keyanquan@huanqiukexue.com 。 这里是“科学美国人”中文版《环球科学》服务科研人的微信号“科研圈”。我们： · 关注科学进展与科研生态 · 推荐重要前沿研究 · 发布科研招聘 · 推送学术讲座与会议预告。 欢迎 长按二维码 关注。 附后：韩春雨新版实验方法 Ageneral protocol of NgAgo/gDNA-mediated genome editing 1. Cell culture 293T cells are maintained in high-glucose DMEM (Gibco) supplemented with10% FBS (Gibco) and p enicilli n/streptomycin at 37°Cwith 5% CO 2 incubation. When cells reach their ≈ 60% confluence, perform transfection. Before transfection, cells are changed tomedium containing 2% FBS （ heatinactivated ） . Since 293T cells are not firmly attached, begentle and do not disturb cells when changing medium. 2. Transfection 2-1 NLS-NgAgo expressing plasmid is extracted with Wizard Plus SVMinipreps DNA Purification System (Promega), and is adjusted to 100 ng/μl inwater ( pH8.0 , alkalization by NaOH). 2-2 5’ phosphorylatedssDNA guides are dissolved to 100 ng/μl in water (PH 8.0) For each well of a 24-well plate, 200-250 ngNLS-NgAgo expression plasmid and 100-300 ng guides are diluted in 50 μlOpti-MEM (Gibco); 1.25 μl Lipofectamine 2000 is diluted in 50 μlOpti-MEM. Incubate the DNA mix andlipofectamine mix for 5 min. 2-3 Combine the DNA mix and lipofectamine mix with gentle pipetting andincubate for 20 min. The DNA/lipomixture is then added into each well of cells. *Since NgAgo follows “one-guide faithful” rule, i.e. guides can only beloaded when NgAgo protein is in the process of expression, to improve theefficiency of gDNA loading to NgAgo, sometimes multiple transfection of gDNAhelps ( e.g. depending on thedifferent kinetics of NgAgo expression in different cells, a secondtransfection of gDNA can be performed 8, 12 or 24 hours after the primarytransfection) *As stated below, cells will be harvested 48-60 hours aftertransfection. 90% confluence of thecells on harvesting is ideal. Celloverplating significantly weakens the efficacy of genome editing. Taking HDR as an example, it occurs onlyduring S and G2 phases. 3. Genomic DNA extraction 3-1 48-60 hours after transfection, cells are harvested by trypsindigestion. Four wells of cells arecombined into a 1.5 ml EP tube. 3-2 For genomic DNA extraction, 500 μl of cell lysate buffer (50 mM Tris ， 100 mM EDTA ， 0.5% SDS ， pH 8) and 10 μl proteinase K (10 mg/ml ） are added into each tube and mixed gently and sufficiently. Bathe the tubes at 55 ℃ for 2 hours. 3-3 200 μl Tris-Phenol and 200 ul trichloromethane are added into eachtube and mixed gently and sufficiently. After incubation for 5 min, samples are spun at 12,000 rpm for 15 min toseparate aqueous phase from Phenol phase. 3-4 Carefully collect the aqueous phase into a clean EP tube. 3-5 Repeat the Steps 3-3 and 3-4 once and pool the aqueous phase. 3-6 Add 500 μl trichloromethane into the collected aqueous phase, mixgently and sufficiently, stay for 5 min, and then spin the sample at 12,000 rpmfor 15 min to separate aqueous phase from Phenol phase. Carefully remove theaqueous phase into a clean EP tube. 3-7 Repeat the Steps 3-6 once. 3-8 Add 900 μl EtOH to the collected aqueous phase and incubate at -20°C for 30 min. 3-9 Centrifuge the sample at 12,000 rpm for 10 min, and then the DNAsediment is washed with 500 μl 75% EtOH thrice. 3-10 Air-dry the DNA sediment, add 50 μl 0.5 x TE and then adjust thegenome DNA to 100 ng/μl for later use. Note: 1. NgAgo/gDNA system is extremely sensitive to contamination ofintracellular bacteria (including mycoplasma) which are widespread and leave novisible signs of presence. Carefully excluding the presence of intracellularbacteria before performing experiments. 2. Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cellsinto the plates for transfection. Alternatively,supplementing Mg 2+ to 5 mM(may need optimization to your cell type). 3. Avoid using Lipofectamine 3000 since thesupplement P3000 interferes with ssDNA transfection. Lipofectamine 2000 is agood choice. Other transfection methods such as electroporation are yet to betested. 4. Ideally, 5' phosporylation ofssDNA guide by using T4 PNK (Biolab): T4 PNK 2 μl T4 ligase buffer (containing ATP): 12 μl 1OD ssDNA (about 33 μg) in H 2 O: 100 μl (alternatively) additional ATP (25 mM) 2μl Add H 2 O to a final volume of 120 μl Incubate at 37 ℃ overnight After 5' phosphorylation, the resultant ssDNA needs no purification,dilute by water (PH8) to 300 μl with a final concentration of 10 nM or 100ng/μl)
诺贝尔有价吗？那得看礼送多大，这事儿Power Media说了算！ 北大燕南园餐厅二楼就餐区墙壁上挂了十多幅诺贝尔获奖者宣传板，大标题是“百年诺贝尔奖”，看来是为了弘扬科学精神，但是底图上的英文却背道而驰，写成了“Nobel Price - The Gift For The World”。 诺贝尔奖（Nobel Prize）变成了“诺贝尔价格（Nobel Price）”，配上“送给世界的礼物”，意思倒也连贯：诺贝尔的价格 - 给全世界送礼，国人心知肚明，可以会心一笑，不知道经常到此就餐的外国留学生怎么看？ 宣传板没忘记注明出品单位：动力传媒，英文名：Power Media。好在工商局不核英文名字，否则这么强势的名字可不容易批下来。
每年的春季，轮到我开“生物医学成像”这门课，第一节课总不免先讲讲生物医学成像的历史。 公认的标志着医学成像开端的事件，是那张著名的伦琴夫人带着结婚戒指的手的 X 光片，该片摄于 1895 年 12 月 22 日，伦琴也因此成为 1901 年诺贝尔物理学奖的得主，这也是史上第一个诺贝尔奖。伦琴生前任教于德国的维尔茨堡大学，那里的物理系至今还陈列着他的发明。有趣的是，当年伦琴为了赴斯德哥尔摩领奖，必须先得到校方的批准，才能去申请签证，如今，这封申请信也成了永久陈列的一部分。有次维尔茨堡大学的同行来讲学，专门把伦琴写的申请信做了一张幻灯片给我们看，伦琴的语气谦恭之至，似乎在极力说服校方： It is a very prestigious award. 伦琴和伦琴夫人的手 我每次讲完伦琴的故事，还会把历史再往前推 200 多年，讲讲荷兰科学家列文虎克的故事。列文虎克自幼丧父，没受过什么正规教育，但他有一大爱好，就是磨透镜，而且手艺一流，无人能与之比肩。他用自己磨出来的透镜做了一台显微镜，这台单镜头的显微镜用现在的标准看简直太简陋了，但放大倍数却有 200 倍之多。有了这台显微镜后，列文虎克可有事儿干了，他把能搜集到的各种标本，从动植物到矿石污水，挨着个儿放在显微镜底下给看了个遍。在那个没有数码相机、没有电脑的年代里，他一笔一笔地把在显微镜下观察到的现象仔仔细细地画了出来，寄给伦敦的皇家学会。显微镜为列文虎克打开了看自然的新窗口，他也因此当之无愧地成了“微生物学之父”。然而当荣誉降临的时候，这位手艺人却说： . . . my work, which I've done for a long time, was not pursued in order to gain the praise I now enjoy, but chiefly from a craving after knowledge, which I notice resides in me more than in most other men. And therewithal, whenever I found out anything remarkable, I have thought it my duty to put down my discovery on paper, so that all ingenious people might be informed thereof. 第一次读到这个故事时，我觉得这位能耐着性子磨出剔透的镜头、然后又拿着它看东看西的列文虎克老师太可爱了！再看他的观察记录，笔触之精美，细节之丰富，简直就像是件艺术品，令人叹为观止。 列文虎克——列氏显微镜——列老师手绘白腊树剖面图 无独有偶，到了现代，一位英国的科学家—— 2002 年诺贝尔医学奖得主 —— 约翰 •萨 尔斯顿 ， 在显微镜下面详细跟踪了线虫从胚胎到成虫的全部发育过程，不厌其烦地记录下了线虫的每一个细胞的分裂与分化过程，从而确定了 细胞 凋亡在生物 正常 发育中的重要地位。萨 尔斯顿 在他的 The Common Thread: A Story of Science, Politics, Ethics and the Human Genome 一书中详细讲述了他发现细胞凋亡的整个过程，其间充满了对细节的关注和发现的乐趣。 萨尔斯顿——萨老师的书——他的观察记录 生物学家如此，物理学家也如是。 记得大学时学电磁学，主讲老师姓孙，我们背地里管他叫孙悟空，因为他总是像变戏法似地在黑板上推那些无比繁复的电磁学公式。那些公式我基本上已经一个不拉地还给孙老师了，但他给我们讲的法拉第的故事我却一直记着。他说法拉第总是一丝不苟地记录下所有的实验现象，往往还在一天之末写上一句总结性的话，于是法拉第的实验簿上就经常出现这样的话： 今天——没有结果！ 今天——没有结果！ …… 今天—— Eureka ！！！ 法拉第和他的实验室 实验物理学家如此，那么对物理理论做出了巨大贡献、被称为给人类带来了“上帝之光”的牛顿呢？ 我有一位学物理的学长，曾经揣着三封介绍信跑到纽约的公立图书馆，带着一幅白手套翻阅了收藏在那里的牛顿手稿。他后来告诉我们说，牛顿的手稿里有许多稀奇古怪的实验，记录也是无比的详细，而且字迹非常工整。 牛顿和牛顿手稿 我不知道西方这种观察与记录的传统的源头在哪里，但似乎从出身于农庄的达芬奇，修道院里的孟德尔，美国开国的国父们，到至今仍坚守着彻夜灯火通明的实验室的人们，一代复一代，总有那么一批人在认认真真地观察，不厌其详地记录。这些观察和记录如一滴滴的小水珠，汇成了人类探索认识自然的大江大河。许多人的工作在这大江大河中消失得无影无踪，这些人一辈子既无名也无利。然而有那么几个长了天眼的人，从水珠折射的阳光中看到了自然的美与律，于是便有了令人赞叹不已的简洁、对称、典雅的理论，以及由此衍生出来的技术与发明，它们那样深刻地改变甚至颠覆了我们的生活。 相比之下，当科学被我们当作济世救国的良方请进来的时候，我们似乎更看重它结出的果实而忽视了这棵根深蒂固的大树本身了。我们从中学的基础课程到大学的精英教育，都有着重理论轻实验的传统，而且，在考试这根指挥棒下，题海无边，连理论的学习也越来越变成对钻牛角尖式的解题技巧的掌握了。 我并不反对打下扎实的理论基础，尤其是看到一些美国学生因为数学基础薄弱而无法入门时。然而，如果对理论的重视是以轻视实验为代价的话，则未免有些本末倒置了。遗憾的是，在相当一部分中国学生身上可以看到这种对实验的轻视，表征之一是认为重复性的实验枯燥，技术含量低，应该由技术员来做，他们只需负责分析数据就行了。殊不知，许多实验你如果不亲自去做的话，便失去了在第一线观察原始数据和细节的机会。这种对实验的偏见造成的直接后果，就是实验记录的马虎与潦草。因为对这样的学生来说，做实验就是一个“等”的过程，而不是一个“观察”的过程，加上如今又有了互联网，等的过程也可以不那么枯燥了。如此，每次实验下来，实验记录空空如也便也不足为奇了。 希腊神话里有这么个故事：建造了克利特岛迷宫的能工 巧匠狄德勒斯， 和儿子 伊卡洛斯 一起 被囚禁在 了 孤岛上。狄德勒斯利用岛上的蜡烛，制作了两副精巧的羽翅， 想 藉此逃离囚禁的命运。 然而当 伊卡洛斯 尝到了飞翔的快乐，越飞越高，向太阳飞去时，太阳的温度把翅膀给融化了。 我觉得，扎实的数理基础能给人插上一对飞翔的翅膀，助一个人飞得更高更远。只是不要忘了，所有这些令人痴迷的美妙理论，都是由前人从繁复的自然现象中抽丝剥茧般地萃取提炼出来的。忘掉了这一点而轻视实验，理论的翅膀也就如同腊制一般了。 去年我曾介绍过“科学”杂志上一篇名为“发现的算法”的文章，文章的作者是这样看待实验的： Time spent refining methods and design is almost always rewarded. Rigorous attention to such details helps to avert the premature rejection or acceptance of hypotheses. Sometimes, in the process of perfecting one's approach, unexpected discoveries can be made. …… Meticulous testing is a key to generating the kind of reliable information that can lead to new breakthroughs. 的确，见微方能知著，细节中蕴藏着发现的契机。 科学如此，艺术又何尝不是这样。远的不说，单说科学网上的李学宽、吴飞鹏、苏德辰、陈湘明等大腕儿（出处：张玉秀老师，“ 哇，这儿，这儿太美了吧？ ”，我再加上一个——孟津老师），他们那些看了让人心动的摄影作品，许多都是因为捕捉到了常人视而不见的细节。再看他们论及专业与科研的文章，也往往因其新颖独到的视角，或引人深思，或让人感觉耳目一新。察别人所未察，思他人所不思，是这几位老师们的共同特点。 所以说，关注细节， pay attention to the details ！这句话，是无论怎么强调都不为过的。英语中有句谚语： T he devil is in the details . 依我看，还应该再加上半句， so is the beauty . 而关注细节的第一步，就是仔仔细细地观察，一丝不苟地记录。 相关文章： 发现的算法
建设世界一流大学，永远都是热门的话题。笔者在此不谈诸如师资，大楼等大问题，仅就几个细节做一些探讨。 第一个细节就要从不起眼的邮箱说起，据我观察，国内很多高校尤其是一些省属高校到目前还没有配发学校的专业邮箱。看一些科研论文的时候，也经常看到联系人的邮箱是126，163等商业邮箱，让我感觉十分的不专业。其实，学校邮箱和学校电脑的网络管理是十分重要的，也是提高学校知名度的一个很好的机会和途径。我认为，不管是学校的职员还是学生，都应该统一配置邮箱账号，工作和学习邮件应该通过此类邮箱进行沟通。尤其是和政府部门和企业进行沟通的时候，整齐一致的邮箱后缀会提升一个大学的整体感和自豪感。可是遗憾的是，很多国内大学没有这样的学校邮箱，还有很多就是有但使用起来不够方便和顺手。 第二个细节就要谈一下学校的公文和课件。在许多国内大学的lecture和国内的学术会议中，经常发现来自一所大学甚至一个院系的教授或者研究生PPT的模版千奇百怪，什么样子的都有。但是，反观西方国家尤其是欧美高校老师的PPT，一般都有统一的模版。上面一般都有大学的logo和标识，让人感觉十分的专业，更重要的是体现的一所大学的自豪感和整体感。更为重要的是，这也明确了作者单位和知识产权的归属。尤其在国际重要会议上，一个好的大学模版体现了大学的文化，也很好的宣传了大学。我的荷兰导师每次在检查我的presentation的时候，总是念念不忘的把大学的logo贴上去，我有一次忘记了，甚至他还说：I am very pround of that (指大学的logo), do you think so? 第三个细节就是大学的开放日。在欧美的很多大学，每年都会有几个日子固定。开放给pubilic，让周围的孩子和家长任意参观校园，聆听每个院系导师的介绍。这样做的好处非常多，其他不必多言，最起码省去了很多国内学生转专业的烦恼。在上大学之前先看看自己心仪学校的校园，自己心仪专业的介绍和实验室，是多么有必要啊，这省去了很多资源的浪费和折腾。 其实，上面说的几个细节，我们都不难做到，但是做好，做精细不容易。其实，建设世界一流大学，细节决定成败。撇去好高骛远，扎扎实实的干活，即使我们基础不好，但一样可以迎头赶上。敢问路在何方？路在脚下
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