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生物3D打印带介观孔隙结构的大尺寸体外组织
heyongzju 2020-2-4 11:48
生物3D打印带介观孔隙结构的大尺寸体外组织 【背景】水凝胶固有的致密微观孔隙网络，营养 / 氧气供应能力有限，需额外引入营养输送网络以提高营养输送效率，满足细胞生长发育的需求。目前常见的带宏观孔隙的水凝胶结构打印，即宏观孔隙网络（ ≥1mm ）结构打印，由于水凝胶强度比较低，打印大孔隙结构时宏观多孔结构易坍塌，导致大尺寸组织打印后内部营养不良。本研究中，我们继续推进大尺寸组织的体外构建，提出在水凝胶材料内构造介观尺度孔隙概念，孔隙范围 100 μm-1 mm ，介观孔隙可同时发挥营养 / 氧气供应和强度支撑作用，能兼顾生物性能和可打印性的要求（图 1 ）。 图 1 A) 多尺度孔隙在组织工程中的功能 B) 目前采用的致密水凝胶网络用于结构支撑；期望的是兼顾结构支撑和营养输送的介观尺度孔隙网络 我们设计了载牺牲微明胶生物墨水，实现了介观孔隙网络活性结构的高效打印。结构具有高保真度的同时，保持了较高的生物活性，细胞可在介观孔隙网络结构内发生类体内生长行为，如伸展、迁移、连接及组织新生等。 载牺牲微明胶生物墨水具体制备过程分三步（图 2 ）， i) 将明胶溶液通过低温冷却完全凝胶化； ii) 通过打印用的喷头，将低温凝胶化的明胶平稳匀速的挤碎成微明胶颗粒，挤碎的同时直接挤至载有相应细胞的 GelMA 生物墨水，随后混合均匀； iii) 将载有牺牲微明胶和细胞的 GelMA 生物墨水装入打印用的注射器，并冷却成可打印的预凝胶化生物墨水。值得注意的是，在冷却制备可打印的预凝胶化生物墨水过程中，装墨水的注射器要每隔 20 秒翻转一次，以确保细胞和牺牲微明胶混合均匀。 图 2 载微明胶 GelMA 预凝胶化生物墨水制备过程 利用载牺牲微明胶生物墨水，可实现介孔营养网络结构打印（图 3 ）。 图 3 打印的介观孔隙网络结构 通过调整不同挤出喷头制备不同尺寸的微明胶，可以实现具有不同尺寸孔隙结构的打印。此外，调整预凝胶生物墨水中的微明胶比例，可以实现不同孔隙率结构打印。（图 4 ） 图 4 不同孔隙尺寸，不同孔隙率结构的打印 此外，由于牺牲微明胶和 GelMA 相互协同工作，增强了整个生物墨水体系的可打印性，能够容易的实现复杂结构的打印，图 5,6 所示。 图 5 二维复杂介观孔隙网络结构打印 图 6 三维复杂介观孔隙网络结构打印 为了模拟生物体内细胞或细胞外基质组成多样性，我们还模拟制造了多细胞或多材料组织结构。如图 7 所示，采用多合一喷头装置，可以切换多种载细胞材料进行打印。打印时，选择性的通入目标载细胞材料，可以打印出多组分介观孔隙网络结构。 图 7 多组分介观孔隙网络结构打印 为了验证介观孔隙网络能有效的传输营养 / 氧气，促进细胞存活及组织的再生，我们打印了载细胞的介观孔隙网络结构 (10 mm × 10 mm × 10 mm) ，并观察结构体内的细胞生长状况，如图 8 所示，细胞在介观孔隙网络结构内逐渐伸展、迁移并连接，验证了介观孔隙网络传输营养 / 氧气的有效性。 图 4.23 细胞在多孔结构内自由伸展、迁移、连接形成活性组织结构体 利用载牺牲微明胶生物墨水，直接打印高生物活性介观孔隙网络结构，能有效的促进细胞存活及活性组织形成。牺牲微凝胶可通过自适应的制造方式制备，微凝胶尺寸高度可控，打印时不会堵塞喷头，同时打印结构的孔隙尺寸、孔隙率等均可控。同时，由于牺牲微凝胶与载细胞墨水协同相互作用，增强了整个墨水体系的可打印性，利于结构的高效打印。此外，我们设计的多合一喷头用于打印多材料异质结构，使复杂异质组织结构的制造成为可能。 相关论文“ Sacrificial microgel‑laden bioink‑enabled 3D bioprinting of mesoscale pore networks” 近日刊登在 Bio-Design and Manufacturing 杂志上。第一作者为邵磊博士生，通讯作者为贺永教授，浙二医院的刘震杰医生，高庆博士为共同通讯。 论文链接： https://doi.org/10.1007/s42242-020-00062-y
个人分类: 论文|3260 次阅读|0 个评论
凡是过往，皆为序章，2020 乘风破浪！！
heyongzju 2019-12-31 22:31
凡是过往，皆为序章，2020，乘风破浪！！ EFLers, 加油！
个人分类: 科研乱侃|2652 次阅读|0 个评论
生物3D打印课题组(EFL团队)2019年度回顾
heyongzju 2019-12-29 16:45
生物3D打印课题组(EFL团队)2019年度回顾 忙碌的日子总是过的很快，2019年EFL（Engineering for Life）团队是一个内强素质，外塑形象的关键节点。这几年围绕生物3D打印，我们在打印工艺、打印装备、生物墨水耗材等经历了多次迭代，对生物3D打印的理解也越来越深，今年围绕体外疾病模型的高效构建、类器官的打印、大尺寸组织的体外重建等层面取得了显著进步。在基础研究层面，今年我们在高水平期刊上发表了系列文章，阐述我们对生物3D打印的理解，有幸其中的两篇被选为了封面文章。在成果转化方面，EFL团队的产业化公司已初见规模，后续发展思路也逐步清晰。团队所提供的生物3D打印解决方案已在为国内外近300个课题组的高水平科研提供支持。 回首2019年，最想说的一个词就是感恩，感谢浙江大学及机械工程学院提供了包容而自由的工作环境，感谢各位师长、同事，感谢众多的朋友，感谢木渎镇、吴中区、苏州市，感谢吴中科创园及苏州智能制造研究院，没有各级领导及朋友一直以来的关心与支持，我们走不到今天。EFL团队在你们的关注下成长，我们也一定会秉承浙大的求是作风，脚踏实地，一步一个台阶的走好。 感谢团队各位同学的辛苦工作，感谢产业化公司的各位同事，EFL所取得的点滴进步都是你们拼命干出来的，你们用实际行动诠释了不忘初心，为你们点赞！ 一、基础研究 1. Materials Horizons （IF=14.356） 封面，全水凝胶器官芯片制造新方法 一句话概括 ：在水凝胶上首次构建了完整的血供循环系统（动脉-毛细血管-静脉），证明毛细血管也是可以体外构建的。 论文信息 ： Nie J, Gao Q, Xie C, et al. Construction of multi-scale vascular chips and modelling of the interaction between tumours and blood vessels . Materials Horizons, 2020. 2. Advanced Healthcare Materials （IF=6.27）封面，载细胞微丝/纤维状类器官，何时成为临床产品？ 一句话概括 ：证明了载细胞水凝胶微丝能发育为功能化组织、能快速批量稳定制造、还能像细胞一样被冻存，很有希望成为微组织银行中的批量存储单元，具备后续临床化潜力。 论文信息： Shao L, Gao Q, Xie C, et al. Bioprinting of Cell‐\Laden Microfiber: Can It Become a Standard Product? . Advanced healthcare materials, 2019, 8(9): 1900014. 3. Biofabrication （IF=7.236），高生物活性水凝胶GelMA复杂支架打印 一句话概括：以GelMA生物水凝胶为生物墨水，定义了生物材料可打印性研究规范，解决了GelMA水凝胶复杂结构的高效打印。 论文信息： Gao Q, Niu X, Shao L, et al. 3D printing of complex GelMA-based scaffolds with nanoclay . Biofabrication, 2019, 11(3): 035006 . 4. ACS Applied Materials Interfaces (IF=8.1) 通用的3D 打印多材料高弹性硅胶方法 一句话概括 ：给出了硅胶及PDMS类软材料一种通用3D打印解决方案，可实现各种硅胶的高效、高质打印而不改变原有的力学性能，建立了打印的理论模型，系统地分析了硅胶类高弹性体的可打印性，首次实现了2000%高弹硅胶的打印。 论文信息 ： Zhou L, Gao Q, Fu J, et al. Multi-Material 3D Printing of Highly Stretchable Silicone Elastomer . ACS applied materials interfaces, 2019. 5. Materials Design （IF=5.77），3D打印超高精度生物支架调控细胞生长 一句话概括 ：可打印从20微米到3微米线宽的生物支架，实现在同一个支架上不同区域有不同的力学性能，揭示细胞还可以像植物攀爬架子式的生长。 论文信息 ： Xie C, Gao Q, Wang P, et al. Structure-induced cell growth by 3D printing of heterogeneous scaffolds with ultrafine fibers . Materials Design, 2019, 181: 108092. 6. Materials Science and Engineering: C （IF=4.959），多尺度3D打印高生物相容性及力学强度兼具的组织工程支架 一句话概括 ：打印多级支架结构，超细支架（3微米丝径）提升支架的生物兼容性、常规尺寸支架（100微米丝径）提供足够的强度。 论文信息 ： Gao Q, Xie C, Wang P, et al. 3D printed multi-scale scaffolds with ultrafine fibers for providing excellent biocompatibility . Materials Science and Engineering: C, 2020, 107: 110269. 7. Advanced Functional Materials （IF=15.621），液态金属-硅胶墨水实现柔性电子的全打印制造 一句话概括 ：提出了一种独特的液态金属-硅胶墨水和相应的多材料3D打印工艺用以制造全打印的液态金属基柔性电子设备。 论文信息 ： Zhou L, Fu J, Gao Q, et al. All ‐\ Printed Flexible and Stretchable Electronics with Pressing or Freezing Activatable Liquid ‐\ Metal – Silicone Inks . Advanced Functional Materials, 2019. 8. Biofabrication （IF=7.236）， 柔性线框模具实现微纳结构的无损伤脱模/高精度3D打印助力水凝胶类生物材料微纳结构精准制造 一句话概括 ：针对生物脆性材料如生物水凝胶，发展了全新的无损脱模思路，可实现微纳结构的低成本、高质量制造，适用于非硅材料的微加工。 论文信息 ： Lv S, Nie J, Gao Q, et al. Micro /nanofabrication of brittle hydrogels using 3D printed soft ultrafine fiber molds for damage-free demolding . Biofabrication, 2019. 9. Biomaterials Science （IF=5.251）， 生物3D打印带纤维GelMA微球：三维共培养新思路 一句话概括 ：微球中集成微丝，大幅提升生物3D打印多细胞类器官结构的能力。 论文信息 ： Xie M, Gao Q, Qiu J, et al. 3D biofabrication of microfiber-laden minispheroids: a facile 3D cell co-culturing system . Biomaterials science, 2020. 10. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences （IF=4.016），邀请综述， 生物3D打印进展综述：从打印方法到生物医学应用 一句话概括 ：我们认为后续广泛应用的三个生物3D打印技术是投影式光固化打印、悬浮支撑打印及同轴打印，生物墨水的要点是在可打印性、生物相容性和机械性能三者中找到平衡。 论文信息 ： Gu Z, Fu J, Lin H, et al. Development of 3D Bioprinting: From Printing Methods to Biomedical Applications . Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2019. 11. Advanced Healthcare Materials （IF=6.27），带营养输送网络同步生物3D打印方法 一句话概括 ：提出共轴生物3D打印，解决直接打印大尺寸多孔载细胞支架易坍塌问题。 论文信息 ： Shao L, Gao Q, Xie C, et al. Synchronous 3D Bioprinting of Large ‐\ Scale Cell ‐\ Laden Constructs with Nutrient Networks . Advanced Healthcare Materials, 2019. 二、生物3D打印科普 12. 在Bio-Design and Manufacturing开始专栏，系统介绍生物3D打印的各个内容 一句话概括 ：推进生物3D打印的普及，我辈责无旁贷，以科普拉近生物3D打印与普通研究人员的距离。 敬请关注 Bio-Design and Manufacturing 杂志Why choose 3D bioprinting?系列文章，创刊不到两年的SCI检索杂志BDM欢迎再生医学领域的优质稿源。 Why choose 3D bioprinting? Part I: a brief introduction of 3D bioprinting for the beginners .Bio-Design and Manufacturing ， 2019 13. 应邀撰写了一篇GelMA水凝胶生物3D打印的Protocol，带视频，系统介绍微球、微丝、复杂支架等的制造工艺 GelMA 生物 3D 打印的 视频教程论文： Xie, M., Yu, K., Sun, Y., Shao, L., Nie, J., Gao, Q., Qiu, J., Fu, J., Chen, Z., He, Y. Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks. J. Vis. Exp. (154), e60545, doi:10.3791/60545 (2019). 视频地址： https://www.bilibili.com/video/av80697900/ 14. 录制了一门3D打印的MOOC课程，对3D打印感兴趣的朋友可选不同主题看看。 题目：“3D打印：从原理到创新应用”，在大学MOOC及智慧树平台上都有 三、生物3D打印产业转化 15. 产业化三款针对不同场景的生物3D打印机，得到了众多朋友的认可；EFL-GM系列光固化GelMA水凝胶家族也日益壮大，可模拟不同软组织硬度、不同软组织成分；还有光固化透明质酸、葡聚糖、自带荧光的水凝胶等衍生产品。 EFL(Engineering for Life) 公众号，欢迎关注
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体外大尺寸组织重建的同步生物3D打印方法
heyongzju 2019-12-26 20:00
体外大尺寸组织重建的同步生物3D打印方法 78 Synchronous 3D Bioprinting of Large‐\Scale Cell‐\Laden Constructs with Nutr.pdf 【背景】组织 / 器官内的血供系统，为组织提供了必须的营养及代谢交换。而组织体外重建时当尺寸 200μm ，就会超出营养 / 氧气的扩散极限，需要构造营养网络，避免内部营养输送不畅。目前体外重建最常见的思路是直接打印载细胞多孔结构（从以前的多孔支架打印发展过来），然而由于水凝胶强度弱，导致多孔结构易坍塌，尤其当尺度突破到 cm 量级时，内部多孔结构很难有效保持（图 1A ）。 为了在大尺寸组织中构造出有效的营养输送网络，我们提出了同步打印策略：即打印单元是一半是载细胞墨水一半是牺牲墨水的水凝胶丝，打印时牺牲单元也能起到支撑，避免打印时的坍塌，待牺牲墨水去除后，即可获得高质量流道网络（图1B）。据此我们实现了超过1cm尺寸活性结构的制造，结构具有高保真度的同时，保持了完整有效的流道网络，促进了细胞在大尺寸结构内发生类体内生长行为，如伸展、迁移、连接及组织新生等。 图 1 A) 直接打印载细胞多孔支架及存在的问题 B) 我们设想的载细胞墨水与牺牲墨水同步打印策略及相应的优势 对于同步打印策略，载细胞墨水和牺牲墨水的选择至关重要 。由于 GelMA 是 Gelatin 的改性物，生物 / 理化性能上有诸多相似性。因此，借助于 Gelatin 和 GelMA 共同的可逆温敏交联特性及 GelMA 的永久光交联特性，以及它们优越的生物性能， GelMA/Gelatin 是作为载细胞材料 / 牺牲材料完美的同步打印材料组合。 为了实现同步打印 GelMA/Gelatin ，制造含有流道网络的结构， 我们设计了二合一喷头，基于二合一喷头的营养流道同步打印策略分三步 ，如图 2 所示。第一步：将预凝胶化的明胶和 GelMA 分别通入二合一喷头，挤出一半明胶一半 GelMA 的丝，制造冷凝化临时三维结构；第二步：将临时结构置于蓝光下，永久光交联固化 GelMA ，定型结构。第三步：将打印结构放置在摇床上， 37℃ 环境下动态培养，随之明胶溶解，流道网络形成，如图 3 所示。由于打印过程使用的是预凝胶化墨水，因此同步打印策略可以打印低浓度墨水，使制备的结构具有更高的孔隙率，更利于细胞的生长。 图 2 营养流道网络同步打印策略原理 图 3 同步打印流道网络结构实物图 通过调整不同的明胶和 GelMA 流量配比，可制备不同尺寸的流道网络结构，如图 4 所示。 图 4 控制不同明胶和 GelMA 流量配比，制备不同尺寸的流道网络结构 此外，同步打印策略中，由于载细胞墨水和牺牲墨水相互协同作用，相互增强了各自的可打印性，能够容易的实现复杂结构的打印。同时，由于实体结构的自支撑效应，可打印具有较高保证度的三维复杂结构，且在结构内的流道网络保持的较好。如图 5,6 所示。 图 5 二维复杂营养流道网络结构打印 图 6 三维复杂营养流道网络结构打印 为了模拟生物体内细胞或细胞外基质组成多样性，我们还模拟制造了多细胞或多材料组织结构。如图 7 ， 8 所示，采用多合一喷头装置，可以切换多种载细胞材料与牺牲材料进行同步打印。打印时，选择性的通入目标载细胞材料，同时通入牺牲材料，可以打印出含有流道网络的多组分组织结构体。 图 7 多组分流道网络结构打印原理 图 8 多组分三维营养流道网络结构 为了验证营养流道网络的有效性，能促进大尺寸组织结构的功能化，我们打印了含流道网络的大尺寸载细胞结构体 (10 mm × 10 mm × 10 mm) ，并观察结构体内的细胞生长状况，如图 9,10 所示，细胞在流道网络结构内逐渐伸展、迁移并连接，验证了流道网络的传输营养 / 氧气的有效性。 图 9 培养第 7 天时，成骨细胞在流道网络结构内逐渐伸展并连接 图 10 培养第 7 天时，内皮细胞在流道网络结构内逐渐伸展并连接 同步生物打印策略简单实用有效，促进了细胞的存活、伸展、迁移、连接及组织的新生等一系列类体内细胞生长行为。同时，载细胞墨水和牺牲墨水相互协同作用，增强了各自的打印性能，使得复杂结构的制造更加容易。而且， 采用多合一喷头，可实现含流道网络的多组分结构的打印，使得多细胞或多细胞外基质的组织结构制造成为可能。此外，这种同步打印策略可以扩展至其他生物性能更优越的材料，如F127/胶原蛋白，F127/基质胶等 。 相关论文“ Synchronous 3D Bioprinting of Large-Scale Cell-Laden Constructs with Nutrient Networks” 近日发表在 Advanced Healthcare Materials 杂志上。第一作者为邵磊博士生，通讯作者为贺永教授，浙二医院的项美香教授，高庆博士为共同通讯作者。 论文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adhm.201901142
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甲基丙烯酸酐化明胶GelMA生物3D打印操作教程Protocol of 3D bioprinting
heyongzju 2019-12-26 12:17
甲基丙烯酸酐化明胶GelMA生物3D打印Protocol 77 jove-protocol-60545-protocols-3d-bioprinting-gelatin-methacryloyl-hydrogel-based(1).pdf 摘要：甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)已成为生物3D打印领域的一种常用生物墨水。为了提升科研人员的生物3D打印效率，EFL团队总结了我们实验室各种GelMA打印的Protocol，其中包括GelMA微球、GelMA纤维、GelMA复杂三维结构和GelMA凝胶基微流控芯片的制备。 甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA) 已成为生物3D打印中最通用的材料，GelMA最初由Van Den Bulkke等人于2000年提出。这种材料的来源是明胶（由哺乳动物的胶原蛋白水解而成）。因此， 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列和基质金属蛋白酶（MMP）的靶序列保留在分子链上，有助于实现细胞的黏附和材料的降解 。此外， GelMA 具有良好的成形性能，EFL-GM系列GelMA在可见光照下3-5s快速固化成胶 。EFL团队近日受邀发表文章，总结了我们实验室的各种GelMA打印方法及流程，其中包括GelMA微球、GelMA纤维、GelMA复杂三维结构和GelMA凝胶基微流控芯片的制备。利用EFL-BP5800的微纳尺度打印机，可灵活方便的打印GelMA微球。利用EFL-BP6600系列+同轴打印模块，GelMA纤维在粘性海藻酸钠的辅助下也可高效制造。利用EFL-BP8600生物3D打印机可批量打印复杂的水凝胶三维结构。此外，将凝胶水凝胶与传统的微流控芯片相结合，通过二次交联的方法可构建基于GelMA凝胶的生物微流控芯片。 论文题为“ Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks ”在实验视频期刊《Journal of Visualized Experiments (JOVE)》发表，谢明君博士生为一作，贺永教授为通讯作者。为了更好的普及各类GelMA结构的制造，EFL团队也一并录制了相关视频。视频中GelMA微球制备由谢明君博士演示操作，GelMA纤维制备由邵磊博士演示操作、GelMA复杂三维结构制备由喻康博士及孙元博士演示操作，GelMA凝胶基微流控芯片制备由聂晶博士演示操作。 https://www.bilibili.com/video/av80697900/ 一、GelMA微球的制备 在制备凝胶微球的过程中，利用外加电场力将GelMA液滴分散。液滴落入接收的硅油中时可保持标准的球形，没有拖尾。这是因为凝胶滴属于水相，而硅油属于油相。在两相之间形成的表面张力使凝胶滴保持标准的球体形状。对于载细胞微球，从染色的乳腺癌细胞（MDA-MB-231s）细胞的形态（图1）可以发现，包裹的乳腺癌细胞保持良好的伸展能力，验证了这种电辅助制备方法的生物相容性。 图1 GelMA微球的制备(EFL-BP5800微纳尺度打印机打印) 二、GelMA纤维的制备 在GelMA纤维制备过程中，GelMA和海藻酸钠溶液分别在同轴喷嘴的内外喷嘴中流动。由于海藻酸钠比GelMA具有更高的粘度，GelMA在海藻酸钠溶液中的流动受到限制并保持线形。在光照（405 nm波长）条件下，内部GelMA交联并形成GelMA纤维（图2）。骨髓间充质干细胞（BMSCs）被包裹在GelMA纤维中，可以看到，包封的BMSCs在制备过程后保持着良好的伸展能力。 图2 GelMA纤维的制备（EFL-BP6600系列+同轴打印模块） 三、GelMA复杂三维结构的制备 DLP 打印机以其更高的精度被广泛应用于3D打印领域。EFL团队将DLP打印机用于构建形状更为复杂的GelMA三维结构（图3），通过计算机辅助设计软件构建“鼻子”、“耳朵”和“多室”的三维结构模型，并将其导入DLP打印软件中，构建各类具有复杂形状的GelMA结构。在构建的GelMA结构的表面上接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs），可发现附着在凝胶材料上的细胞铺展。这表明，利用DLP打印机建立具有复杂形状的GelMA三维结构在生物医学领域具有巨大的应用潜力。 图3 GelMA复杂三维结构的制备（EFL-BP8600生物3D打印机制备） 四、GelMA凝胶基微流控芯片的制备 传统的微流控芯片是基于不具有生物降解性能的材料（即树脂、玻璃、聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA））构建的。EFL团队提出基于二次交联策略的GelMA凝胶基微流控芯片（图4）。生物墨水中的两个组分（GelMA和明胶）相继交联，通过按需设计的不同模具制造出具有各种微通道的芯片。同样的，在构建的流道内表面接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs），可发现细胞可流入通道并附着在内流道壁上，形成宏观血管形状。 图4 GelMA凝胶基微流控芯片的制备 论文链接： https://www.jove.com/video/60545/protocols-3d-bioprinting-gelatin-methacryloyl-hydrogel-based
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生物3D打印进展综述：从打印方法到生物医学应用
heyongzju 2019-12-20 23:29
生物3D打印进展综述：从打印方法到生物医学应用 摘要： 在过去的几十年中，生物3D打印已被广泛地应用于构建如皮肤、血管、心脏等诸多组织/器官原型，，这不仅为器官替换的宏伟目标奠定基础，也可作为体外病理模型服务于药物筛选、器官发育及病变等领域。考虑到器官/组织有复杂的结构，种类繁多的生物3D打印方法被开发出来用以针对不同的应用场景。 如何根据应用需求来选择合适的生物打印方法？ 本综述中我们系统地回顾了生物3D打印的发展、工艺流程和分类，重点介绍了打印的基本原理和商业化的生物打印设备；对挤出式、液滴式和光固化式生物3D打印进行了总结和分类，并对其应用提出了建议；我们认为未来比较会广泛应用的三个生物3D打印技术是投影式光固化打印、悬浮支撑打印及同轴打印；而设计生物墨水的要点是在可打印性、生物相容性和机械性能三者中找到平衡点。 相关综述以题为“Development of 3D Bioprinting: From Printing Methods to Biomedical Applications”被Asian Journal of Pharmaceutical Sciences在线刊登，顾则明博士生为一作，贺永教授为通讯作者。 https://doi.org/10.1016/j.ajps.2019.11.003 我们认为： 生物3D打印技术仍有着很大的进步空间 。 组织/器官的复杂程度给精确的生物打印带来了很大的困难，为解决这一问题，多尺寸、多材料、多细胞的生物打印将成为未来发展的重点。与天然组织/器官相比，生物打印的精度较低，这是目前生物打印技术的主要缺点之一。而另一个常见缺点是大尺寸复杂结构的打印速度慢，特别是涉及到多材料交替打印。此外，作为生物3D打印关键应用的体外组织模型不仅在尺寸上需要标准化，在生物相容性能和力学性能上也需要标准化，这就对生物打印技术的均匀性和再现性提出了更高的要求。相较于其他打印方法， 投影式光固化生物3D打印技术在这些方面有着不小的优势 。 生物墨水的开发和应用是生物打印技术的关键。 研究开发并稳定合成能够平衡可打印性、生物相容性和机械性能这三方面的新型生物墨水是生物3D打印应用的基础。目前的许多研究仍局限于使用有限范围的生物材料，而大多数人体组织/器官都有ECM成分的复杂组合，具有特定的生物学或力学影响，单一的生物墨水不可能建立一个“合成”的微环境来模拟体内的实际情况，这也使得多材料生物打印日益重要。 血管化是生物打印活体结构的基础。 与组织工程和再生医学领域面临的挑战一样，确保打印结构充分的血管化是生物3D打印的关键因素。有效构建多尺度的灌注血管网络，通过机械或化学刺激促进其血管化，是生物制造放大组织的基础。虽然建立血管网络的方法有多种，但每种方法都有其局限性，如喷墨生物打印和实验室打印分辨率高，但难以构建复杂的血管网络；基于牺牲材料的生物打印需要一个复杂的二次成型过程；同轴生物打印具有构建多尺寸流道的可行性和灌注培养的能力，在血管化领域有着广阔的应用前景。 实现功能化是生物3D打印的首要目标。 目前的大多数研究仍集中在打印过程和机制，这是面向制造业的想法，而生物3D打印功能化的核心因素是要从基础研究到实际应用。为实现功能化，生物墨水需要具备良好的生物相容性和力学性能，以满足营养灌注和植入的要求。同时，构建模拟体内微环境的场景，包括力学和化学刺激，对打印结构的功能化也至关重要。 3D 打印就好比切土豆的逆过程，切土豆是将土豆加工成土豆片、土豆丝、土豆丁或土豆泥，而3D打印则是将土豆片、土豆丝、土豆丁或土豆泥反向组装成土豆的过程，这四个过程就对应了四种典型的3D打印工艺：采用投影光固化组装的数字光处理（DLP）、采用纤维堆叠组装的熔融沉积（FDM）、采用微球进行组装的喷墨打印以及采用粉末烧结进行组装的选择性激光烧结（SLS）（图1）。 而生物3D打印是一门与机械、材料、生物、医学等多学科紧密相关的前沿技术。从广义上来说，直接为生物医疗领域服务的3D打印都可视为生物3D打印的范畴，而从狭义上来定义，通常将操纵含细胞生物墨水构造活性结构的过程称之为生物3D 打印，此概念也可称之为细胞打印。我们系统总结了生物3D打印的发展历程（图2）和工艺流程（图3）。 图1 四种切土豆方式对应四种典型3D打印工艺 图2 生物3D打印回顾 图3 生物3D打印工艺流程 根据不同的打印原理和打印材料，我们整理了生物3D打印的分类，把常见的生物3D打印方法分为了挤出式、液滴式、光固化式三类。简单来说，挤出式生物打印通过挤出生物墨水形成连续纤维来搭建结构；液滴式生物打印生成离散液滴堆积成型；光固化生物打印利用光敏材料进行光固化并逐层堆叠，实现三维模型。挤出式生物打印可根据不同的出液方式，分为气动挤出式、活塞挤出式和螺旋挤出式三种（图4）。 图4 挤出式生物打印原理 依据不同的液滴成形原理，我们可以把液滴式生物打印分为喷墨式、电流体动力喷射式（EHDJ）和激光辅助式（LAB）等。这其中，喷墨式生物打印常见的有热泡式、压电式等，而激光辅助式生物打印又可细分为激光引导直写（LGDW）和激光诱导前移(LIFT)（图5）。 图5 图5液滴式生物打印原理 光固化式生物打印可根据光扫描的方式不同分为立体光刻（SLA）和数字光处理（DLP）等。目前SLA技术在支架打印中应用较多，但在载细胞打印的应用并不多见。而DLP技术因其有着打印精度高、速度快、均一性好等优点越来越受到学术界的关注（图6）。 图6 DLP打印原理 我们详细描绘了不同生物打印方法在生物医学领域的应用，包括在皮肤、骨/软骨、神经、肌肉/肌腱、脂肪、脊髓、血管/血管化、类器官、药物研究/肿瘤模型、临床应用等方面的研究现状，也总结概述了市场上知名的商业化生物打印设备，同时还对目前较为火热的多材料生物打印（图7）和同轴生物打印（图8）进行了细致的阐述。 图7 多材料生物打印的应用 图8 同轴生物打印的应用 各种生物打印方法被发明出来用以针对不同的应用场景，相应地，每种生物打印方法也有着各自的优缺点。 挤出式生物打印是目前应用最为广泛的生物打印方法，其最大的优势在于可打印的生物相容材料范围广泛（包括细胞团、载细胞水凝胶、微载体、脱细胞基质成分等），涵盖了粘度范围从30mPa/s 到6×10^7mPa/s的生物材料，尤其是具有剪切变稀、快速交联特性的水凝胶材料。这意味着能为维持细胞活力和功能化提供合适微环境的低粘度材料，与能为打印结构提供力学支持的高粘度材料都能与挤出式生物打印很好地结合。同时，挤出式生物打印也有着良好的经济性和易用性等优点，与多材料、同轴生物打印可紧密结合。但挤出式生物打印也有着一些缺陷：首先，其打印精度相对其他生物打印方式较低，一般在100μm量级；其次，生物墨水的选择需要兼顾凝胶化、固化、剪切变稀等性质；此外，由于挤出过程中不可避免的剪切力可能会影响细胞存活率，这在打印细胞密度较高的生物墨水时更为明显。 喷墨式生物打印有着成本低、精度高、速度快等优点，也可针对性地配备多个喷嘴，以满足在同一时间打印不同的细胞、生物材料或生长因子的需求。然而，用于喷墨打印的生物墨水粘度要求限制了其适用生物材料的范围；由于驱动压力小，喷墨生物打印无法打印高粘度材料或高浓度细胞，用喷墨技术实现生理细胞密度的生物打印是目前比较困难的，而低粘度材料会降低打印成型的结构强度，导致不满足后续体外培养和移植的要求；此外，喷墨打印过程中可能会对细胞造成机械或热损伤，喷头也易损耗，这些缺点限制了喷墨生物打印技术的广泛应用。 激光辅助式生物打印相较于前两者有着一个先天优势：其无喷嘴的打印模式就避免了细胞/生物材料堵塞喷嘴的问题；同时这也避免了生物墨水与器件的直接接触，这种非接触式制造方法不会对细胞造成机械损伤。其打印高粘度生物墨水的生物材料选择范围比喷墨打印更广，打印精度甚至能达到生成含单个细胞的液滴。但激光辅助生物打印有几个明显的缺点：首先，成本相对较高，且缺乏商业化的打印设备，而适合激光生物打印的水凝胶材料并不多；其次，该方法自动化程度不高，如LIFT原理所述，每层墨水靠一次次涂层上去，不仅均一性得不到保证，且费时费力，导致其很难应用于复杂结构打印。 DLP 是一种基于面投影的生物3D打印方法，相比应用广泛的挤出式打印有着更高的打印分辨率和可重复性。根据DLP的成型原理，它在打印速度上有很大的优势，因为无论结构多么复杂，每一层的打印时间都不会增加。此外，与喷墨生物打印中液滴之间、或挤出式打印的相邻纤维之间形成的“边界”相比，DLP技术可以更平滑地堆叠三维结构，从而大大提高了结构的完整性和力学性能。在光固化打印工艺中，未固化的液态生物墨水可以为打印结构提供良好的支撑，避免打印过程中水凝胶的坍塌变形；与LAB相同，无喷嘴的打印模式使得喷嘴堵塞、剪切力影响细胞活性等问题不再是困扰。 我们认为，光固化生物打印技术将在细胞生物打印技术中发挥越来越重要的作用，有望取代挤出式生物打印成为未来最为主流的生物3D打印技术。 而生物墨水的性能大致可从三个方面予以评价：可打印性、生物相容性和机械性能（图9）。可打印性是评估生物墨水的可成型性，包括可调节的生物材料粘度、从溶胶态到凝胶态的快速转换性质，以及大范围的可打印参数等。生物相容性要求生物墨水尽可能地与人体中细胞微环境相似，使细胞在其中增殖、扩展、分化并交互。机械性能要求凝胶态的生物墨水力学性能够强，以支持随后的培养和植入过程；生物打印的结构通常需要在体外培养，在此期间常常伴随着营养物质的灌注和降解，需要相当的强度支持；机械性能不足也会导致移植失败。 图9 生物墨水性能的评价标准
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生物3D打印带纤维GelMA微球：三维共培养新思路
heyongzju 2019-11-26 22:24
生物3D打印带纤维微球：三维共培养新思路 3D biofabrication of microfiber-laden minispheroids a facile 3D cell co-culturin.pdf 背景： 在实际的生物体中，许多组织都是由球状结构和纤维结构组成，而不是由单一类型的结构组成。为了模拟体内这些组织中的细胞相互作用，需要探讨如何在体外​​建立具有不同结构类型的异质组织模型。 摘要： 由球体和纤维结构组成的异质组织，例如肿瘤，胚胎和肾小球等，广泛存在于生物体中。作为体外组织模型，已经开发了独立构建球状和纤维结构的方法。然而，同时打印它们并进行集成以更真实的模仿体内环境仍有很多工艺有待解决。EFL团队提出了一种3D细胞共培养新思路—— 负载纤维的水凝胶微球 。该技术应用同轴生物打印和电喷墨技术，并利用多组分流体流动时的“悬绳效应”，实现了带复杂纤维结构的微球制造，并将其应用于三维共培养。 相关工作以题为“3D Biofabrication of Microfiber-Laden Minispheroids: A Facile 3D Cell Co-Culturing System”在Biomaterials Science 上在线发表。谢明君博士为第一作者，浙江大学机械工程学院贺永教授为通讯作者。 http://doi.org/10.1039/C9BM01189G 这种三维共培养微球通过同轴生物3D打印结合电流体喷墨实现不同结构的形态及尺寸控制。GelMA生物水凝胶以其优异的特性被选作为该共培养系统的基本材料。纯GelMA从外喷头流出，形成球状结构。GelMA与海藻酸钠混合（用于增加粘度）从内喷头流出，在球体内形成纤维结构。 图1 制造原理图 为了深入分析两相流体的流动状态，使用高速摄像机观察了该结构的基本制造过程。由此，文章详细分析了其制备过程以及对纤维和球尺寸影响的参数，证实了该策略的制备可行性。 图2 电场作用下液滴状态及产球频率 图3 载纤维迷你球结构及尺寸分布 此外，在这种制造方法中，纯GelMA溶液以及混合未交联海藻酸钠的GelMA溶液被用于构建封装细胞的微环境。考虑到材料系统将对细胞生长和功能化产生重大影响，文章详细研究了该材料体系的各项性能。发现该材料系统具有良好的SEM形貌，降解曲线，孔面积分布和压缩特性。值得注意的是，与未交联的藻酸钠混合的GelMA显示出比纯GelMA大得多的孔隙，为物质交换和细胞生长提供了更大的空间。 图4 材料体系理化特性表征 最后，我们证明了HUVECs和MDA-MB-231s细胞在该结构中能保持较高的生存能力。重要的是，转染的HUVECs与MDA-MB-231s在共培养的条件下表现出明显的相互作用。在肿瘤细胞的影响下，HUVECs的肌动蛋白逐渐延长。经过十三天的培养后朝向肿瘤细胞生长，而HUVEC单独培养时并没有表现出相同的现象。 图5 内皮细胞与肿瘤细胞在共培养体系中的存活情况 图6 内皮细胞与肿瘤细胞在共培养体系中的F-Actin及DAPI染色
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[科普] 生物3D打印入门概述
heyongzju 2019-11-8 12:48
生物3D打印入门概述 He2019_Article_WhyChoose3DBioprintingPartIABr.pdf 生物 3D 打印是目前正在兴起的研究领域，狭义上的生物 3D 打印可以理解为操纵细胞进行体外三维活性结构的组装，生物 3D 打印已经在药理模型、器官缺损修复、细胞三维培养等方面取得了诸多进展。从这一期开始， EFL 团队将在 Bio-Design and Manufacturing 上以短文形式开设科普专栏，力求简明扼要的阐述生物 3D 打印的各个层面 ( 生物 3D 打印工艺、生物墨水设计、生物 3D 打印机、体外病理模型构建，组织再造等 ) 内涵及研究内容。本文是第一期，生物 3D 打印简要概述。 Why choose 3D bioprinting? Part I: a brief introduction of 3D bioprinting for the beginners . Bio-Design and Manufacturing ， 2019 ， https://doi.org/10.1007/s42242-019-00053-8 01 生物3D打印概念 从广义上说服务于生物医疗领域的3D打印（增材制造）就是生物3D打印。严格一些，狭义上说生物3D打印特指操纵活细胞打印活性三维结构的过程，也就是所谓的载细胞打印，也可称为细胞打印，或器官打印。 注意这里的细胞打印不是打印出新的细胞，而是指将细胞作为打印原料。 由于单纯的细胞无法打印构成结构，我们将细胞与水凝胶混合构成所谓的生物墨水，用生物墨水打印活性结构。这里水凝胶的作用有两个：作为打印时的黏合剂实现3D成形，打印后固定细胞位置并为细胞提供类体内的3D环境也就是起细胞外基质（ECM）作用。 02 生物3D打印研究啥呢？ （1）研究成形过程：不同组织内有不同的细胞种类，同时细胞在空间上也存在不同密度的分布，而生物墨水是一种典型的软材料，感觉上接近可以吸的液态果冻，因而设计合适的打印方法实现细胞在三维空间上的精准排布还是很有挑战性的； （2）研究活性结构到功能性组织/器官的实现过程：刚打印出来的活性结构类似于镶嵌的一颗颗水果丁的果冻，细胞就好比那水果丁，而水凝胶就是那包裹水果丁的果冻了。而我们真正的组织内部细胞是彼此连接，能互相沟通及协作的，故而打印出结构后，还需要经历一个二次发育的过程，通过这个过程细胞建立起联系，慢慢拥有体内组织的部分乃至全部的功能。 这两个内容都是非常复杂，很多工作才刚刚展开， 如果说第一个成形的工作已经取得了些进展的话，那么第二个功能化的工作才刚刚开始，任重道远，万里长征，我们才刚刚开始走。 作为一个典型的多学科交叉研究内容，有太多的问题有待解决，个人想到的点有： n 细胞来源上，安全，批量，安全； n 体外器官模型（类器官）可重复性及标准化； n 大尺寸器官体外重建及长时间体外培养； n 含外源性细胞打印组织植入的系列伦理性问题； n 体外打印组织和体内再生的边界； n Printing@clinic? n 体外能再造出有思考能力的大脑吗？ n 活性的生物打印结构能成为临床产品吗？ n 器官修复中那些留给体外打印，那些留给体内再生呢？ 03 生物3D打印应用 两大需求驱动生物3D打印的快速发展: 其一是体外构建更接近人体组织/器官功能的结构，为各种疾病的精准治疗及器官发育及病变机制研究提供比动物实验更高效的研究手段。 当前生物3D打印研究重点是为各种疾病的精准治疗研究提供新的研究手段。目前疾病的机理探讨主要依赖二维的细胞实验及动物实验，二维的细胞实验与人体环境相距甚远，而动物实验除了成本高、周期长、重复性不够理想外，动物的体内环境与人体也有较大的差异。由于3D生物打印可以精确的堆叠各种细胞及支架材料，形成接近实际器官组织的结构（术语成为类器官或迷你组织），同时其细胞也可采用人类的细胞，恰好可以弥补目前常用的两大实验方式的缺点。目前生物3D打印在肿瘤模型、药物代谢所带来的肝脏毒性评估、肠道微环境的构造、心血管疾病病例探讨等领域都有不少报道，生物3D打印技术在疾病的精准治疗中将会有非常广泛的应用，也是目前就可以很快开展的工作。基于生物3D打印为细胞构建更精准的三维环境，制造类器官技术可行，目前也亟需，这个工作除了可供药物评价等外，类器官还可用于器官病变、缺损的治疗。 生物3D打印将会逐步变成组织工程或生物材料研究的一个基本手段， 毕竟目前常规细胞二维培养体系（基于培养皿）和体内的三维环境有不小的差别。 其二是器官的体外再造，以解决器官缺损供体不足的问题。 近几年大尺寸器官的体外重建及长期功能化培养将会成为一个研究重点。总的来说器官打印及替换是生物3D打印研究的长期目标，需要我们脚踏实地的一步步逼近。
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EFL课题组生物3D打印研究阶段性工作总结
heyongzju 2019-6-15 09:10
EFL课题组生物3D打印研究阶段性工作总结 生物 3D 打印（ 3DBioprinting ）又称“生物增材制造”，从广义上来分，生物 3D 打印大致可划分为四个层次：第一层次为制造无生物相容性要求的结构，比如目前有广泛应用的手术路径规划用产品的 3D 打印、手术导板等；第二层次为制造有生物相容性要求，不可降解的制品，比如钛合金关节、缺损修复的硅胶假体等；第三层次为制造有生物相容性要求，可降解的制品，比如活性陶瓷骨、可降解的血管支架等；第四层次就是狭义生物 3D 打印，即操纵活细胞构建仿生三维组织，比如打印药物筛选及机理研究用的细胞模型、肝单元、皮肤、血管等。 开发合适的生物墨水一直是生物 3D 打印中的一个核心问题，浙江大学贺永教授课题组多年从事生物 3D 打印研究，已成功实现 GelMA 基“生物墨水”的产业化，解决了生物墨水的批次差异性大、批量化稳定性差等问题，被国内外百余个课题组所应用。生物墨水作为典型的软物质材料，可打印性一直是研究的焦点所在，该课题组对可打印性进行了系统的研究，从墨水的调控、打印中的误差控制、研究精准成形工艺等角度对生物墨水的可打印性展开了系列研究，实现了水凝胶精确打印及单细胞分辨率的操控（图 1 ） 。 图 1 GelMA 水凝胶复杂结构打印 GelMA基生物墨水 活性组织内遍布的各类血管是器官保持活性的根本，只有有效的加工出相似的血管网络才有可能实现营养的有效输送，确保 3D 打印后形成一个真正的活性器官。 常见的方法是先制造类似血管的流道结构，然后包覆在凝胶结构中，或者是基于牺牲工艺的流道构建技术。但是这些方法需要的工艺过程复杂，无法实现支架结构和流道网络的同时打印，难以在内部构造有效的流道。贺永课题组提出了一种全新的基于中空凝胶纤维融合工艺的细胞打印方法，实现了支架结构和流道网络的同时成形（图 2 ）。通过课题组自行研发的三维打印机，利用同轴喷头制造出中空凝胶纤维，通过三维打印平台控制中空凝胶纤维的沉积位置以及控制凝胶反应的交联时序，使中空凝胶纤维融合一起形成具有内置流道的三维结构。课题组通过大量的工艺实验，系统解决了凝胶融合工艺；证实了融合后的凝胶结构强度适合于器官打印要求；并通过后续的细胞培养验证了营养通道的有效性 。在本方法的基础上，课题组提出了一种血管 3D 打印工艺，该工艺能实现宏微跨尺度血管结构的打印，宏观流道可用于各种机械力的加载，微观通道可用于营养输送以及化学物质的加载。课题组通过大量的工艺实验，系统解决了跨尺度血管结构的成型问题，成功构建出了含成纤维、平滑肌及内皮细胞的三层血管结构 ，进一步的课题组建立了体外血管模型， CD31 、 Vinculin 及 Ve-Cadherin 抗体染色表明，已成功构建出了接近体内血管功能的血管芯片。随后通过炎症诱导因子的加载，模拟了动脉粥样硬化等病理条件下血管的炎症反应 。在相关工作的推动下，同轴生物 3D 打印方法已经发展成为一个新兴的研究方向。 图 2 同轴生物 3D 打印方法 类器官是药物评价、器官病变机制等研究的有效工具，课题组发 明了一种气流辅助异质螺旋微球类器官的成型工艺（图 3 ）， 首次实现了 在微球内构造出复杂的活性结构 。该方法 精度可达到单细胞分辨率，为类器官的高效及精准构建提供新思路，相关工作刊登在 Small 杂志上并被选为封底论文 。 课题组受到旋绳效应的启发，实现了 GelMA 材料异质微纤维的制造，可打印多种组分，多种形态的纤维状迷你组织。在微纤维中包裹了内皮细胞，内皮细胞在很短的时间内即可迁移到纤维表面，形成螺旋等各种微血管结构 。此外，课题组提出了电场辅助的 GelMA 微球制造方法，解决了低浓度 GelMA 成形的难题。通过细胞包裹、药物控释、生物 3D 打印三个典型案例展示了 GelMA 微球在组织工程领域的潜在应用 。 图 3 气流辅助异质微球类器官的成型工艺 生物 3D 打印的组织结构除了在器官发育机制、病变机理、药物评价领域有众多应用外，课题组一直在思考如何将载细胞打印变成成标准的临床产品。从临床产品视角出发，我们认为打印的结构需要满足： 1 ）包裹细胞的水凝胶材料生物性能优异，便于让包裹的细胞发育出功能； 2 ）打印工艺简单稳定，可量化稳定制造； 3 ）打印后的结构可长期储存，能像创可贴一样随取随用。由于水凝胶纤维结构简单，易于营养渗透及包裹细胞的功能化，我们认为水凝胶纤维是非常有潜力成为临床产品的结构。围绕这三个需求，课题组选用高生物活性的 GelMA 水凝胶作为细胞包裹材料，在纤维上成功实现了血管类器官、毛细管新生（血管出芽）、血管化肿瘤等结构的构造，证明了 GelMA 载细胞结构可以高效的实现细胞的功能化；开发了同轴打印工艺，可稳定、大批量地制造 GelMA 纤维，实现载细胞纤维的量化生产；制备的载细胞纤维还可通过冻存长期稳定的保存，取出后又可快速恢复功能，这样可建立一个载细胞微纤维银行，实现随取随用。相关工作刊登在 Advanced Heathcare Materials 杂志上并被选为封底论文 。 图 4 产品化载细胞 GelMA 纤维的要求 基于以上研究，课题组已发表相关论文 20 余篇（ 3 篇封面），撰写著作 1 部 ，如图 5 所示。此外，为了降低医学人员使用生物 3D 打印机的门槛，课题组还联合苏州智能制造研究院产业化了 EFL-BP 系列模块化生物 3D 打印机（图 6 ），其最大特点是可直接置入超净工作台，功能通过模块可灵活配置，操作简单易用。可搭载气动、挤出、高精度直写（ 3 到 5 微米打印精度）、光固化等喷头，支持细胞、水凝胶、生物陶瓷、 PLA 、 PVA 、 PBS 等材料。 图 5 课题组撰写的专著及发表的论文封面 图 6 苏州智能制造研究院推出的 EFL-BP 系列生物 3D 打印机 （ a ） BP66 系列挤出式打印机；（ b ） BP58 系列高精度（2微米精度）打印机；（ c ） BP86 系列（全球首款商业化投影式光固化生物 3D 打印机） He Y, Yang F F, Zhao H M, et al. Research on theprintability of hydrogels in 3D bioprinting . Scientific reports, 2016, 6:29977. Gao Q, Niu X, Shao L, et al. 3D printing of complexGelMA-based scaffolds with nanoclay . Biofabrication, 2019,11: 035006 . Gao Q, He Y, Fu J, et al. Coaxial nozzle-assisted 3Dbioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery .Biomaterials, 2015, 61: 203-215. Gao Q, Liu Z, Lin Z, et al. 3D bioprinting of vessel-likestructures with multilevel fluidic channels . ACS biomaterials science engineering, 2017, 3(3): 399-408. Nie J, Gao Q, Wang Y, et al. Vessel ‐\ on ‐\ a ‐\ chip with Hydrogel ‐\ based Microfluidics .Small, 2018, 14(45): 1802368. Zhao H, Chen Y, Shao L, et al. Airflow ‐\ Assisted 3D Bioprinting ofHuman Heterogeneous Microspheroidal Organoids with Microfluidic Nozzle .Small, 2018, 14(39): 1802630. Shao L, Gao Q, Zhao H, et al. Fiber ‐\ based mini tissue withmorphology ‐\ controllableGelMA microfibers . Small, 2018, 14(44): 1802187. Xie M, Gao Q, Zhao H, et al. Electro-Assisted Bioprintingof Low-Concentration GelMA Microdroplets . Small, 2018: 1804216. Shao L , Gao Q , Xie C , etal. Bioprinting of Cell-Laden Microfiber: Can It Become a Standard Product? . Advanced Healthcare Materials, 2019: 1900014 贺永，傅建中，高庆著. 生物3D打印：从医疗辅助制造到细胞打印，华中科技大学出版社，2019
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纳米粘土辅助的生物水凝胶复杂支架3D打印
heyongzju 2019-3-19 16:55
纳米粘土辅助的生物水凝胶复杂支架 3D 打印 3DPrintingofComplexGelMA-basedScaffoldswithNanoclay.pdf 生物水凝胶在生物 3D 打印中为细胞提供接近细胞外基质的环境，面向创伤再生的可定制化，理想的可生物 3D 打印的水凝胶必须有要兼顾可打印性及生物活性。课题组所产业化的 GelMA 水凝胶，尤其是低浓度的 GelMA ，具有优良的生物相容性。但是，低浓度 GelMA 水凝胶粘度很低（接近于水），常规 3D 打印设计并不能有效打印这种材料。如何打印 GelMA 水凝胶的复杂结构，一直是一个难点。 图 1. 课题组 实现的复杂水凝胶支架打印（分叉血管、耳朵） 为了解决 GelMA 水凝胶的打印难题，我们设计了一种 Nanoclay/GelMA 复合打印策略，使其既能够在普通条件下进行打印，又保留了 GelMA 水凝胶良好的生物相容性。我们对这种材料的打印特性以及生物特性进行验证，并且将制造过程划分为挤出、沉积、融合三个阶段，系统的研究了不同的元素对支架制造过程的影响，给出具体的打印工艺窗口。 图 2. 打印原理以及水凝胶材料流变性能 Nanoclay/GelMA 生物墨水具有良好的剪切变稀性能和自支撑性能。打印过程中，这种材料可以在溶胶状态（低粘度）和凝胶状态（高粘度）切换。挤出过程中，生物墨水受到剪切力的作用，粘度降低成为溶胶状态，很容易被挤出。沉积到打印平台后，剪切力消失，生物墨水快速恢复到凝胶状态。 GelMA 是一种光敏材料。利用 Nanoclay/GelMA 生物墨水打印的结构可以在紫外光下完成光交联，成为稳定的组织工程支架。 图 3. GelMA/Nanoclay 生物墨水挤出过程可打印性研究 在挤出过程中，由于剪切力的存在，生物墨水纤维会产生膨胀。我们将膨胀率定义为 α=D/d （ D 为生物纤维直径， d 为喷头直径）。 α 值越小，生物墨水纤维膨胀程度越小。对于同一种材料，喷头直径与挤出速度会对 α 值产生明显的影响。 α 值与喷头直径成反比，与挤出速度成正比。而且随着生物墨水中 Nanoclay 含量的增加， α 值也呈现减小的趋势。根据这些数据， α 值在（ 1.2, 1.5 ）这个区间内时，生物墨水纤维的性能良好。 图 4. GelMA/Nanoclay 生物墨水沉积过程可打印性研究 由于自身重力以及喷头挤压，生物墨水纤维沉积在打印平台时会发生变形。纤维界面会由圆形变为椭圆形。我们将这种变形定义为 β=W/D （ W 为纤维宽度， D 为纤维直径）。 β 值越小，变形越小。在保持挤出速度不变时，生物墨水浓度、层高、打印速度是对 β 值产生影响的重要因素。根据实验结果，随着层高以及打印速度的增加， β 值减小。生物墨水中 Nanoclay 的含量越高， β 值越小。当 0.9 ＜ β ＜ 1.2 时，生物墨水纤维沉积后的效果良好。我们将这个区间定义为当前阶段的可打印窗口。 图 5. GelMA/Nanoclay 生物墨水融合过程可打印性研究 在打印中，不同层的生物墨水纤维会产生融合。融合程度对打印结果会产生较大的影响。严重时可能会造成打印的结构失真 。这种融合的结果体现在结构上就是打印结构的实际高度和面积与理论值不同。网格与圆柱是两种比较有代表性的结构。 我们定义两个参数 θ 和 γ 来表示这两种结构的融合程度。 θ=S/S 0 （ S 为单个网格实际面积， S 0 为单个网格理论面积）， γ=H/H 0 （ H 为实际高度， H 0 为理论高度）。 θ 和 γ 的值越大，融合程度越小。 GelMA/Nanoclay 生物墨水中 Nanoclay 的含量，是否边打印边进行光交联反应，都会对 θ 和 γ 的值产生影响。我们通过实验发现，增加 Nanoclay 的含量，采取边打印边固化的方式，都能够抑制融合现象。当 θ 和 γ 的值都在（ 0.8, 1 ）这个区间内时，打印的结构基本可以满足我们的需求。所以我们将这个区间定义为此工艺阶段下的可打印窗口。 图 6. 水凝胶 支架的机械性能研究 组织工程支架需要满足细胞培养的需求，包括营养流通、维持水性环境。与 GelMA 相比， GelMA/Nanoclay 生物墨水具有较高的强度。 GelMA/Nanoclay 生物墨水的机械强度与 Nanoclay 的含量成正比。 利用 GelMA/Nanoclay 生物墨水打印出的组织工程支架具有明显的孔隙，尤其是侧孔。这些孔隙对于营养的流通是非常有帮助的。 GelMA/Nanoclay 支架的平衡溶胀率和 GelMA 相比略有下降，但是依然维持在较高水平。这种特性对于维持水性环境是非常重要的。 图 7. 水凝胶支架的生物相容性研究 为了验证 GelMA/Nanoclay 支架的生物特性，我们分别将 内皮细胞接种在 GelMA 支架和 GelMA/Nanoclay 支架上。经过 5 天的培养之后，这两种支架上的细胞均有较高的存活率，而且没有明显差异。所以，加入 Nanoclay 并不会对 GelMA 支架的生物相容性产生不利影响。利用我们的研究内容，可以打印出具有良好生物相容性的个性化结构。 相关论文“ 3D Printing of Complex GelMA-based Scaffolds with Nanoclay ”已被 Biofabrication 杂志录用，一作为高庆博士、牛雪峰硕士为共同一作，通讯作者为贺永教授。 论文 DOI ： 10.1088/1758-5090/ab0cf6
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载细胞生物3D打印，离临床产品还有多远？
热度 1 heyongzju 2019-3-14 07:57
载细胞生物 3D 打印，离临床产品还有多远？ 67 Bioprinting of Cell‐Laden Microfiber_ Can It Become a Standard Product.pdf 生物 3D 打印实现载细胞结构制造，可有效模拟组织 / 器官结构，在器官发育机制、病变机理、药物评价、再生修复等领域有众多应用。这几年我们一直在思考，何时载细胞打印能够进入临床，变成标准的产品呢？ 从临床产品视角出发，我们认为打印的结构需要满足： 1 ）包裹细胞的水凝胶材料生物性能优异，便于让包裹的细胞发育出功能； 2 ）打印工艺简单稳定，可量化稳定制造； 3 ）打印后的结构可长期储存，能像创可贴一样随取随用； 由于水凝胶纤维结构简单，易于营养渗透及包裹细胞的功能化， 我们认为水凝胶纤维是非常有潜力成为临床产品的结构 。围绕这三个需求，课题组选用高生物活性的 GelMA 水凝胶作为细胞包裹材料，在纤维上成功实现了 血管类器官、毛细管新生（血管出芽）、血管化肿瘤等结构的构造，证明了 GelMA 载细胞结构可以高效的实现细胞的功能化； 开发了同轴打印工艺，可稳定、大批量地制造 GelMA 纤维，实现载细胞纤维的量化生产；制备的载细胞纤维还可通过冻存长期稳定的保存，取出后又可快速恢复功能，这样可建立一个载细胞微纤维银行，实现随取随用。 图 1 产品化载细胞凝胶纤维的三大要求（这里未考虑细胞来源要求） 图 2 GelMA 纤维打印及应用前景。（ 以 GelMA 作为原材料，开发同轴打印技术，可稳定批量的制造 GelMA 凝胶纤维， GelMA 凝胶纤维优异的生物性能有着广泛的应用前景 ） 图 3 可编程多细胞 GelMA 纤维制造 图 4 可编程多细胞 GelMA 纤维 3D 结构制造 图 5 血管类器官、血管出芽、肿瘤血管化组织制造 图 6 载细胞 GelMA 纤维冻存及解冻后的继续发育（类细胞冻存一样，借助于纤维的微尺度特性， GelMA 纤维也可以利用冻存的方法长期稳定的保存（图 6 ）。这样可以实现 一个纤维“银行”，或者类器官“银行”，,随取随用，方便研究及临床再生修复。 ） 相关论文 “ Bioprinting of cell-laden microfiber, can it become a standard product? ” 近日刊登在 WILLY 旗下的 Advanced Healthcare Materials 杂志上。第一作者为邵磊博士生，通讯作者为贺永教授。 论文 DOI ： 10.1002/adhm.201900014
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生物3D打印课题组2018年度回顾
heyongzju 2019-1-1 20:21
生物3D打印课题组2018年度回顾 回顾18年，课题组收获满满。应该说这几年我们脚踏实地，一步一个台阶。经过几年的积累，课题组今年可稳定的在高水平期刊上发表系列的生物3D打印学术论文，出版了一本生物3D打印专著。在技术转化方面，课题组提供的生物墨水及生物3D打印解决方案也已在国内外几十个课题组成功应用。 感谢课题组各位同学的辛苦工作，感谢各位师长，各位同事的关心和帮助。 1. Small （IF=9.6） 封底，类器官的生物3D打印新方法 一句话概括 ：多细胞异质结构可以在微球上打印，精度可达单细胞分辨率，为类器官的高效及精准构建提供新思路； 论文信息 ： ZHAO, Haiming, et al. Airflow ‐ Assisted 3D Bioprinting of Human Heterogeneous Microspheroidal Organoids with Microfluidic Nozzle. Small , 2018, 14.39: 1802630. 2. Small （IF=9.6），以水凝胶为材质的微流控芯片及其上构建的血管芯片 一句话概括 ：为水凝胶微流控芯片提供了一种可行的制造方法，构建了血管芯片，建立了动脉粥样硬化的体外疾病模型。 论文信息 ： NIE, Jing, et al. Vessel ‐ on ‐ a ‐ chip with Hydrogel ‐ based Microfluidics. Small , 2018, 14.45: 1802368. 3. Small （IF=9.6），基于微纤维的迷你类器官 一句话概括：以GelMA生物水凝胶为生物墨水，发展出异质凝胶纤维的高通量打印方法，建立了体外的血管模型。 论文信息： SHAO, Lei, et al. Fiber ‐ Based Mini Tissue with Morphology ‐ Controllable GelMA Microfibers. Small , 2018, 14.44: 1802187. 4. Small （IF=9.6），电场辅助生物打印高生物活性微球 一句话概括 ：发展了一套可量化生产的微球制造方法，可用于载细胞微球、药物控释及生物3D打印。 论文信息 ： XIE, Mingjun, et al. Electro‐Assisted Bioprinting of Low‐Concentration GelMA Microdroplets. Small , 2018, 1804216. 5. Biofabrication （IF=6.8），可像乐高积木式进行模块化组装的3D微流控芯片 一句话概括 ：提出了模块化芯片3D打印新方法，以毛细驱动液体的方式解决了原有思路中易漏液、难组装等瓶颈。 论文信息 ： NIE, Jing, et al. 3D printed Lego®-like modular microfluidic devices based on capillary driving. Biofabrication , 2018, 10.3: 035001. 6. ACS Applied Materials Interface （IF=8.0），液体金属3D打印新思路 一句话概括 ：提出液态金属同轴3D打印新思路，解决打印中液态金属易氧化，难封装等瓶颈问题。 论文信息 ： ZHOU, Luyu, et al. 3D Printed Wearable Sensors with Liquid Metals for the Pose Detection of Snakelike Soft Robots. ACS applied materials interfaces , 2018. 7. Journal of Dental Research （IF=5.4），颌面缺损的个性化定制修复 一句话概括 ：首次实现了可降解骨的个性化修复，解决了可降解骨缺损修复中强度过低、降解过快等导致的系列难题。 论文信息 ： SHAO, Huifeng, et al. Custom Repair of Mandibular Bone Defects with 3D Printed Bioceramic Scaffolds. Journal of dental research , 2018, 97.1: 68-76. 8. Materials Design （IF=4.5），纳米结构可控形貌制造 一句话概括 ：将静电纺丝与3D打印模具相结合，通过可控发泡实现了三维纳米支架的可控制造。 论文信息 ： GAO, Qing, et al. Fabrication of electrospun nanofibrous scaffolds with 3D controllable geometric shapes. Materials Design , 2018, 157: 159-169. 8. 生物3D打印专著：生物3D打印：从医疗辅具制造到细胞打印，华中科技大学出版社
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电场辅助生物3D打印载细胞GelMA微球
heyongzju 2018-12-21 09:47
电场辅助生物打印载细胞GelMA微球 66 Electro-Assisted Bioprinting of Low-Concentration GelMA Microdroplets.pdf 微球由于结构简单，广泛应用在生物医疗领域，诸如注射治疗、细胞三维培养、药物载体等中。基于微球构造迷你类器官一直是课题组这几年的关注重点。微球类迷你组织构建要解决两大问题：其一、找到生物学性能优异的生物水凝胶；其二、发展出基于该水凝胶的可量化稳定生产的制造工艺，毕竟如果要想后续能真正应用，必须要有量化生产的工艺。打印是一种量化生产方法，而课题组所产业化的可光固化的 GelMA 水凝胶也是一种性能堪比胶原及基质胶的生物水凝胶。 GelMA 水凝胶 , 尤其是在低浓度的 GelMA 有无比优越的生物学性能。可惜低浓度时 GelMA 水凝胶粘度很低，比水高不了多少，导致其成形一直是个难点，尤其是载细胞微球的打印更是困难。 我们发展了基于电场辅助的微球生物打印方法，其原理是通过高压电场的吸附，从喷嘴中拉出微液滴，通过油相的接收装置收集后，使用可见光即可高效批量固化载细胞微球。我们系统的探讨了各个工艺参数（电压、气压、喷嘴直径）对载细胞微球打印的影响，定义了四种微球打印状态， (i) Microdripping. (ii) Taylor jet. (iii) Oscillating jet. (iv) Shaking spindle ，给出了工艺窗口。为了展示打印微球的广泛应用前景，我们给出了三个典型应用： 1 、用于细胞包裹，载间充质干细胞（ BMSC ）的微球第二天就有很好的伸展发育，第三天就完全伸展发育。 2 、药物控释，使用葡聚糖及牛血清蛋白包裹于微球中，均有很好的控释效果。 3 、作为生物砖进行生物 3D 打印，我们将载细胞微球作为成形单元，通过控制喷头有序移动可直接实现三维载细胞结构的打印。 图 1 电场辅助的载细胞微球生物打印原理 图 2 微球打印时不同的形态划分 图 3 微球打印工艺窗口 图 4 BMSCs 包裹于微球中 图 5 GelMA 微球直接用于打印载细胞三维结构 相关工作已发表在 Small （ IF=9.6 ）上，一作为谢明君博士、高庆博士后为共同一作，通讯作者为贺永教授。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/smll.201804216
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生物3D 打印---从形似到神似
热度 3 heyongzju 2018-12-1 16:33
生物3D打印-从形似到神似 11 生物3D打印_从形似到神似_贺永.pdf 摘要： 系统回顾了生物3D打印提出背景、尝试给出了生物3D打印的研究范围、梳理了生物3D打印的发展历程、结合课题组几年来的研究及思考，对生物3D打印的发展进行了展望。综述重点聚焦于回顾操纵细胞的生物3D打印研究，未来如何能更好的结合临床需求，实现从组织结构的仿生制造过渡到功能化的再造是生物3D打印能否取得突破的关键。 应浙大学报约稿，对生物3D打印做了一个综述性的回顾，给出了一些关于生物3D打印个人的观点，以期能抛砖迎玉。有兴趣看全文可直接在我的博客或cnki等数据库中下载（ 论文题目：生物3D打印-从形似到神似 ）。另外，我也写了一本生物3D打印的书（ 生物3D打印：从医疗辅具制造到细胞打印 ，华中科技大学出版社，2018年12月份出版），有兴趣的到时可看看哈。关于生物3D打印的一些概括性问题总结回答如下： 一、生物3D打印到底研究啥？ 从广义上说服务于生物医疗领域的3D打印（增材制造）就是生物3D打印。严格一些，狭义上说生物3D打印特指操纵活细胞打印活性三维结构的过程，也就是所谓的载细胞打印，也可称为细胞打印。注意这里的细胞打印不是打印出新的细胞，而是指将细胞作为打印原料。 由于单纯的细胞无法打印构成结构，我们将细胞与水凝胶混合构成所谓的生物墨水，用生物墨水打印活性结构。 这里水凝胶的作用有两个：作为打印时的黏合剂实现3D成形、打印后固定细胞位置并为细胞提供类体内的3D环境也就是起细胞外基质（ECM）作用 。 生物3D打印研究内容包括： （1） 研究成形过程 ：不同组织内有不同的细胞种类，同时细胞在空间上也存在不同密度的分布，而生物墨水是一种典型的软材料，感觉上接近可以吸的液态果冻，因而设计合适的打印方法实现细胞在三维空间上的精准排布还是很有挑战性的； （2） 研究打印结构再现组织/器官功能的过程 ：刚打印出来的活性结构类似于镶嵌的一颗颗水果丁的果冻，细胞就好比那水果丁，而水凝胶就是那包裹水果丁的果冻了。而我们真正的组织内部细胞是彼此连接，能互相沟通及协作的，故而打印出结构后，还需要经历一个二次发育的过程，通过这个过程细胞建立起联系，慢慢拥有体内组织的部分乃至全部的功能。 这两个内容都是非常复杂，很多工作才刚刚展开，如果说第一个成形的工作已经取得了些进展的话，那么第二个功能化的工作才刚刚开始，任重道远，万里长征，我们才刚刚开始走。 二、生物3D打印可实现器官打印并用于器官替换了？ 我每次做报告以及和其他研究方向的学者交流时，都会被问到这个问题，也常会看到一些报道，大概意思就是生物3D打印已经能实现肝、肾等器官体外制造，马上器官短缺的问题就可以解决了。 我个人观点：虽然目前也有一些相关尝试，但 总体而言生物3D打印实现器官替换还有很长的路要走 。从结构及形态上说人体器官远比我们想象的要复杂的多，此外器官的生长发育机制等机理上还有很多问题有待揭开。目前报道的所谓肝打印、肾打印等研究其实更多的是实验室再现了器官众多功能中的一到两个而已。 三、生物3D打印是噱头，只是玩概念？ 和前一个观点正好相反，有些学者就直言不讳的和我说，生物3D打印就是炒个概念，又不能实现器官的替换，有啥用。 个人观点： 目前生物3D打印研究重点： 其一为各种疾病的精准治疗研究提供新的研究手段、其二为各种机制研究提供更接近于人体的环境 。 目前疾病的机理探讨主要依赖二维的细胞实验及动物实验，二维的细胞实验与人体环境相距甚远，而动物实验除了成本高、周期长、重复性不够理想外，动物的体内环境与人体也有较大的差异。由于3D生物打印可以精确的堆叠各种细胞及支架材料，形成接近实际器官组织的结构（术语成为类器官或迷你组织），同时其细胞也可采用人类的细胞，恰好可以弥补目前常用的两大实验方式的缺点。目前生物3D打印在肿瘤模型、药物代谢所带来的肝脏毒性评估、肠道微环境的构造、心血管疾病病例探讨等领域都有不少报道，生物3D打印技术在疾病的精准治疗中将会有非常广泛的应用，也是目前就可以很快开展的工作。 总的来说器官打印及替换是生物3D打印研究的长期目标，需要我们脚踏实地的一步步逼近，目前而言基于生物3D打印为细胞构建更精准的三维环境，制造类器官技术可行，目前也亟需，这个工作除了可供药物评价等外，类器官还可用于器官病变、缺损的治疗。 我的观点是： 生物3D打印将会逐步变成组织工程或生物材料研究的一个基本手段 ，毕竟目前常规细胞二维培养体系（基于培养皿）和体内的三维环境有不小的差别。 四、 生物 3D 打印门槛很高，很难掌握？ 生物3D打印听起来很神秘，是机械、生物、医学及材料的多学科交叉，从事这个研究会不会很难。 个人观点：这个方向的研究的确有一定的门槛，总体而言 生物3D打印研究需要医学及机械学科密切合作才能有较好的进展 ，这个研究在机械学科属于生物制造的研究范畴，在医学学科属于组织工程分支，在材料学科属于生物材料分支。相对来说机械学科入门更难一点，因为基本的细胞相关概念及实验条件都需要从零开始建起来。 我当年的知识储备就是高中学过的生物课程，不夸张的说连细胞是啥样子都不明白，至于细胞培养及后续的功能评价等更是两眼一抹黑，我们花了两年时间补充最基础的入门知识，组织工程人很司空见惯的事情我们都要摸索很久，还好挺过来了。 当然对做组织工程或生物材料的课题组来说，采购生物3D打印机，并掌握一些工程化的方法，就可快速入门。生物3D打印机有很贵的，多功能复合的，也有便宜的、走专用及定制化思路的。从发挥设备效率、易用性角度而言，我建议组织工程或生物材料背景的课题组采购专用及定制化思路的生物3D打印机。 国内研究一个误区就是，以为购买了昂贵的设备就万事大吉 ，事实上我见过很多课题组购置了一百多万的生物3D打印机，使用效率却很低。究其根本原因是设备的功能不能充分利用，此外更缺乏一个懂生物3D打印工艺的团队辅助指导。哈哈顺便做个广告，我们课题组在苏州智能制造研究院产业化的小型、专用、便携式的生物3D打印机就是为组织工程或生物材料背景课题组所设计的，我们不光能提供生物3D打印机，更重要的是可提供从生物墨水到具体应用全流程的指导。 五 、 建一个生物 3D 打印实验室价格很昂贵？ 基础的生物3D打印实验室并不是很贵，一个完整的生物3D打印实验室，需要细胞培养室及细胞培养箱、细胞冻存设备、显微镜等检测设备、生物3D打印机、生物墨水配置工具等。一个基本的生物3D打印实验室大概60-80万就可以搞定。如果是组织工程或生物材料背景的课题组，估计添置几台生物3D打印机就差不多了，30到40万元就可添置两到三台生物3D打印机。
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微纤维形迷你组织同轴生物打印
heyongzju 2018-10-11 21:44
微纤维形迷你组织同轴生物打印 63 Fiber-Based Mini Tissue with Morphology-Controllable GelMA Microfibers.pdf 摘要：纤维状组织（血管、肌肉、神经等）是常见的组织结构。有没有可能在体外构造出基本的微纤维单位，然后组装成纤维组织呢？课题组这几年除了探讨基于微球的迷你组织外，还对基于纤维的迷你组织制造产生了浓厚的兴趣。目前制造迷你纤维组织最大的挑战在于如何制造出兼顾生物活性及可加工性的水凝胶微丝。高生物活性可确保载细胞的微纤维能在后续的培养中细胞建立连接，并诱导出组织的功能。 受限于制造工艺，基于海藻酸盐体系的微纤维目前报道较多，但海藻酸盐体系的水凝胶阻碍了后续的细胞发育，使其无法发展为微组织。GelMA水凝胶是一种生物活性非常好，同时能快速光固化的水凝胶材料，但GelMA的固化时间稍长（3-5s），同时载细胞的GelMA粘度较低，导致其直接制造难度较大。如能高效实现GelMA微纤维的制造，将有望发展出基于微纤维的迷你组织。 课题组受到旋绳效应的启发，开发了一种同轴生物打印技术，采用课题组产业化的高性能水凝胶GelMA，实现了GelMA材料异质微纤维的制造，可打印多种组分，多种形态的纤维状迷你组织。课题组在微纤维中包裹了内皮细胞，内皮细胞在很短的时间内即可迁移到纤维表面，形成类微血管结构。 纤维状组织（血管、肌肉、神经等）也是常见的组织结构，而体外重建纤维形态的组织要求材料同时具备较强的可加工性和优异的生物相容性。而现有研究采用的海藻酸盐体系水凝胶可加工性能好，但生物性能较弱，限制了打印后组织功能的诱导。 甲基丙烯酸化水凝胶 gelatin methacrylate (GelMA) ，是一种光敏性生物水凝胶，兼备较强的可加工性和生物相容性，是组织工程、生物医学、生物制造等领域的热门材料，具有极大的潜力。 该材料的详细介绍可参考我上一篇博文 。 近日，浙江大学机械工程学院贺永教授团队采用课题组和苏州智能制造研究院联合研发的 GelMA 材料，开发出了功能性形态可控 GelMA 微纤维，同时实现了纤维状组织的功能化诱导。 相关论文 Fiber-based Mini Tissue with Morphology-Controllable GelMA Microfibers 近日刊登在 WILLY 旗下的 SMALL 杂志上。第一作者为博士生邵磊和博士后高庆，通讯作者为贺永教授。 GelMA 微纤维同轴生物打印 在本文中，研究团队基于流体悬绳效应，使用同轴喷头流体控制系统进行了连续的微纤维制备（如上图），微纤维以海藻酸盐水凝胶为壳，以 GelMA 为核。核心 GelMA 率先进行光交联成 GelMA 纤维，当外壳海藻酸盐进入氯化钙水浴时迅速反应凝胶化而形成外壳层。海藻酸盐的作用是先快速定形，固定未完全固化的 GelMA ，待 GelMA 固化后，海藻酸盐水凝胶可被消化去除。利用流体控制技术和精确操作，实现了 GelMA 微纤维尺寸和形态的调节，该方法制备的 GelMA 微纤维具有长、薄、柔性等特点。由于生物体内组织组成成分多样化，因此制备多材料异质纤维显得很有必要。研究团队对制造系统进行改进，制造出了多种多材料异质纤维结构（如下图），如 Janus 结构，多层 GelMA 结构，双平行和双螺旋 GelMA 结构。 多组分异质 GelMA 纤维 研究团队打印了裹人脐静脉内皮细胞（ HUVECs ）的直血管和螺旋血管迷你组织（如下图），细胞在 GelMA 里可以增殖伸展并迁移。有趣的是，随着培养时间的加长，内皮细胞迁移到 GelMA 纤维外壁，并建立连接形成似血管的内皮管腔，这是 GelMA 纤维外壁营养更充分导致细胞迁移的结果。 直血管制造 螺旋血管制造 血管制造 论文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/smll.201802187
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一花一世界、一叶一菩提 ----迷你组织生物三维打印新方法
heyongzju 2018-9-15 09:46
一花一世界、一叶一菩提 ----迷你组织生物三维打印新方法 61 Airflow‐Assisted 3D Bioprinting of Human Heterogeneous Microspheroidal Orga.pdf Small封底论文（IF=9.60）， Airflow ‐ Assisted 3D Bioprinting of Human Heterogeneous Microspheroidal Organoids with Microfluidic Nozzle . Small, 2018: 1802630. 摘要：“一花一世界、一叶一菩提”蕴含的是东方的世界观，“There is plenty of room at the bottom”是科学家费曼对微纳制造能力的畅想。这几年我们一直在想，是否有可能在一个微小空间里构造出复杂的活性结构，并加以体外培养构造出迷你组织？迷你组织有很多应用，诸如其细胞注射治疗更好的替代方案、药物筛选的理想器官模型、实验室内研究组织发育的工具等。由于水凝胶是典型软材料，高精度制造一直是业界难点，此外多细胞在微小的空间内的高效操纵更是一个挑战。受限于现有制造工艺的分辨率以及三维成型能力，想要在有限的微尺寸中重建人体组织异质微结构目前仍缺乏有效方法。经过近三年的研究，本课题组发明了一种在微球内打印活性结构，构造迷你组织的生物3D打印方法，能在微球内制造出螺旋面、玫瑰花、太极等复杂三维结构。基于本方法，我们在骨髓间充质干细胞微球中打印出内皮螺旋结构，建立了带螺旋形血管的成骨类器官，为体外重建复杂类器官提供了新的思路。 人造组织 / 器官对于研究人体组织发展和病变以及器官移植具有十分重要的研究意义。如今，随着人体类器官在体外模型中得到越来越广泛的应用，实验人员对模型的空间异质性以及结构功能性提出了越来越高的要求。异质凝胶微球的出现为这项研究提供了新的技术路线。异质凝胶微球在多组分、形态可控、使用方便等方面具有独特的优势，目前已经在组织工程、药物释放、生物探针以及再生医学等科学领域取得了重要发展，并演化出了核壳结构、多组分分区结构等各种形态。但已有的制造工艺 无法可控制造出具有高成型分辨率、三维分布可控的异质凝胶微球，也就无法重建复杂的体外人体组织。 课题组提出了一种基于微喷头的异质螺旋凝胶微球的三维打印工艺，首次实现了诸如球面螺旋、太极图案、玫瑰花图案等复杂形态，并大大提高了细胞组分凝胶在微球内的打印精度，实现了单细胞螺旋线排列。该方法采用基于多通道微流控芯片的微喷头，将含有不同细胞组分的水凝胶通过精确注射产生比例可调的分区形凝胶液滴；同时通过位于喷头底部的气流喷头产生可控气流使液滴产生旋转，使细胞在液滴内部按照螺旋结构排列。打印过程实现了多组分的比例调节以及气流喷头位置的在线监测，分辨率高。和现有制造方法相比， 其最大的特点是首次实现了三维结构的可控成型，并将成型精度提高到了单细胞分辨率。 人体组织具有多尺度的结构异质性，比较典型的为具有复杂形貌和功能的血管化组织。在传统研究中，为了实现该类型组织的构建，通常采用组织支架进行细胞培养。然而由于其细胞分布以及结构形貌具有高度的自发性和随机性，因此极大地限制了其应用。采用该研究提出的螺旋凝胶微球能够很方便地进行体外微三维组织构建。该团队采用同步包裹人体静脉内皮细胞（ HUVECs ）和人体骨髓间充质干细胞（ HUMSCs ）的方式实现了在螺旋凝胶微球内细胞共培养微环境的构建。所采用的内皮细胞呈球面螺旋结构分布在间充质干细胞周围，形象地模拟了人体骨组织微结构的生理特点。最后，在体外培养环境下分别实现了内皮细胞的血管化以及间充质干细胞的成骨化，初步实现了体外骨组织类器官的功能化构建。该研究在复杂三维共培养、再生医学、组织工程等领域具有重要的意义。 图 1. 气流辅助异质螺旋微球类器官的成型工艺 图 2. 小鼠成纤维细胞(L929)在螺旋凝胶微球内的包裹和增殖 图 3.基于人体内皮细胞和骨髓间充质干细胞的共培养模型实现体外类器官的制造 图 4. 基于该方法制造的螺旋异质凝胶微球 目前该成果已在 WILLY 旗下的 SMALL 期刊发表，被选为封底论文，通讯作者为机械工程学院的贺永教授、机械工程学院的傅建中教授、基础医学院的欧阳宏伟教授。 Airflow ‐ Assisted 3D Bioprinting of Human Heterogeneous Microspheroidal Organoids with Microfluidic Nozzle . Small, 2018: 1802630.
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基于3D打印的微流控芯片模块化快速制造
heyongzju 2017-9-16 11:09
基于 3D 打印的微流控芯片模块化快速制造 摘要： 微流控芯片作为集成化学、生物领域中的样片制备，检测分析及细胞培养等功能的平台，在当今的医学研究中具有广阔的发展前景。而目前基于传统技术的3D微流控芯片加工面临加工周期长，制造成本高，芯片功能结构单一的问题,如果能够在短时间内基于实验方案个体化定制3D微流控芯片，将会为生物医学研究，尤其是体外微环境构建研究提供高效工具。浙江大学浙江省三维打印工艺与装备重点实验室贺永、傅建中教授团队经过两年多的研究探索，提出了一种基于模块化结构设计的3D微流控芯片定制工艺，该工艺能实现基于芯片功能设计的微流控芯片快速制造。本工艺结合生物制造技术，可以快速制造器官芯片，为后续芯片上不同器官的集成模拟提供了一种可行方案。本研究受到国家基金联合基金-浙江省两化融合重点项目、国家优秀青年基金、浙江省杰出青年基金项目资助。 52 Rapid Customization of 3D Integrated Microfluidic Chips via Modular Structure.pdf 3D 微流控芯片的制造方法一直是微加工领域的研究热点，常见的方法包括：传统技术加工 2D 结构层叠得到 3D 芯片， 3D 打印技术直接制造 3D 微流控芯片和预先制造芯片模组组装 3D 芯片。虽然这些方法制造得到的 3D 微流控芯片在一定程度上可以满足实验需求，但是它们无法兼顾医学研究中对芯片材料生物兼容性和芯片制造快速简便的要求，故对于不同的实验环境和实验要求，这些方法制造的 3D 芯片结构和功能需要不断优化及改进，影响芯片内细胞、组织的培养和检测，进而延长实验周期。 我们 课题组 提出了一种全新的 3D 微流控芯片制造方法，其特点是根据实验需求快速组装芯片模块，在保证生物兼容性的前提下实现 3D 微流控芯片的快速重构。通过课题组前期自行研发的糖打印机，利用糖挤出喷头制造流道图案，浇注 PDMS 固化后翻模得到 PDMS 基的芯片模组。根据实验需求设计，将不同功能的 PDMS 芯片模组及柔性电路、生物支架等附属部件整合，利用快速可逆封装的技术构建完整功能的 3D 微流控芯片。不同功能的芯片设计只需依据设计更换不同功能的模组即可。通过大量的工艺实验，系统解决了 PDMS 模组的成型问题；通过芯片重构实验演示了基于功能设计的芯片快速定制；并通过后续的细胞培养、细胞氧化应激损伤及器官芯片快速构建展示了该方法在生物医学应用中的可能性。 图 1 基于模块化结构设计的 3D 微流控芯片快速制造原理图 图 2 一种适于生物医学应用的集成芯片的快速制造 图 3 基于功能设计的微流控芯片快速重构 图 4 快速定制芯片内的细胞培养研究 图 5 快速定制芯片内的细胞氧化应激损伤研究 图 6 器官芯片的快速构建研究 目前该成果已在 ACS 旗下的 ACS Biomaterials Science Engineering 期刊发表，题为“ Rapid Customization of 3D Integrated Microfluidic Chips via Modular Structure-BasedDesign ”， DOI: 10.1021/acsbiomaterials.7b00401 。
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ACS Biomaterials封面：从纸基微流控芯片到纸基生物芯片
heyongzju 2017-4-23 16:34
45 From Microfluidic Paper-Based Analytical Devices to Paper-Based Biofluidics w.pdf ACS Biomaterials 封面：从纸基微流控芯片到纸基生物芯片（ From Microfluidic Paper-Based AnalyticalDevices to Paper-Based Biofluidics with Integrated Continuous Perfusion ） 毛细驱动的纸基微流控芯片在化学分析中有广泛的应用，常用于污染物的检测等领域，由于其流体驱动依赖于纸的毛细效应，具有体积小，成本低等诸多优势。我们课题组在做生物 3D 打印的时候，一直在思考设计一款简易、小巧的细胞乃至器官灌流设备，以避免现有系统庞大、复杂的体积所造成的诸多不便。经过一年多的设计及实验，我们提出并实现了一种可并行，实现多个打印器官的生物灌流系统，首次实现了在纸基芯片上细胞的三维培养、肿瘤球的药物筛选（乳腺癌的药物筛选为例），演示了该平台在药物筛选上的潜力，很高兴这篇文章被 ACS Biomaterials 选为 第三卷第四期的封面。这个平台很容易与生物3D打印技术集成，在细胞的立体培养、药物筛选、器官芯片等领域有着光明的应用前景。 整个系统设计时就考虑了方便其他研究人员的重现，我们开源了整个设计图纸及软硬件控制代码，除电控部分外所有的结构都可用桌面式 3D 打印机打印，很容易自己在实验室 DIY 。 第三卷第四期封面 系统解构及原理 基于该平台的细胞立体培养 基于该平台的3D肿瘤药物筛选
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美研发人员利用纳米生物材料与干细胞技术成功打印3D骨骼组织
热度 2 WileyChina 2014-11-12 14:54
尽管骨骼具有一定的自我修复能力，但当骨损伤超过一定的临界尺寸，人体将无法自我修复。自二十多年前组织工程的概念诞生以来， 骨骼组织工程 的研究一直得到世界上众多科学家的密切关注。但是传统组织工程的方法手段非常局限，目前人工骨骼还无法达到或接近天然骨组织的结构与性能。基于喷墨打印技术的 生物 3D 打印技术 已经在血管、皮肤、肌肉、神经、心脏、软骨、肌腱等软组织工程方面取得了可喜的进展，但由于喷墨生物打印对于生物墨水的特殊要求，该技术在打印骨胳等强度较大的组织器官方面的发展相对缓慢。 近日，美国斯特摩根医疗公司资深科学家 高桂芳 博士，公司研发总监、现研发副总裁、美国伦斯勒理工大学客座教授 崔晓峰 博士与德国慕尼黑工业大学医学院 ArndtF. Schilling 教授和美国斯克利普斯研究院、日本东京大学 米沢朋 教授等团队密切合作，突破传统喷墨生物打印技术，利用世界首创的具备灵活 3D 打印能力的生物打印平台，首次将团队创新研发的高强度生物材料与人体干细胞相结合，测试了可以高度促进干细胞组织分化的纳米生物材料， 打印出世界上首例呈现精确 3D 空间细胞排列的骨骼组织 。所打印器官经过三周左右的体外培养，经检测，其生物机械性能与蛋白基因表达水平均接近和达到天然骨骼组织。这是喷墨生物打印领域的巨大突破，使得该技术不光能够打印软组织，同样也能够打印强度较大的硬组织器官，首次达到了“软硬通吃”的高度。该工作最近发表在 Biotechnology Journal 上。 研究人员利用 3D 层叠打印技术通过计算机模拟的影像来构建骨骼组织，精密打印一枚长宽高各约 1 厘米的骨组织仅需数分钟左右的时间，结合高效的聚合引物，所打印的干细胞存活率达到 90% 以上。共聚焦显微镜的影像证实该生物 3D 打印平台具备构建与天然组织结构一致的人体组织的能力。研究表明 3D 打印的纳米生物材料能够有效促进所打印骨骼组织的 COL1A1 、 BGLAP 、 COL10A1 、 MMP13 等相关基因的显著表达，碱性磷酸酶活性的显著提高，骨骼基质胶原蛋白的生成亦明显增加。团队目前进行的动物体内实验结果良好，正在数个国家积极申请临床试验许可。 Gao, G., Schilling, A. F., Yonezawa T., Wang J., Dai, G.,Cui, X., Bioactive nanoparticles stimulate bone tissue formation in bioprintedthree-dimensional scaffold and human mesenchymal stem cells. Biotechnology Journal , 2014, DOI10.1002/biot.201400305. 点击查看原文 本文的通讯作者 崔晓峰 教授是世界上最早开始研究 生物制造和 3D 打印 的专家学者，曾成功 打印出世界上首例具有生物功能的人毛细血管网 ，该成果被美国科学院誉为组织工程领域的里程碑之一。在美国斯克利普斯研究院打印出世界上首例达到人关节软骨各项指标的 3D 软骨组织，该工作荣获国际软骨修复学会最佳论文奖 (500 篇论文中的唯一获奖者，自学会成立以来获此荣誉的第一位华人 ) 以及美国斯克利普斯研究院杰出贡献奖。崔教授亦曾荣获美国政府杰出海外人士、入选美国名人录、国际骨科研究学会著名研究员奖、国际生物材料学会杰出贡献奖、美国国家纺织中心主席奖等。已发表学术期刊论文与顶级会议论文五十余篇，受邀在国际学术大会作学术报告达三十余次，其研究成果被世界几十个国家广泛引用。目前崔教授担任三种国际学术期刊编委、澳大利亚国家基金理事会评审专家、二十余种国际学术期刊审稿专家。曾受邀亲自参加美国探索频道 (DiscoveryChannel) 关于 3D 生物打印专题节目的录制拍摄，其研究工作被美国 CNN 等国家新闻网争相报道。崔教授近年来积极开展与国内的合作与交流，协助发展国内 3D 生物打印的研究水平，与上海交通大学、第二军医大学、西安交通大学、武汉大学、武汉理工大学、大连理工大学、山东大学等国内诸多著名大学和研究机构均有创新交流与合作。 图 1 、生物 3D 打印的干细胞与纳米生物材料支架在 21 天骨组织分化培养后的基因表达。与纳米生物材料相结合的人体干细胞骨分化相关基因的表达与其他组相比有显著提高。
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