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一图看懂CRISPR的今生前世与专利权之争: 热度 10 SciLondon 2017-2-17 11:22; （未止科技原创，转载请联系我们。原文：一图看懂CRISPR的今生前世）今天，CRISPR专利权的诉讼终于尘埃落定，Broad研究所的张锋还是笑到了最后：美国专利及商标局判定，张锋和Broad研究所将继续持有在2014年获得的CRISPR-Cas9专利技术，专利应用范围包括人在内的所有真核细胞。率先发现CRISPR应用价值的Doudna以及加州伯克利分校并未取得这项及其重要的专利所有权。那么，这场闹得纷纷扬扬的争端由何而其？CRISPR技术又是经历了怎样的发展？一图读懂！想进一步了解CRISPR技术？请查看：五分钟看懂CRISPR-Cas9; 10525 次阅读|19 个评论

张锋在基因编辑CRISPR 专利之争中获胜: 热度 1 Fanxia 2017-2-16 10:51; 张锋（图片： Katherine Taylor for STAT ）美国当地时间2月15日，美国专利局做出裁决，称基因编辑技术CRISPR-Cas9将由哈佛-麻省理工的博德研究所继续持有，这也是对加州大学之前试图翻转这项专利的一个回应。在专利审判和上诉委员会的判决中，三个法官认为“nointerference in fact”(没有事实上的冲突)，也就是说，博德研究所于2014年获批的CRISPR核心专利，与加州大学所申请的专利不同。在法官们长达51页的裁决书中称，博德研究所在“双方所申请的专利内容实际上是不同的”这一点上说服了他们。博德研究所提供了充足的证据，表明他们专利的申请范围是CRISPR-Cas9系统在真核环境中，与加州大学专利的申请范围不同，后者的专利申请指向的是CRISPR-Cas9系统，未限制环境。证据还显示，在真核细胞中发明这样的系统，并不是基于其在原核细胞或体外系统等的发现所显而易见的，因此两方的专利申请并不冲突。参考文献： Sharon Begley. BroadInstitute prevails in heated dispute over CRISPR patents. https://www.statnews.com/2017/02/15/crispr-patent-ruling/; 2943 次阅读|1 个评论

[转载]中国留学生倒戈邮件曝光张锋基因魔剪专利之争升级: flysky97 2016-8-20 16:15; 美籍华人科学家张锋和詹妮弗·杜德纳争夺CRISPR-cas9专利的官司，背后牵扯到数千万美元的利益。作为科学家，最重要的是学术道德和科学求实的精神…… 这大概又是一个“罗生门”事件，我们现在唯一能肯定的是，一定有人在说谎…… （所以，科学工作者们还是要把测谎技术和方法当成重要的课题来进行研究，呵呵）以下为转载的两篇原文：（一）中国留学生倒戈邮件曝光基因魔剪专利之争升级 2016-08-20 澎湃新闻一封18个月前的邮件，搅动了一场涉及数亿美元的官司，给一场科学家之间的专利之争添加波澜。打官司的两方是加州大学伯克利分校生物学家詹妮弗·杜德娜博士（Jennifer Doudna）和麻省理工学院博德研究所（Broad Institute）实验室主任张锋，他们争夺的对象是当前最为主流的基因编辑技术——被誉为“基因魔剪”的CRISPR-Cas9的专利。基因编辑技术可以实现对DNA片段的敲除、加入等，在可预计的未来，将在治疗疑难杂症上大有市场。目前已有数个关于CRISPR的生物技术公司成立，涉及数亿元的风险投资。其中就包括张锋创立的、已经公开募股筹得9440万美元的公司Editas Medicine和杜德娜创立的、获得诺华两轮共计8500万美元投资的公司Intellia Therapeutics。近日，一封来自张峰实验室前工作人员林帅亮倒戈的邮件被公开，让CRISPR的专利之争升级。这是一封带着求职意向的邮件，发送时间是2015年2月28日，收件人正是杜德娜。信中，林帅亮表示，仔细核对博德的专利申请文件后，他发现“张锋不仅对我不公平，对科学史也不公平”。林帅亮认为，张锋和丛乐（张锋当时的博士生）的实验数据是被误读和夸大的，“像一个笑话”。他向杜德娜谋求其实验室的职位，并表示如果需要可以提供当时的实验记录。信件曝光后，当地时间8月17日，麻省理工学院博德研究所官网进行了回应，对林帅亮当时在张锋实验室时的情况进行介绍，指出林帅亮是在张锋的指导下进行了CRISPR研究，并表示在杜德娜发布论文前，张锋就已经开始了研究这一方向了。在回应中，博德研究所还质疑了林帅亮的动机：林是在美国签证过期的前夕，为了在其他实验室谋得职位而倒戈的。在张峰实验室时，林帅亮的身份是北京大学、清华大学和北京生命科学研究所联合培养项目的博士生，经北京大学教授饶毅推荐，进入张峰实验室。对于自己也被卷入这一纷争，北大教授饶毅表示意外。不过饶毅表示，他对林帅亮的学术印象是正面的，因其对科学前沿很敏感。在曝光的求职信中，林帅亮透露，自己从2011年10月开始在张峰实验室工作，当时是实验室中唯一一个着手研究CRISPR的人，而其他人都埋头于上一代的基因编辑技术TALEN。2011年10月至2012年6月，林帅亮在张锋实验室期间，正是张锋证明自己率先在人类细胞上进行CRISPR基因编辑的关键时期。林帅亮提到，2012年6月，因为母亲的手术和国内的博士学位，他选择回国。正是在2012年6月，杜德娜和她的合作者瑞典于默奥大学的埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）在线发表了关于利用原核生物的CRISPR系统在体外编辑试管中的DNA的论文。林帅亮说，张锋和丛乐是在看到杜德娜的论文后，在不告知林帅亮的情况下，迅速将研究方向转向了CRISPR，而在此之前的CRISPR实验并不成功。在2013年以前，美国的专利归属实行的是先发明制度，谁更早地发现CRISPR，谁就获得专利归属。按照林帅亮的说法，张锋在CRISPR上取得进展是在杜德娜发表论文之后，现在的专利归属是“误归”。林帅亮在2015年2月28日发给杜德娜的邮件，主题为“博德研究所的CRISPR专利以及申请贵实验室的职位”。 CRISPR专利之争时间线回顾林帅亮的版本和此前张锋公开表示的说法相矛盾。据张锋此前接受美国媒体STAT的访谈中提到，2011年2月，他在一场研究报告中第一次接触到CRISPR，随即和丛乐决定跳过原核生物，直接在老鼠和人类的细胞中研究CRISPR系统的有效性，并在2012年春完成基础工作，但为有更重大的进展突破，暂时没有发表。直到2012年6月，杜德娜发表论文，张锋实验室争分夺秒，在2012年10月向《科学》投稿，并在2013年1月3日在线发表。专利之争也在那时拉开帷幕。科学专利一般在论文发表前夕开始申请。2012年5月25日，加州大学伯克利分校向美国专利与商标局提交了与CRISPR相关的专利申请。同年12月12日，张锋与博德研究所也向美国专利与商标局提交了申请，申请对象是在哺乳动物细胞的基因组上进行CRISPR-Cas9基因编辑这一方法。尽管在申请时间上，张锋比杜德娜晚了近7个月，但由于专利申请周期长，杜德娜没有因此得势。反而，张锋通过缴纳70美元的快速审核通道，凭借能证明自己比杜德娜更早做出实验的实验记录本，在2014年4月15日，获得了美国专利与商标局关于CRISPR的第一个专利授权。专利权限包括在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中使用CRISPR。这意味着张锋拥有在除细菌之外的所有生物，包括老鼠、猪和人身上使用CRISPR的权力。但杜德娜和加州大学伯克利分校并没有就此让步，并一直积极寻找更多证据证明自己才是CRISPR的第一发现者。 CRISPR专利到底花落谁家算实至名归？张锋和杜德娜各有落脚点。杜德娜和加州大学伯克利分校认为，张锋只是诸多杜德娜论文的跟进者之一，将CRISPR运用到老鼠和人类细胞上只需要常规技术。但张锋一方的理由是：杜德娜只是预测CRISPR会在人类细胞上有效，自己是第一个将CRISPR运用到人类细胞中的人。今年1月11日，美国专利与商标局宣布重启将CRISPR-Cas9关键专利授予博德研究所的决定。对邮件风波的回应邮件的公开，让科学界这场一波三折的专利之争又添了不少火药味。这不仅因为这是来自张峰实验室前工作人员的披露，更是因为，在2012年12月，张锋和博德研究所的CRISPR专利申请名单中，林帅亮在列。 2011年10月至2012月6月，在张峰实验室时，林帅亮的身份是北京大学、清华大学和北京生命科学研究所联合培养项目的博士生，经北京大学教授饶毅推荐，进入张峰实验室。离开博德研究所后，林帅亮在哈佛大学生物学家Norbert Perrimon实验室工作。据悉，林帅亮现在是加州大学旧金山分校医学院的博士后。对于林帅亮在邮件中披露的信息，美国时间8月17日，博德研究所的发言人Lee McGuire在该研究所官网发文回应。文中对林帅亮当时在张锋实验室时的情况进行介绍，提到说，林帅亮是在张锋的指导下进行了CRISPR研究，并表示，大量证据显示，林帅亮的指控是错误的。为证明这点，Lee McGuire列举了一系列张锋和林帅亮之间的邮件沟通，比如：2011年8月，张锋向其介绍了Cas9在基因编辑方面相关方面信息；2011年10月他向其解释tracrRNA在crRNA二聚体装载在Cas9过程中的重要性等；2011年11月，他承认由于未能完全遵循张锋等人设计的实验计划操作而导致了部分实验的失败。针对专利的归属质疑，Lee McGuire反驳道，大量例子表明，在2011年初，杜德娜发表论文之前，张峰团队就已经成功设计出了在真核基因组上的CRISPR-Cas9系统。此外，Lee McGuire对林帅亮发邮件的动机表示怀疑。Lee McGuire透露，2015年2月28日，正值林帅亮3月1日美国签证过期的前夕，林帅亮向杜德娜发送求职邮件，表示愿意提供更多关于博德研究所CRISPR实验的数据，并在3月2日，得到了加州大学旧金山分校的职位。北京大学教授饶毅对媒体表示，对自己突然被卷入此事表示意外（林帅亮在邮件中提到自己是饶毅的学生），并透露林帅亮应该曾在他的实验室当过轮转学生，对林帅亮的学术印象是正面的，因其对科学前沿很敏感。 8月18日，林帅亮对饶毅表示，自己现在不方便接受采访，会在合适时候做公开说明。截至发稿前，林帅亮没有回复澎湃新闻的邮件询问。此次双方披露的信息是否属实，有待美国专利与商标局的调查。张锋转载（二）基因专利大战：杀出个“程咬金”是中国留学生陈晓雪/李晶/知识分子 2016/08/19 摘要： CRISPR是否成为有史以来最大的生物学专利尚无定论，但它成为生物学有史以来最大争议的专利恐怕已经成为事实。日前，在加州大学伯克利分校杜德娜教授和麻省理工学院博德研究所张锋教授不可开交的争议中， “半路杀出个程咬金”——中国留学生林帅亮。根据《麻省理工科技评论》的最新报道，以及此前的公开信息，各方陈述可梳理如下：2011年10月以前，丛乐（张锋当时的博士研究生）和张锋在研究CRISPR，但可能结果不令人满意，而北京来的林帅亮自称从2011年10月到2012年6月在张锋实验室中是唯一研究CRISPR的人，而根据报道所称，林帅亮认为自己没有做出来，然后回中国一段时间。当年6月，杜德娜和卡彭蒂耶的文章在线发表后，张锋实验室丛乐研究实现了使用CRISPR系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑。但上述基于现有信息的推测是否全部属实，还需要等待美国专利与商标局的进一步调查。基因修饰技术CRISPR/Cas9是生物学界公认强大的技术，自2012年问世以来，影响生命科学多个领域的发展。与之有关的几位主要科学家对各自功劳大小有不同意见，而其专利之争更是举世瞩目，加州大学伯克利分校和麻省理工学院博德研究所之间战火纷飞。在杜德娜教授和张锋教授不可开交的争议中， “半路杀出个程咬金”——中国留学生林帅亮。据《麻省理工科技评论》（MIT Technology Review）8月17日的报道，原张锋实验室成员林帅亮2015年2月28日的一封邮件称，张锋实验室在2012年6月之前没有做出CRISPR，他们关于实验数据的声明存在误导性或夸大描述。而博德研究所发言人Lee McGuire驳斥了这种说法。当时参与张锋实验工作的研究生丛乐和林帅亮的笔记本，以及他们两人和张锋等在2011年和2012年的电子邮件等物证，可能更能显示事实。至于孰是孰非，可能需要等待美国专利与商标局的进一步调查。搅动CRISPR专利纠纷的一封邮件《麻省理工科技评论》报道显示，美国专利与商标局（USPTO）本周公开的一些文件中，包括一封张锋实验室的前成员林帅亮发给加州大学伯克利分校的分子生物学家詹妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）的一封求职信，标题是：“博德研究所的CRISPR专利以及申请贵实验室的职位”。据《知识分子》了解，林帅亮是北大、清华-北京生命科学研究所联合研究生计划（PTN）项目中清华大学注册研究生，他在美国期间国内名义导师是北京大学研究员张晨。林帅亮在这封邮件中称，他从2011年10月至2012年6月在张锋实验室开展CRISPR的研究。在此期间，他是实验室唯一一位做CR ips R项目的人，而其他同事都在研究TALEN系统。2012年6月林帅亮因故回国，恰于此时杜德娜和埃曼纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）发表了关于CRISPR的论文。林帅亮称，张锋和丛乐（张锋当时的博士研究生）是在阅读了杜德娜的论文后才迅速投入到CRISPR的研究。“我的实验室笔记本、邮件和其他文件或生物凝胶图片记录了实验室失败过程的每一步。”林帅亮在该邮件中继续写道。博德研究所回应：大量证据显示学生的指控是错误的博德研究所于今年8月17日当天对加州大学伯克利分校提交美国专利与商标局材料中的邮件进行了回应。该研究所发言人Lee McGuire说，给杜德娜发邮件的学生（编者注：指林帅亮）曾在博德研究所轮转，他从北大-清华大学联合培养项目来到博德研究所做短期访问，2011年10月至2012年6月在张锋实验室做CRISPR项目的研究。 Lee McGuire说，需要去理解林帅亮当时发出这封邮件的背景。他指出，林帅亮当时正面临签证到期（2015年3月1日到期），而他在2月底知道自己无法获得职位回到博德研究所；林帅亮在2015年2月28日给杜德娜发了这封邮件，申请工作，并提出分享博德研究所专利声明的“细节和记录”；2015年3月2日，加州大学旧金山分校为这个学生提供了一个职位，从而解决了这个学生的签证问题。 “尽管轮转学生（编者注：林帅亮）的邮件做出多项指控，反方文件并没有任何证据支持它们。”Lee McGuire说。 Lee McGuire说，有大量的例子可以证明，早在2011年初，张锋和他实验室的其他成员就已经积极并成功地设计了CRISPR/Cas9的真核基因组编辑系统，这是发生在杜德娜等人论文发表前的独立工作。 Lee McGuire同时补充说，大量的证据已经显示这个学生的指控是错误的，并列举出一些例子。比如，2011年8月，张锋将用来编辑基因组的Cas9介绍给了这个学生（指林帅亮）；2011年11月，这个学生（林帅亮）意识到他的一些实验没有成功，因为他没有按照张锋和实验室成员的指导来做。同时这个学生指出张锋一直在监督并指导他的工作。 CRISPR专利之争回顾杜德娜和张锋是CRISPR专利归属的竞争者。这项突破性技术出现后，三家生物技术公司迅速创立，吸引了数亿美元的风险投资。麻省理工学院教授张锋（左）和加州大学伯克利分校生物学家Jennifer Doudna杜德娜（右）张锋在对STAT的访谈中表示，自己是在2011年2月第一次了解到CRISPR的研究，当时一位访问学者在博德顾问委员会的一次会议上作了相关的研究报告。随后张锋与自己的研究生丛乐决定跳过原核生物，直接投入到人类和老鼠的细胞中研究CRISPR系统是否工作。张锋称在2012年春天，他们的基础工作已经完成，也有足够的数据发表文章，但是这只会是一篇普通文章。“我不想只是因为结果已经可以发表就投稿”，他对STAT说，“我希望等到我们有重大的进展时再发表文章，而不是只为成为第一。” 而据博德研究所发言人Lee McGuire以及林帅亮在前述邮件中所称，林帅亮在2011年10月至2012年6月在张锋实验室开展CRISPR的研究。但张锋在访谈中并未提及林的工作。而林自称，在这段时间里他是张锋实验室唯一一位做CR ips R项目的人，而其他同事都在研究TALEN系统。 2012年6月28日，杜德娜和她的合作者瑞典于默奥大学（Umea University）的埃马纽埃尔·卡彭蒂耶在线发表了一篇论文，报道了利用原核生物的CRISPR系统在体外编辑试管中的DNA。整个夏末，张锋团队持续加压工作。2012年10月5日，他们把文章投给《科学》杂志，2013年1月3日，文章得以在线发表。然而，同期发表了一篇与张锋工作类似的文章，通讯作者是来自哈佛大学的教授乔治·彻奇（George Church），同样报道了可以使用CRISPR系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑。巧合的是，张锋在哈佛大学做研究员时曾在彻奇实验室工作过。当张锋被问起是否知道以前的导师也参与到CRISPR的竞赛，他说他并不知道。此后，杜德娜所在的加州大学伯克利分校和张锋所在的麻省理工学院、博德研究所就CRISPR相关专利的归属开展了竞争。 2012年5月25日，加州大学伯克利分校向美国专利与商标局提交了与CRISPR相关的专利申请。2012年12月12日，张锋与博德研究所向美国专利与商标局提交了利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞的基因组进行编辑这一方法的专利申请。尽管加州大学伯克利分校更早提交了专利申请，但博德研究所申请了快速审核通道，后者为此支付了70美元，他们的专利申请更早通过审核。张锋团队提交了实验室的记录本以证明他们比杜德娜的团队先做出这个系统。按照当时美国专利与商标局的规定，专利将授予最先发现或构想一个新东西的人。据此，美国专利与商标局于2014年4月15日将CRISPR第一个专利授予了博德研究所、麻省理工学院和张锋。截止到今年2月，美国专利与商标局已经通过了28个与CRISPR或Cas9相关的专利申请，其中有13个为博德研究所和麻省理工学院所持有，包括哺乳动物基因组编辑方法。对此结果，加州大学伯克利分校并不认可，他们的律师一直在寻找更多的证据来证实杜德娜团队的原创性。今年1月11日，美国专利与商标局宣布将重新评估CRISPR专利归属的决定。争议双方也因CRISPR的专利花费了大量的时间和金钱。据《麻省理工科技评论》报道，张锋创办的Editas 公司（获得了博德研究所CRISPR专利授权）的首席执行官Katrine Bosley说，截止到目前，他们仅2016年在诉讼上的花费已经超过了一千万美元。就此事的专利和功劳纠纷，国内一位科学家感慨道：“在这种割喉式的竞争下，哪里有什么‘节操’的说法，只有拼命干活，争取最早发出来。我每次去美国顶级的研究所，都觉得 suffocating and humbling（令人感到窒息和渺小）。我常常和学生说，只有在我们这种地方，大家悠哉悠哉的，做不出活，也不当回事。我学乖了，只做不热门的东西。” 北京大学饶毅回应在加州大学伯克利分校提交的这封邮件中，北京大学教授饶毅的名字也被提到。林帅亮在给杜德娜的求职邮件中称自己是饶毅实验室的学生。饶毅教授对自己突然被动卷入此事表示意外。他书面回答了所涉及的问题： 1）我印象林帅亮是PTN（北大、清华-北京生命科学研究所联合研究生计划）培养计划的研究生； 2）他应该是在我实验室轮转过，PTN的研究生第一学期不定导师，而是学生在三个实验室轮转，以后双向选择决定留哪个实验室； 3）2009年12月Moscou和Bogdanove在Science杂志（以Brevia的模式）发表一篇不到一页纸的TAL文章后，也许是2010年，林帅亮找过我，说这可以成为新的基因敲除技术。我当时印象很深，感慨国内的研究生现在可以对科学前沿这么敏感，从一篇Science都没成为正常article或report的短文，推出新的技术前沿，我反复思考觉得确实可能，但既然我们可以想到，其他人也可以，事实后来很多人追在后面发文章，我实验室完全没有凑这个热闹，但对林帅亮的学术是正面印象； 4）林帅亮当时与我实验室学生可能有些矛盾，与我没有矛盾，但对他有意见的学生超过一人，而且他们提出不能留他在实验室； 5）林帅亮申请张锋实验室，应该是要了我做reference（中文一般翻译成推荐人，英文可能还有评判者的意思），张锋当时应该是电子邮件或电话联系过我，我对林帅亮的学术潜力有正面评价； 6）好像林帅亮后来去的哈佛实验室老师Norbert Perrimon也问过我，不过这一点我记得不是很清楚，虽然Perrimon与我比较熟。 8月18日，林帅亮联系了饶毅，称自己现在不方便接受采访，但会在适合时候做公开说明。（生物谷Bioon.com）参考信息： 1.https：//www.technologyreview.com/s/602195/in-crispr-fight-co-inventor-says-broad-institute-misled-patent-office/？from=groupmessageis app installed=0 2.https：//www.statnews.com/2016/08/17/crispr-patent-battle/ 3.Moscou MJ， Bogdanove AJ (2009) A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors. Science 326：1501 4.Jinek M， Chylinski K， Fonfara I， Hauer M， Jennifer A. Doudna MA， Charpentier E (2012) A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337：816-821.; 个人分类: 科技|3405 次阅读|0 个评论

基因编辑-2016年不能错过的重大事件: 热度 1 xiang1838 2016-8-7 10:28; 作者：王小乐来源：生物医药行业动态（Biomed24）公司过去半年里，以 CRISPR/Cas9 技术为基础的，最出名的 3 家基因编辑公 Editas Medicine ， Intellia Therapeutics 和 CRISPR Therapeutics 分别在资本市场获得了骄人成绩， Editas 和 Intellia 成功 IPO ，登陆纳斯达克； CRISPR 顺利完成 B 轮 3800 万美元融资，并且获得拜耳 3 亿美元的投资。 Editas Medicine 融资市值： 2016 年 2 月， Editas Medicine 在纳斯达克（ Nasdaq ）成功 IPO ，融资 9440 万美元。以 2016 年 8 月 6 日股价计算， Editas Medicine 目前市值维持在 9 亿美元左右。关键人物：张锋、 Jennifer Doudna 、 George Church 目标疾病：勒伯尔氏先天性黑蒙 (LCA) 、血液类疾病、肿瘤免疫疗法（ CAR-T ）合作企业： Juno Therapeutics Intellia Therapeutics 融资市值： 2016 年 5 月， Intellia Therapuetics 在纳斯达克成功 IPO ，融资 1.08 亿美元。以 2016 年 8 月 6 日股价计算， IntelliaTherapuetics 目前市值维持在 7.24 亿美元左右。关键人物： Jennifer Doudna 目标疾病：甲状腺素蛋白淀粉样变性、α 1- 抗胰蛋白酶缺乏症、乙肝、血液干细胞移植、肿瘤免疫疗法（ CAR-T ）合作企业：诺华、 Regeneron CRISPR Therapeutics 融资市值： 2016 年 7 月， CRISPR Therapeutics 宣布完成 B 轮 3800 万美元融资。迄今为止该公司总融资额已达 1.4 亿美元。关键人物： EmmanuelleCharpentier 目标疾病：囊肿性纤维化、失明、血液病及先天性心脏病等合作企业：拜耳、 Vertex 技术革新 Cas9 酶是 CRISPR 基因编辑技术的关键点。 2015 年 Editas 的创始人张峰在著名杂志《 Cell 》刊登文章表示发现了比 Cas9 酶更具有优势的替代物 Cpf1 。半年以来， CRISPR 技术革新的焦点无疑是 2016 年 5 月由河北科技大学韩春雨团队刊登在《 Nature Biotechnology 》的研究成果：发现了 CRISPR 基因编辑技术中关键酶 Cas9 的替代物 NgAgo 。文章表示以 DNA 为导向的 NgAgo 酶比 Cas9 酶更具有优势，而且特异性更高。然而质疑声不断。澳大利亚国立大学的 GaetanBurgio 、西班牙国立生物技术中心的 LluisMontoliu 均表示无法重复该实验。 8 月 2 日，《 Nature Biotechnology 》发言人表示：“将按照既定流程来调查此事。” 各国政策和临床应用 CRISPR 基因编辑技术在为基因研究和疾病治疗带来便利的同时，也带来了巨大的伦理道德和安全性争议。 2015 年中山大学黄军领导的研究团队在《 Protein Cell 》上发表编辑人类胚胎的论文，引起了巨大争议。尽管如此，多数国家已经在有限范围内批准基因编辑的临床应用。 2016 年 2 月，伦敦 Francis Crick 研究中心的 Kathy Niakan 团队成功获得了英国人类胚胎和受精监管局 (HFEA) 科研监管许可。该团队将应用 CRISPR/Cas9 技术对健康的人类胚胎进行基因编辑。这是基因编辑领域的全球第一个国家级许可。 2016 年 4 月，日本生命伦理专门调查委员会宣布：允许日本相关机构在基础研究中“编辑”人类受精卵的基因，但出于安全和伦理方面的考虑，不允许将该技术应用到临床和辅助生殖中。 2016 年 6 月，美国国立卫生研究所（ NIH ）的咨询委员会批准了 Juno Therapeutics 公司的一项人体基因编辑临床试验。研究人员计划利用 CRISPR 技术编辑一名癌症患者的免疫细胞。同时，研究人员希望通过此次试验了解 CRISPR 技术在癌症治疗中的效果以及人体免疫系统对于来自于细菌的 Cas9 酶的免疫反应。这项试验目前还需要美国 FDA 和伦理委员会的批准。 2016 年 7 月，中国四川大学华西医院宣布获得医院伦理委员会批准，最快于下个月针对肺癌患者开展基因编辑治疗。该团队计划利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术修饰的细胞来治疗肺癌患者。此次试验有望成为全球首例 CRISPR 基因编辑人体试验。其他应用 2016 年 4 月，利用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术得到的工程化蘑菇已经在美国开始种植并且售卖。美国农业部目前并没有对这一行为进行管制。。这种新型的 CRISPR-Cas9 基因编辑蘑菇因为并不含有来源于病毒或细菌之类“植物有害生物”的外源 DNA ，因此不在美国农业部监管程序范围之内。这种被基因编辑过的白色双孢菇（ Agaricus bisporus ）获得了抗褐变的能力。在过去 5 年里，大概有 30 种转基因生物避开美国农业部监管系统的，其中很多都是利用基因编辑技术产生的。 CRISPR 被誉为和 PCR 技术同等分量的技术发明。该技术的三位核心人物张锋、 JenniferDoudna 和 Emmanuelle Charpentier 更是被视作诺贝尔生理学或医学奖的热门人选。 2016 年 3 月，三位大神与其他四位科学家同获加拿大盖尔德纳奖。但是围绕 CRISPR 技术专利的争夺战仍在继续，不排除三位大神以后法庭见面的可能。颁奖台见了，法庭再见的画面一定很美。; 4313 次阅读|1 个评论

【热点科普】五分钟看懂CRISPR/Cas技术: 热度 2 SciLondon 2016-6-10 12:21; 【热点科普】五分钟看懂CRISPR/Cas技术（ London-Science.com 原创，未经许可，禁止转载。原文： http://www.london-science.com/archives/220 ）前言 6月2日，Science杂志发表了关于CRISPR技术的突破性成果，确定了一个靶向RNA而非DNA的新型CRISPR系统特征。来自麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所、麻省理工学院、美国国立卫生研究院、罗格斯大学新布朗斯维克分校和俄罗斯Skolkovo理工学院的研究人员共同取得了这项研究成果，拥有“CRISPR/Cas之父”之称的著名科学家张锋也是这项研究的主导者之一。这再次让CRISPR技术成为了人们瞩目的焦点（最新论文PDF请见附件 abudayyeh2016.pdf ） CRISPR/Cas这项明星技术自问世以来，已经吸引了无数欢呼和掌声。在短短两三年之内，它已经成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具，并有近700篇相关文献发表。CRISPR/Cas技术的先驱者们，包括张锋以及两位美女科学家珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰，更是获得了众多荣誉和奖项。那么，获得科研人员们如此青睐的CRISPR/Cas技术究竟是什么？它的原理是怎样的？张锋博士的新突破又是什么？本文将带您快速了解CRISPR/Cas技术的原理与应用。 CRISPR/Cas技术是什么？ CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。在TALEN和ZFN的时代，科学家们往往要花费重金，把基因编辑工作交给生物公司。而现在，在实验室里，人们就可以使用CRISPR/Cas9技术轻松的实现基因编辑。 CRISPR/Cas9如何工作？ CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物质的“基因武器”。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列，分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。图1展示了完整的CRISPR位点的结构。其中，CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区（repeat）和间隔区（spacer）组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。而在上游的前导区（leader）被认为是CRISPR序列的启动子。另外，在上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated，Cas）。目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。图1：CRISPR位点结构图那么，CRISPR序列是如何与Cas蛋白配合来执行防御功能的呢？整个过程大体分为3步。 1.外源DNA俘获：“黑名单”登记简单来说，CRISPR/Cas系统在这一步实现了一个“黑名单登记”功能。序CRISPR/Cas系统将识别出入侵者的“名字”（PAM）并找到它的“身份证”（原间隔序列），然后把入侵者身份信息作为“档案”（间隔序列）记录到“黑名单”（CRISPR序列）中。图2展示了第一阶段的工作原理。当噬菌体病毒首次入侵宿主细菌，病毒的双链DNA被注入细胞内部。CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为外源DNA的“身份证”，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的CRISPR序列之中。因此，这段与间隔序列对应的“身份证”被称为原间隔序列（protospacer）。然而，“身份证”的选取并不是随机的。原间隔序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，被称为原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。病毒入侵时，Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描这段外源DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列。随后，Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。然后，DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。图2：第一阶段：外源DNA俘获 2. crRNA合成：”军火“制造战争总需要武器，CRISPR/Cas系统也要制造足够的”军火“来打击入侵者。目前的研究表明，CRISPR/Cas系统共有三种方式（Type Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）来制造”军火“。CRISPR/Cas9系统属于Type Ⅱ，是目前最成熟也是应用最广的类型。因此，图3将重点介绍CRISPR/Cas9的原理。当入侵者到来，CRISPR序列会在”指挥官“（前导区）的调控下转录出两种“军火材料”：pre-CRISPR-derived RNA (pre-crRNA)和trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中，tracrRNA是由重复序列区转录而成的具有发卡结构的RNA，而pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子。随后，pre-crRNA，tracrRNA以及Cas9编码的蛋白将会组装成一个小型“兵工厂”。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证”（间隔序列RNA），并在RNase Ⅲ的协助下对这段间“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。crRNA，Cas9以及tracrRNA组成的复合物，就是最终的“战斗武器”。图3：第二阶段：crRNA合成 3.靶向干扰：强大火力，精确打击武器已经制造完成，战争就要打响。图4展示了靶向干扰的过程。Cas9/tracrRNA/crRNA复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。随后，Cas9蛋白发起猛烈攻势，其HNH酶活性将剪切crRNA互补的DNA链，而其RuvC活性位点将剪切非互补链。最终，Cas9强大的火力使双链断裂（DSB）形成，外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。图4：第三阶段：靶向干扰如何应用CRISPR/Cas技术？ CRISPR/Cas是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切。但是，CRISPR/Cas9的应用也有一些限制条件。首先，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。其次，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。图5展示了最基础的两种CRISPR/Cas9技术应用。最基础的技术就是基因敲除。如果在基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。这样就可以实现基因的替换或者突变。对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用。除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。图5：CRISPR/Cas9技术应用张锋博士的最新突破是什么? 这是一项复杂的研究，但是我们简单来说，研究人员们发现了一个新兴CRISPR系统。事实上，除了CRISPR/Cas系统，CRISPR系统的类型众多。Cas9仅仅是其中一类作用蛋白，CRISPR序列理论上还可以跟许多其它蛋白共同作用。但是长期以来，这些系统并未被验证可以进行有效的基因编辑。CRISPR/C2c2就是张锋博士的团队最新发现的可以被用作基因编辑的CRISPR系统。图6展示了这个系统的工作模型。这个系统的突破性意义就在于它可以在RNA级别进行编辑，而不是传统的DNA级别的编辑。该系统基本的工作流程与CRISPR/Cas9类似，还是借助CRISPR序列的”黑名单“系统对入侵者进行打击。但是crRNA形成的方式与CRISPR/Cas9系统不同。C2c2蛋白会与成熟的crRNA复合，在不借助tracrRNA的情况下与外源单链RNA结合，crRNA则会与PFS片段（类似PAM）附近的互补区域杂交。最后，外源单链RNA会被剪切，其基因表达也会被沉默。然而，被剪切的外源RNA有可能会触发宿主细胞RNA的剪切，从而引入宿主细胞凋亡机制。这种只靶向作用于RNA并协助执行基因组指令的能力能够让人们特异性地和高通量地操纵RNA，以及更加广泛地操纵基因功能。这有潜力加快理解、治疗和预防疾病的步伐。张锋博士说，“C2c2为强大CRISPR工具的一个全新领域打开大门。对C2c2而言，它有大量的可能性，而且我们兴奋地将它开发为一种用于生命科学研究和医学的平台。” 图6：选自 C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Reference Cater, J. and Wiedenheft, B.(2015) .Snapshot：CRISPR-RNA-guided adaptive immune system. Cell.163(1): 260-260. Jackson, R.N., and Wiedenheft, B. (2015).A conserved structural chassis for mounting versatile CRISPR RNA-guided immune responses.Mol. Cell. 58, 722–728. Abudayyeh, O. O. et al.(2016). C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. aaf5573. 张锋Science文章：靶向RNA的新型CRISPR系统 http://www.ebiotrade.com/newsf/2016-6/201661155130939.htm 从基因编辑狗谈CRISPR/Cas9 http://www.bioon.com/trends/news/615569.shtml Ledford, H. (2015). CRISPR, the disruptor. Nature. 522(7554), 20-24.; 166921 次阅读|2 个评论

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