# 编者信息 熊荣川 明湖实验室 xiongrongchuan@126.com http://blog.sciencenet.cn/u/Bearjazz Here we present PhySortR, a fast, flexible R package for screening and sorting phylogenetic trees. The command-line package provides the quick and highly flexible sortTrees function, allowing for screening (within a tree) for “Exclusive” clades that contain only the target leaves and/or “Non-Exclusive” clades that include a defined portion of non-target leaves. Using simulated data, we assess the runtime of PhySortR based on the number of trees and the number of leaves within a tree, and demonstrate the potential of PhySortR in the analysis of multiple, large-scale empirical datasets. 在这里，我们介绍了 PhySortR ，一个快速，灵活的 R 包，用于筛选和分类系统发育树。该 R 语言包提供快速和高度灵活的树排序功能，允许筛选出（在树中）只包含目标末梢分类单元支系和 / 或包含所定义的非目标单元支系。利用模拟数据，我们根据树的数量和树内分类单元的数量评估了 PhySortR 的运行时间，并证明了包提供快速在复合大规模实际数据集分析中的潜力。 Stephens T G , Bhattacharya D , Ragan M A , et al. PhySortR: A fast, flexible tool for sorting phylogenetic trees in R . PeerJ, 2016, 4(5):e2038.
# 编者信息 熊荣川 明湖实验室 xiongrongchuan@126.com http://blog.sciencenet.cn/u/Bearjazz Phylogenomics increasingly involves the screening of thousands of phylogenetic trees using specialised sorting algorithms that assign phylogenetic trees a classification based on features of interest, e.g., strongly supported monophyletic relationships of taxa in question (i.e., the “target” taxa). Here, phylogenetic trees in flat files (e.g., Newick format) are sorted (i.e., classified) based on text-pattern matching. This principle is not to be confused with the tree sort process, common in computer science, of rearranging binary data elements in an ordered structure (Knuth, 1971). Currently available utilities, e.g., PhyloSort (Moustafa Bhattacharya, 2008) and SICLE (DeBlasio Wisecaver, 2013) screen a set of phylogenetic trees for the presence of clades that unite a set of user-defined target taxa (as indicated in tip labels, i.e., leaves, on the tree) based on clade support that exceeds a defined threshold, and sort these trees accordingly; SICLE (DeBlasio Wisecaver, 2013) specifically identifies all nearest neighbours (sister clades) of a single user-defined target. However, these tools do not consider the proportion of non-target leaves and overall taxon composition in a tree during the sorting process. Moreover, tools implemented in a graphical user interface e.g., PhyloSort (Moustafa Bhattacharya, 2008) do not allow for automation of multiple analyses, thus limiting scalability. 基因组系统学越来越多地涉及使用专门的算法筛选成千上万的系统发生树，这些分类算法根据感兴趣的特征（例如，强烈支持单系关系的 “目标”类群）为系统发生树分配一个类别。在这里，纯文本文件（如 newick 格式）中的系统发生树根据文本模式匹配进行排序（即分类）。这一原则不应与计算机科学中常见的以有序结构重新排列二进制数据元素的树排序过程相混淆（ Knuth, 1971 ）。目前可用的实用程序，例如， PhyloSort （ Moustafa Bhattacharya, 2008 ）和 SICLE （ DeBlasio Wisecaver, 2013 ），根据超过定义阈值的支系支持率，筛选出一组系统进化树，以确定是否存在一组用户定义的目标分类群（系统发育树末梢单元），并对其进行相应排序。 SICLE （ DeBlasio Wisecaver, 2013 ）还能够专门识别由用户定义的单个目标的所有最近邻居（姐妹群）。但是，这些工具在排序过程中不考虑树中非目标末梢的比例和总体分类单元组成。此外，在图形用户界面中实现的工具（例如， Physort ）（ Moustafa Bhattacharya, 2008 ）不允许实现自动化复合分析，从而限制了可扩展性（规模性）。 Stephens T G , Bhattacharya D , Ragan M A , et al. PhySortR: A fast, flexible tool for sorting phylogenetic trees in R . PeerJ, 2016, 4(5):e2038.
在 2015 年就要进入最后的一些日子时，中国药企传出很多负面新闻，尤其是大量临床项目因为涉嫌造假而被公示。【 1 】似乎，这片土地真的是神奇，没有一个领域不是陷入诚信危机？ 与此同时，大量国内药企花费巨资购买国外的临床项目未来在中国的市场开发权，期望着自己不做研究也能开发出新药，也许至少可以在动荡不安的股市中把股价再提上去。也基本是因为这个原因，在 2015 年，美国欧洲和日本一共推出二十多个新的分子（ NCE ）被监管机构批准进入市场的时候，中国所有药企里面被批准的 1.1 类新药只有一个预防类疫苗。 昨天，丁香园转载了一篇某个药物化学专家（路人丙）关于新药筛选的文章。【 2 】那是对 《 Nat. Rev. DrugDiscovery 》 上面 一篇最新评论【 3 】的评论。原文是来自跨国药企阿斯利康的几位研究员讨论如何在新药研发的早期优化小分子化学库，使得对每一个靶点的新药筛选都能找到有点苗头的化合物（ hit ）。 上世纪 90年代，高通量筛选（ HTS, highthroughput screening）曾经被认为是一个颠覆性的技术，那个技术的推广帮助不少新药研发项目快速地站在起跑线前面，也催生了很多让少数创业者发财的公司。不过，也许就像任何新的技术一样，对它的各种幻觉会带来对技术的滥用。实际上，各种组合化学公司一起制造了大量的垃圾化合物，因为那些化合物基本上是根据合成的难易而不断地玩排列组合游戏。然而，和疾病有关的靶点蛋白的氨基酸系列却不是随机的，其空间构建更是上帝他老人家根据所谓的遗传密码而精心勾画的一个个漂亮的 3D结构，那样才成就了生命的多样性和复杂性。后来，很多公司为 HTS投入血本却收获很小，让人对高通量筛选这一技术又深生疑虑。 时过境迁，文章【 3】讨论了近年来 HTS是如何又获得了新生。 “ Twenty-fiveyears on, we believe we are on the cusp of a new era in HTS, in which itstransformation from a ‘ numbers game ’to a smart selection tool will becom-pleted. This transformation is being driven by recent advances incomputational and medicinal chemistry, cell biology, biophysics andinstrumentation, which together could enable the design of bespoke screening libraries for each drug target that canbe tested in information-rich biophysical assays and advanced cellular models 。 ” 也就是说， HTS 不再是简单的数字游戏，【 4 】 而是利用计算化学和药物化学等专业知识对化合物库进行精心设计，然后在筛选的时候应用高内涵的生物分析技术以提高结果的精度和相关性。因此它包括库的设计和检查技术 2 个方面的提升。 丁香园转载的文章承认 HTS 对苗头化合物 (hit) 的发现会有很大的贡献，不过，作者认为 “ 如何把这些 hits 优化成药物超出现在的技术能力。 DNA 标记化合物库、针对天然产物的自动合成技术有可能会显著增加现有化合物数量和多样性，但也难以保证覆盖所有新靶点的配体化学空间。每个蛋白都有一个 hit 离我们还有一段距离 ” 【 2 】 他上面讲的是新药研发在 HTS 之后的一个阶段，即从苗头化合物（ hit ）到先导化合物 (lead) ，也就是如何把有点活性的分子经过优化使得活性大幅提高，选择性 ( 以避免潜在的毒害作用 ) 大大提高，还有水溶性，代谢稳定性，药代性质等等。那基本上就是药物化学这个学科的内容。而充分地利用计算机辅助药物设计（ CADD, computer-aided drug design ）这一技术，才能使得药物设计变得更加合理， rational 。这就需要有非常优秀的计算化学家，通俗地说就是懂得化学又会玩电脑。专业地说，就是有一定的有机化学知识（合成难易，化学稳定性），药物化学知识，理论化学基础，蛋白结构 3D 的直觉，等等。 大约一个月前，我参加了在中山大学举行的全国计算化学会议。会议中有至少 1/3 的报告是关于药物设计的。这个倒不奇怪，奇怪的是我竟然成了唯一的来自制药公司的报告人。 在美国， CADD 的绝大部分工作和会议报告都是来自制药公司，因为那是非常实用的技术。那为什么CADD在国内的高校 这么火爆，而在工业界却如此冷清。 这也许折射了国内新药研发的一个现状，即很多的早期研发依旧停留在学术界。制药公司虽然有钱也任性不断地购买国外的临床项目，但是真正的新药研究工作可以说是非常的罕见，基本限制于一些跨国药企在国内的分支机构和研发外包公司（ CRO ）。当然，也有一些新兴的生物技术公司，他们往往由有经验的海归专业人士创立，也可能会效仿国外，利用 CADD 等技术从事真正的新药研发。不过，投资者的普遍短视和新药研发的风险，也可能使得很多创业者不得不局限于对国外的专利化合物进行有限的 Me-Too 般的修改，以期望利用国内的优惠政策和廉价资源而搭上新药研发的快车。另一方面，相比化学合成， CADD 人士在美国的就业市场相对良好。这一领域国内罕见优秀人士，外包不现实， 使得国外公司很少会外包这方面业务。也就是说，能够海归的 CADD 人士非常少，这就不利于国内这一领域的发展。要改变这个局面可能主要还得靠自身人才的培养，尤其是学术界和工业界的良好互动。 HTS是个需要大量投资的领域，基本不太适合国内的绝大多数药企，而CADD的投入相对较少，其有效应用也可能避开HTS那个过程，值得国内同仁考虑。 参考资料 【 1 】 http://www.bjnews.com.cn/news/2015/11/13/384159.html 【 2 】 http://news.bioon.com/article/6676285.html?from=timelineisappinstalled=1 作者路人丙，经常出台精彩文章 http://www.yypharm.com/?author=8 【 3 】 http://www.nature.com/nrd/journal/vaop/ncurrent/full/nrd.2015.19.html 【 4 】注：新药发现通常被认为是草堆里面找针，而早年的 HTS 好像是把草堆放大，合成的分子总数大大增加了，而没有大量合成那些潜在的有希望的分子。
为了最大化提升建筑防火能力，最大程度降低火灾损失，有必要对建筑消防体系中各环节进行拆分与解析，从中找到最理想的切入点，有的放矢。 如下图所示：消防体系可分为设施管控、自动系统、人工灭火、消防救援4个环节，从其中任一块深挖下去，似乎都大有文章可作。综合借用孙子的战略思想及扁鹊的医术思想，可以理清该体系中的前后层次关系。 A. 设施管控不力→火险隐患（疾在腠理） B. 自动系统不力→初始火灾（疾在肌肤） C. 人工灭火不力→扩大性火灾（疾在肠胃） D. 消防救援不力→灾难性火灾（疾在骨髓） 将上述4个选项看作一道选择题，采用排除法进行推理，考虑经济性和可操作性，尝试为消防改良筛选1至2个最佳着力点： A. 建筑布局不合理、火灾荷载大、防火间距不够、设施密集老化、基础设施不完善、消防通道堵塞之类先天不足的因素，若要改造起来似乎是海量。 D. 按照发达国家比例和标准配备相应的消防员以及救援装备，全面提升数量和质量，短期看来不现实，部分区域受制于地形条件，高端救援设备即使到现场也难有用武之地，时间滞后更是无法回避的“软肋”。 A 和D受到经济等诸多因素的制约，改善空间受限。剩下的B和C尽管同样也面临海量的问题，但是只要有一种经济且简易的技术，聚焦初始火灾，借力于同样海量的人群，通过思维方式指导行为方式的转变，则有望实施改良。 由下图不难看出：全面均衡地进行投入，A、D由于基数大，不仅费时费力，效果亦无法凸显，B和C则共同形成了这个“最佳着力点”，如果集中经由这个“关键点”发力，不仅可以大幅阻断小火成灾，反过来还可以促成A和D的良性循环。 综上所述，尽管原本4个环节都具备改善空间，但是结合可行性、可操作性、 整体经济性、 效益最大化等现实因素考虑，B和C为最佳突破口，只要方式运用得当，着重从这里入手，则实际效果会立竿见影，牵一发而动全身。 相关阅读： 以扁鹊的眼光看现代消防 消防的本质是降低成本 用《孙子兵法》解读消防
Journal club的第一次seminar，我负责四个杂志（Nature Biotechnology，Chemical Science，Molecular BioSystems，ACS Synthetic Biology），这次主要讲的是发表在《自然-生物技术》上的 Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance（通过筛选抗生素抗性鉴定抗生素产生菌）题目摘要全文链接见文后。 通过利用抗生素产生菌的自身保护机理，富集能够产生与该抗生素相关的化合物的细菌库。利用这种以抗性筛选为基础的分离方法，通过糖肽类（万古霉素）和安莎类抗生素（利福平）抗性筛选，发现抗生素产生菌的比率比传统的以活性为导向的筛选(表型筛选)和宏基因组文库筛选的方法增加了3-5个数量级。而且他们还介绍了一种以进化树为基础在筛选过程的初期能够预测或发现新骨架化合物的去重复（dereplication）方法。利用抗性筛选和进化树去重复，他们发现了一种新的万古霉素类化合物。 虽然利用抗生素抗性筛选分离抗生素产生菌在很早前就使用过，但是分离抗生素的目标不明显，比如用一些抗生素分离稀有放线菌，然后在利用 传统的以活性为导向的筛选(表型筛选)发现有活性菌株 ，导致重复筛选，很难发现新型 的活性物质。本文系统的利用抗性选择的方法富集抗生素产生菌，并且结合该已知抗生素的生物合成基因簇设计兼并PCR验证生物合成基因，而且创新性的利用PCR扩增出的产物构建进化树，可以将最后产生的化合物归类，避免重复发现，加快去重复过程。而且，利用这种方法筛选到的产生菌具有合成改该类抗生素的生物合成基因，但是在实验室的普遍培养条件下，该抗生素的产量很低或者没有，因此抗细菌活性就会很低或者没有，这些菌就很有可能在 经典的以活性为导向的筛选(表型筛选)中被忽略掉。 不足之处在于，利用这种方法富集产生菌只能得到一些跟改抗生素结构类似的化合物，很难发现新型新类的抗生素。同时也忽略掉了对改抗生素敏感的细菌，它们也有很大的产生活性化合物的潜力。 以前日本的一个学者Ochi利用选择抗生素抗性的方法，能够提高链霉菌中某些化合物的产量，甚至激活某些沉默基因簇产生新的化合物，他们将这种方法称为‘核糖体工程（Ribosome engineering）’。当年度硕士的时候，我的师姐们也用这种方法发现了一些活性物质，但是离开后一直没见文章发表。最近的关于核糖体工程的综述发表在Hopwood大牛的专刊J Ind Microbiol Biotechnol (2014) 41:403–414上（全文链接 http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10295-013-1349-4 ）。 另外还有一个文章也是发表在 《自然-生物技术》上Antibacterial discovery in actinomycetes strains with mutations in RNA polymerase or ribosomal protein S12 Nature Biotechnology 27 , 462 - 464 (2009) Published online: 26 April 2009 | doi:10.1038/nbt.1538。（全文链接 http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n5/abs/nbt.1538.html ） Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance Maulik N Thaker , Wenliang Wang , Peter Spanogiannopoulos , Nicholas Waglechner , Andrew M King , Ricardo Medina Gerard D Wright Nature Biotechnology 31,22–927(2013)doi:10.1038/nbt.2685 Received 18 March 2013， Accepted 07 August 2013， Published online 22 September 2013 Abstract Microbially derived natural products are major sources of antibiotics and other medicines, but discovering new antibiotic scaffolds and increasing the chemical diversity of existing ones are formidable challenges. We have designed a screen to exploit the self-protection mechanism of antibiotic producers to enrich microbial libraries for producers of selected antibiotic scaffolds. Using resistance as a discriminating criterion we increased the discovery rate of producers of both glycopeptide and ansamycin antibacterial compounds by several orders of magnitude in comparison with historical hit rates. Applying a phylogeny-based screening filter for biosynthetic genes enabled the binning of producers of distinct scaffolds and resulted in the discovery of a glycopeptide antibacterial compound, pekiskomycin, with an unusual peptide scaffold. This strategy provides a means to readily sample the chemical diversity available in microbes and offers an efficient strategy for rapid discovery of microbial natural products and their associated biosynthetic enzymes. 全文链接：http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n10/full/nbt.2685.html
摘要： 构建生产细胞系是重组抗体产业化制备的第一步。目前国际上用于重组抗体生产的工程细胞系表达水平可达20-70 pg/c ell /day pcd。多种动物细胞根据其特性的不同，在抗体药物生产中有着不同的应用。近年来，工程细胞系构建技术的研究进展主要集中在以下三个方面：利用 “ 细胞工程 ” 技术提高宿主的生长、表达能力，新型载体功能元件和定点整合技术克服载体随机整合时发生的“位置效应”，以及应用流式细胞分选术和高通量筛选机器提高了重组细胞的筛选通量和效率。 关键词： 重组抗体；细胞构建；载体元件；筛选策略 近年，随着宿主细胞遗传特性的改造，载体功能元件的优化，以及高通量克隆筛选技术的发展， 国际上用于抗体生产的工程细胞系表达水平可达 20~70 PCD(pg/cell/day) 。业内完成稳定细胞系的构建时间也缩短至 3~6 个月 。生产细胞系的构建是重组抗体产业化制备的第一步。 作为抗体产业上游关键技术，如何快速、高效建立生产细胞系，是我国抗体产业发展中急需解决的 共性问题 。 1 用于抗体生产的工程细胞系构建流程 抗体分子具备四聚体糖蛋白的复杂分子结构，其胞外表达又遵循着“分泌蛋白”的一般规律：全抗体分子的轻、重链各自翻译后，经折叠、组装，糖基化修饰后才具生物活性。 通过对 已上市抗体的临床研究也表明 发现 ，宿主细胞对重组抗体的“翻译后修饰”，直接影响到抗体药物的临床疗效和免疫原性 。 在常用的异源蛋白表达系统中： 大肠杆菌不适合 表达 全抗体分子，只能表达单链抗体或者抗体片段；酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物等由于缺乏翻译后修饰能力，其所表达的重组抗体与人天然抗体存在着显著的质量差异。只有哺乳动物细胞适宜重组抗体的异源 人源抗体的 表达。因此，目 前已上市的治疗性抗体中，除了少数抗体片段（如： Lucentis TM ）外，均由哺乳动物细胞生产 。 1.1 用于抗体药物生产的宿主细胞 哺乳动物细胞中，CHO、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞、PerC.6、HEK293等均有用于重组抗体生产的实例（见表1） ，这其中CHO、NS0及sp2/0细胞由于具备相对成熟“平台化开发技术” ，在重组抗体生产中 应用 较为广泛。上述 不同 动物细 胞 的 生长、代谢特性 以及 对重组抗体的表达、修饰能力也不尽 均不 相同。CHO、NS0,sp2/0均可产生非人源的糖基化修饰。如：sp2/0生产的 Cetuximab 因含非人源“ α (1,3) 半乳糖结构 ” 造成临床上出现过敏反应 等 。 表1 用于表达抗体的宿主细胞特性与应用 Table1 the characteristics of various animal cells and cases in commercial antibody production 细胞系及来源 优点 缺点 在抗体生产中的应用 CHO DHFR – （ ATCC CRL-9096 ） CHOK1 遗传背景清晰，产业化应用广泛。 非人源糖基化修饰（如： NeuGc 型唾液酸，高甘露聚糖等） 上市抗体： Avasti TM n, Campath TM , Herceptin, TM Humira TM ,Raptiva TM ,Rituxan TM , TM Vectivbix, Xolair TM , Zevalin TM ， Tocillizumab TM 等 NS0 （ ATCC CRL-1827,-2695, -2696 ） 缺乏内源性谷氨酰胺合成酶，更适合 GS 筛选体系 培养过程需添加外源胆固醇；非人源糖基化修饰如：α (1,3) 半乳糖结构 上市抗体： Mylotarg TM , Soliris TM , Synagi TM s, Tysabr TM i,Zenapax TM 等 Sp2/0 （ ATCC CRL-2016 ） 能够无血清悬浮培养 非人源糖基化修饰：如（α (1,3) 半乳糖结构 上市抗体： Erbitux TM , Remicade TM , Reopro TM , Simulect TM 等 Murine Hybridomas 鼠杂交瘤技术成熟 多用于表达鼠源抗体 上市抗体： Bexaar TM , Othoclone TM 等 Perc 6 （ Crucell 公司） 人源细胞，借助病毒载体可实现 重组抗体的 高表达。 需 受 Crucell 公司授权 许可 使用 14 种候选药物处于临床研究阶段 ECo li 技术成熟，培养成本低 只适合表达抗体片段 上市抗体： Lucentis TM GlycoFi （ Merck 公司） 具备 均一的 糖基化修饰能力，生产成本低 需 Merck 公司授权 许可 使用 能够成功表达 糖基化高度均一的 IgG HEK-293 （ ATCC CRL-1573 ） 人源细胞，瞬时转染技术成熟 受培养规模、工艺路线所限，不适合产业化生产 适合 快速 制备 mg 级样品。 1. 2 “工程细胞”的概念与构建流程 用于抗体药物生产的 “ 工程细胞 ” 系需具备以下特性：生长特性良好，无血清悬浮培养密度高（ 1~2 × 10 7 cell/ml ）；异源蛋白表达能力强（ 20~70 pg/cell/day PCD ），具备正确的翻译后修饰能力；宿主及重组细胞系遗传背景清晰、表型稳定，符合相关法规要求。 目前，业内细胞系构建中常用的筛选体系为 “ Dhfr- ” 和“ GS ”系统，基于此技术的工程细胞构建流程如下：携带有目的基因和筛选标记（ Dhfr 、 GS ，或其他抗性基因 ，如： neo 、 hygro ）的质粒转染至宿主细胞后，使用相应的条件培养基筛选出重组细胞。为提高重组细胞的表达水平，可采用加压多轮筛选的策略，增加目的基因拷贝数。初筛得到的候选克隆，经悬浮、无血清驯化后，在反应器中对其生长能力、表达水平，产物质量综合评价，选择具有产业价值的细胞系冻存 。最终，建立符合 cGMP 要求的主细胞库 （ M aster Cell Bank ） 、工作细胞库 （ Work ing Cell Bank ） 。 2 细胞工程技术在宿主改造中的应用 细 胞工程（ cell engineering ）技术可以通过对宿主细胞进行遗传改造，来提高工程细胞系的生长能力、表达水平，满足抗体药物对于产能、质量的要求 。近年来，此方面研究进展日新月异，甚至已经开始改变了上述（表 1 ）宿主细胞的遗传特性。如敲除 GS 基因的 CHO 构建完成 ，更适合 GS 筛选系统；化学诱变筛得到不依赖胆固醇的 NS0 细胞系 ；导入抗凋亡基因的 Sp2/0-Ag14 更适合无血清培养表达重组抗体 ，等。 2.1 提高细胞的生长能力 、抗凋亡能力 为提高细胞的生长能力，可过度表达抗凋亡基因。如： NS0 和 CHO 细胞过度表达 Bcl-2 ，可以抑制细胞线粒体凋亡途径 ； CHO 细胞中过度表达 P21 、 P27 ，，可使细胞生长周期停滞在 G1 期 ；通过过度表达 E1B-19K 、 Aven 基因 ，或热激蛋白 ，牛磺酸转运蛋白 等， 也 能显著提高细胞活性、延长培养周期。 为降低细胞培养过程中的副产物，对副产物代谢过程中的关键基因进行操作。如：通过上调细胞的丙酮酸羧化酶基因，下调乳酸脱氢酶基因，来减少乳酸的产生 ；通过过度表达尿素循环酶、氨甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酸基转移酶等，来减少氨的生成 。 2.2 提高重组抗体的翻译、修饰及分泌能力 对 多于多数重组细胞而言，翻译、修饰及分泌是抗体的生物合成过程的限速步骤 。因此，可以对 参与 目的蛋白生物合成的分子伴侣进行遗传操作， 以 也可提高宿主细胞的重组抗体表达能力。此类分子伴侣包括：蛋白质二硫键异构酶（ protein disulfide isomerase ） 、内质网氧化还原酶（ Endoplasmic reticulum oxidoreductase ） 、重链结合蛋白（ the heavy chain-binding protein ）、 ERp57 ， GRP94 、 X- 盒结合蛋白 1(XBP-1S) 等 抗体的糖基化修饰对其生物活性影响显著 ，利用细胞工程技术对宿主的糖基化修饰能力进行改造，可以提高重组 抗体的 临床疗效。如： 通过 敲除岩藻糖转移酶（ FUT8 ），或过度表达乙酰氨基葡萄糖转移酶（ GnT-III ），可降低重组抗体糖链中的岩藻糖含量，以提高抗体药物的 ADCC 效应功能 ； 通过 过度表达唾液酸转移酶，提高抗体的唾液酸含量，以提高抗体的抗炎活性 等。 3 高表达载体的构建与优化 在用于 重组 抗体的表达的载体构建过程中，目的基因的简化 、轻重链比例优化 ，顺式作用元件的应用等，都能提高重组抗体的表达水平。这其中载体的构建策略与载体的功能元件，对于细胞的表达能力、遗传稳定性影响最为显著，也是此领域研究的热点。 3.1 用于全抗体表达的载体构建策略 生物合成四聚体 IgG 结构，需要协调表达抗体分子的轻链、重链基因。以下三种载体构建策略均有用于抗体表达的报道 。 3.1.1 单顺反子（mon-cistronic）载体 轻链、重链基因分别使用不同的载体，共转染至宿主细胞。该策略对质粒要求不高，且转染效率较高，是表达重组抗体最为常用的载体构建策略。也可将轻链基因、重链基因串联到同一载体，分别使用各自的启动子、终止子转录翻译，该方法 在 理论上可实现轻链、重链基因的等摩尔表达。 3.1.2 双顺反子（bi-cistronic）载体 在载体构建中使用核糖体内部进入位点 （ IRES ） ，在其两端串联轻链、重链基因，可实现轻、重链基因同时转录。也可在载体中使用 2A 肽结构，在同一阅读框架内表达氢、重链基因。 3.1.3 反式互补（trans-complementing）载体 表达轻链、重链的两个载体分别含有编码筛选标记 Dhfr- DHFR 基因的不同序列。只有当含有轻链、重链的两个载体同时转染至宿主细胞时，筛选标记 DHFR 才能正确表达。以此提高重组细胞的筛选效率。 3.2 载体功能元件的最新进展 常用的表达载体依靠随机整合至宿主基因组中来表达目的基因。整合位点的“位置效应”往往会造成目的基因的低表达或沉默。近年，出现的多种商品化的染色质开放原件（ STAR™ 、 EASE™ 、 UCOEs™ 、 MARs™ 等 ），人工染色体（ ACE ™ ）、逆转录病毒载体（ GPEx™ ），定点整合技术（ Flp ‐ In ™ 、 RMCE TM 、 CompoZr TM 等 ）等，能够克服上述随机整合的缺点。载体构建中引入这些功能元件，可大幅提高高表达克隆的比例，缩短工程细胞系的构建周期。（见表 2 ） 表2 用于重组抗体表达的载体功能元件 Table2 The vector element for recombinant antibody expression 元 件 公 司 作用原理 STAR™ (Stabilising and antirepressor elements) Crucell 富含 A/T 碱基，起到绝缘子效果，克服整合位点的位置效应。 EASE™ (Expression Augmenting Sequence Element) Amgen 3.6kb 顺式表达作用元件，促进目的基因整合至染色体 UCOEs™ (Universal chromatin opening elements) Millipore 2.5–8 kb ，配合启动子 hCMV 使用，防止异染色质的形成 MARs™ (Scaffold- matrix associatedregions) Selexis 富含 AT 核苷酸序列，促使染色质开放 Flp ‐ In ™ Invitrogen 目的基因定点整合至转录活跃区，适用于 CHO 细胞 CompoZr TM sigma 基于锌指酶的定点整合技术 RMCE TM (recombinase-mediated cassette exchange) 重组酶介导的定点整合技术 GPEx ™ GALA Biotech 基于逆转录病毒的新型载体 ACE ™ Chromos molecular systems inc 人工染色体 Promosome TEE ™ Promosome technology 翻译增强子 3.3 大规模瞬时转染技术的发展 瞬时转染技术由于目的基因不需要整合到宿主的基因组中， 目的 基因 的 拷贝数和转染效率均较稳定转染明显提高。该技术可短时间内内 （一般为 数周 ） 可积累mg ～ ~g级的样品，更适用于抗体药物研发的早期阶段。随着大规模瞬时转染技术的发展，瞬时转染的最大生产规模 可达 为100L。 瞬时转染的大规模培养工艺中对质粒需求量很大（1 ～ ~1.25ug/ml）。由于其工艺复杂、成本较高等原因，限制了该技术在抗体药物的产业化生产中的应用。 4 克隆筛选技术的发展趋势 克隆筛选环节需要筛选出重组细胞并将其单克隆化，传统的有限稀释法耗时、费力，筛选通量低，往往是稳定细胞系构建的限速步骤。近年来，在克隆筛选手段上出现了标记高表达克隆和高通量筛选机器等技术。 。 借助流式细胞仪进行细胞分选 ，或使用自动机器挑选克隆 ，都能显著提高克隆筛选的通量和效率。此外， 在克隆筛选策略上，利用微型反应器和毛细管电泳技术，可以在克隆筛选环节，对细胞系的表达水平、生长能力 ，产物质量进行综合评价。这样就避免了单纯以目的蛋白表达量为依据，忽视候选克隆细胞系在反应器中的表现、产物质量等问题。 4.1 基于流式细胞仪的细胞分选术 流式细胞仪细胞分选术 ， 利用 根据 流式细胞仪通过对单个细胞所激发的荧光强定量检测来实现细胞分选。它可以对单个细胞进行多参数测定，筛选通量也提高至 10 6 。为了标记出高表达克隆，该方法必须与指示蛋白、荧光标记等技术联合使用 。如，重组抗体的轻、重链基因分别连接不同的荧光蛋白（ eYFP 、 eGFP ），共转染细胞后，利用流式细胞仪根据两种荧光强度进行细胞分选。选取荧光强度最高的 1% 的细胞，其抗体的平均表达水平提高 44 倍 ；利用荧光标记的氨甲喋呤与胞内四氢叶酸还原酶的定量结合，可以筛选出 dhfr 基因拷贝数较高的细胞 ； 也可 利用“俘获抗体”将细胞分泌的抗体固定在细胞表面。再使用标记有荧光的检测抗体，借助流式细胞仪分选出高产细胞株 。 4.2 用于克隆筛选的自动筛选机器 激光分析过程系统（ Laser-enabled analysis and processing ） 利用细胞分泌蛋白形成的图像确定克隆表达水平，并使用脉冲激光清除低表达克隆。其他自动筛选机器（如 ClonePix TM ， CellCelector TM ， Cello TM ）根据细胞在半固定培养基中形成的斑点大小，对细胞的表达能力与生长特性进行评价实现自动分选 。 5 展望 上世纪九十年代发展起来“基因共扩增”技术，已经在稳定细胞系构建中得到广泛的应用。但是，在此后的 近年的 产业化实践发现 ，基于此原理的的 Dhfr 、 GS 表达系统普遍存在着重组克隆差异性大、表型稳定性差等问题。通过 对重组细胞的目的基因拷贝数、 mRNA 、基因整合位点进一步发现：重组抗体的表达水平与基因拷贝数并不总是正相关。过多的外源基因拷贝数会导致重组细胞代谢负荷加大，生长能力减弱。此外，基因插入位点的“位置效应”，宿主的转录、翻译能力，也会影响重组抗体的表达水平。 目前，最新的克隆筛选策略开始尝试以轻、重链 mRNA 水平为指标，预估重组细胞的表达水平、质量差异 。。 此外，近年来对高产细胞系的转录组、蛋白组、代谢组的研究发现：重组细胞表达异源蛋白能力的高低，不能简单的归结为若干个关键基因的作用。成就一株高产细胞系，往往是细胞的能量代谢、氧化还原电位、生长能力，蛋白加工能力等诸多特性，以网络的形式综合作用的结果 。对高产细胞的组学研究，加深了业内对动物细胞表达异源蛋白机制的认识。可以预见：组学技术的前瞻性指引，结合宿主细胞遗传改造，以及高通量筛选技术的应用，将是未来高产细胞系构建工作的发展方向。 Jostock T. 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Many industrial cases of various animal cell lines as host cell were summarized, accounting to their different attributes. Furthermore, the latest technology progression of cell line developments was introduced, as follows: Cell engineering technology ensured the host cell with robust growth and high productivity; The New vector element and site-directed integration technology contribute to overcoming the “position effection” by random integration. Lastly, the application of cell-sorting by flow cytometer and automatic screening device have remarkable improved the efficient and throughout of recombinant cell line screening, etc. Additionally, the phenotypic variation and instability of cell line and the technological trend in this field are also discussed. Keywords: Recombinant antibody; Cell line development; Vector construction; Screening strategy * 国家 973 项目（ 2012CB724502 ）资助
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