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进入三维超分辨：GB-STED: 热度 3 xipeng1 2016-1-18 09:36; 进入三维超分辨： GB-STED 席鹏 2016-01-14 前面的博文里面我讲过了 STED 这一诺奖技术。该技术的核心是，用一束光制造一个空心光环 ---- 老外叫做 ” 甜甜圈 donut“ （老外咋那么多吃货呢）。有了这个 donut 光，将它套在原来的高斯 PSF 上，利用受激辐射作为擦除机制，即可实现把荧光的 PSF 缩小，也就提高了分辨率。问题是，要想实现空心光环，特别是要越小越好的空心光环，绝非易事。目前，通常的做法是用一个 0-2 π 的位相调制器，结合圆偏振光进行。这样的话： (1) 对于光学上来说， 2 π 的位相调制就回到了 0 ，因此是一个螺旋式上升的连续结构； (2) 这一位相调制无论从哪个角度剖开，都是一个 0- π 的台阶。由于从透镜前端到焦点刚好是一个傅里叶变换：我们可以看到，当 u=0,v=0 时，中心就是对于所有这些复振幅的积分或求和。由于 , , 这两者刚好相互抵消，因此中间的极大值变成了极小值，形成了非常美丽的面包圈结构。图 1 STED 通常 0-2 π 采用涡旋位相光栅实现 donut 。这一看似美丽的数学解有一个脆弱的地方：对于生物成像，样品会带来新的位相调制。由于生物细胞中，所有细胞器的折射率分布变化大和散射特性不同，导致它们对每一个角度的位相都会产生影响。这个扰动一旦变大， donut 中心就不再为零， STED 将会擦除 PSF 的中心地带，导致分辨率不但不能有效提升，甚至可能会变差。一句话， donut 不零， STED 不灵。这也是为什么大家看到很多漂亮的 STED 的成像结果，但都是二维图像的原因。而另一方面，人们研究了一些抗干扰的光束，如 Bessel 光， Airy 光等，并将其应用在光片成像、 OCT 等领域。 Bessel 光的核心是，通过一个 axicon 对高斯光束进行调制，可以实现一个针状的光分布，且这一针状光斑经过样品时，不会受到样品折射率变化的干扰。图 2 Bessel 光束调制原理。中心区域通过干涉增强实现了抗干扰的 Bessel 光。由于 STED 最怕干扰的是中空 donut ，在此条件下，我们把 axicon 和涡旋位相波片结合起来，实现了一个中空的竹子状光束。这一光束同样具有 self healing 的效果。图 3 Gaussian-Bessel STED 焦点分布示意图。接下来的工作就豁然开朗了：我们在琼脂样品上测试分辨率，发现在 155 微米的深度，我们能够达到和表面同样的分辨率。我们尝试了折射率失配的 PDMS 样品，发现能够达到 100 微米深度的超分辨。最后，我们制作了一个类脑白质的仿体，发现能够达到 100 微米的穿透深度，实现超分辨。在过去，很多超分辨的工作受限于样品散射等因素，被局限在二维世界；能研究的样品只有一些细胞，和非常浅层的脑成像。我们希望通过这一技术，实现深层的组织超分辨成像。相关成果被 Laser Photonics Reviews 作为 2016 年 1 月的封面文章发表。北京大学物理学院施可彬课题组的于文韬同学为本文第一作者，施可彬研究员和席鹏研究员为共同通讯作者。该工作得到了 973 国家重点基础研究发展计划和国家自然科学基金委的支持。 Wentao Yu et al, Super-resolution deep imaging with hollow Bessel beamSTED microscopy, Laser Photonics Reviews, 10, 147 – 152, 2016. 相关链接： http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lpor.201500151/abstract; 个人分类: STED|11086 次阅读|3 个评论

诺奖STED能看到什么？: 热度 2 chensing 2014-10-9 08:28; Stimulated emission depletion ( STED ) microscopy图像：看看线粒体：线粒体在一般光学显微镜下就是一个小点或短棒，在共聚焦下（B）仍然是模糊的，但在STED下，哈！ STED microscopy enables the analysis of submitochondrial protein distributions. ( A ) Mitochondria form a branched network within eukaryotic cells. The mitochondria (green) and the microtubule cytoskeleton (red) of PtK2 cells were labeled with antibodies specific for Tom20 and α-tubulin. The nuclei were labeled with DAPI (blue). (Scale bar: 20 μm.) ( B ) Mitochondria of PtK2 cells labeled with an antiserum against Tom20. STED microscopy ( Right ) reveals individual Tom20 clusters, which are blurred and not resolvable when using diffraction-limited confocal microscopy ( Left ). (Scale bar: 2 μm.); 8493 次阅读|4 个评论

有感于超分辨获得2014诺贝尔化学奖: 热度 30 xipeng1 2014-10-8 19:11; 早上 5 点半，在美国出差的我收到学生发来的消息，超分辨率显微获得 2014 诺贝尔化学奖！心情激动得让我几乎是从床上跳到电脑前，写下这些文字。中国有句古话：十年磨一剑。这句话对于 Stefan Hell 来说，是两倍的考验。 1994 年，他发表了第一篇 STED 的文章。在接下来的 5 年里，由于方法太过于前卫，导致很难被主流学界认同。而且搭建实验的难度超过公认较难的共聚焦几条街。可以想象，是怎样的意志，让一名科学家在寒风中，百折不挠，终折桂枝。对于 Eric Betzig ，又何尝不是如此。从贝尔实验室出来进入父亲的公司，一别科研 10 年（ http://blog.sciencenet.cn/blog-499502-586605.html ）。随后，和好伙伴 Harold Hess 及 Jennifer Lippincott-Schwartz 一起，在家里搭光学平台做实验。关于 Moerner ，我了解不多，随后会写更多关于他的科普，敬请关注。可惜，我认为有另外两个人对此领域做出了同等重要的发现，然而没能获奖。 Gustafsson 是因为英年早逝。而庄小威没能获奖，我大感意外。要知道大家一般都是写 PALM/STORM ，而 STORM 是庄小威发明的，在同一时间。 EricBetzig, George H. Patterson, Rachid Sougrat, O. Wolf Lindwasser, Scott Olenych,Juan S. Bonifacino, Michael W. Davidson, Jennifer Lippincott-Schwartz, HaraldF. Hess, “Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution”,Science 2006 Vol. 313 no. 5793 pp. 1642-1645 (Received for publication 13 March 2006. Accepted forpublication 2 August 2006. ） Rust, Michael J., Mark Bates, and XiaoweiZhuang. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic opticalreconstruction microscopy (STORM). Nature methods 3.10 (2006): 793-796. (Received 7 July; accepted 31 July; published online 9 August 2006) 庆幸的是，我在 2009 年有幸追随 Stefan Hell 学习 STED ， 2010 年回国建立国内首套 STED( http://news.sciencenet.cn/htmlpaper/20126281046454225044.shtm) ，在超分辨领域做出一些工作。可惜的是，目前我用的经费仍是北大的科研启动经费和基金委的一个面上，在这个竞争白热化、比拼科研烧钱度的领域，深感资金压力。但是，既然 5 年前我被这一领域深深吸引，我就将在这一领域钻研下去，再接再励，踏着前人的脚步，不断前行。我翻了翻我的博客链接，有一些有意思的，再给大家分享一下：如何实现光学超分辨： http://blog.sciencenet.cn/blog-499502-573091.html STED ： http://blog.sciencenet.cn/blog-499502-573771.html PALM ： http://blog.sciencenet.cn/blog-499502-586605.html STORM: http://blog.sciencenet.cn/blog-499502-581950.html SIM: http://blog.sciencenet.cn/blog-499502-595570.html 席鹏实验室: http://bme.pku.edu.cn/~xipeng/news.htm 赛先生的评论： http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA3OTgzMzUzOA==mid=200920471idx=1sn=5dd8b9fc3537c30e8efbc00c27a9c866#rd; 个人分类: STED|37071 次阅读|43 个评论

如何实现光学超分辨（四）: 热度 2 xipeng1 2012-6-12 06:51; 如何实现光学超分辨（四）席鹏著第四章 RESOLFT 删繁就简二月花前面两篇中，我们讲到了利用 STED 进行先激发再擦除，或者利用 GSD 进行先擦除再激发，均可实现超分辨率显微。它们的本质是什么？有没有别的渠道？上图展示了 STED 的能级，其中，我们要做的，就是区别红箭头（受激辐射）和黄箭头（自发辐射）。既然如此，把红箭头掰到方向跟黄箭头相反，更容易区分。实验上，完全可以让粒子在激发态的时候 keep going ，通过 Excited State Absorption (ESA) 来擦除它。 Hell组曾经利用ESA实现了对掺锰的量子点的超分辨。一个箭头，扭转乾坤。回答我们刚开始提出的问题：本质上，这一类的方法都是抑制粒子处于激发态的几率，也就是不让它在 S1 态，不管是在摇篮中扼杀 (GSD) ，到达后拉下来 (STED) ，还是将其送上西天 (ESA) 。放一张总结的图，再次欣赏一下这能级上的舞蹈。这一方法被 Stefan Hell 称为 RESOLFT, reversible saturable/switchable optical transitions ，可逆饱和 / 开关光跃迁。我们讲到的 STED/GSD/ESA 都可以统一地概括在它下面。在下一章，我们将看到另外两种独辟蹊径的超分辨成像机理，以及它们之间的内部联系。写到这里的时候，笔者刚好有一篇文章在 Opt. Express 刊出，内容是关于如何用一小片塑料或纸片，用共聚焦扫描显微就能在透明的样品(细胞、组织切片都行）实现和 DIC 一样震撼的位相浮雕成像的。同时，告诫大家不要将打印纸含在嘴上，有剧毒致癌物 ----我们实验发现，从三无小饭馆来的餐巾纸荧光极强，打印纸荧光也不弱。链接： http://www.opticsinfobase.org/oe/abstract.cfm?uri=oe-20-13-14100 请大家去点击下载一下 pdf ，争取让这篇文章能够上到当月下载 top download! 麻烦大家了，谢谢！你的支持，是我继续写下去的动力！ PS：最近各种事物缠身，写的有点慢，大家见谅！如果害怕错过，可以加我好友，这样有了新的帖子系统会自动通知。; 12638 次阅读|4 个评论

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