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热度 1 yjjh143 2018-7-8 23:10

在上一讲的 “ 三重反应 ” 中，我们介绍了科研工作者们发现了不同植物黄化苗对乙烯处理发生不同的反应。其中，主要以拟南芥的 “ 三重反应 ” 和水稻的 “ 双重反应 ” 为代表。俗话说： “ 工欲善其事，必先利其器。 ” 光知道植物对乙烯的反应还不够，关键是要开发出一套可行的工具或系统，为我们所用，来研究植物乙烯的信号转导通路。一般来说，生物体的变异来源主要有两种：自然变异和人工诱变。在自然环境中，植物受到自身或外界因素的影响发生不定向的突变，这种突变可能导致植物性状发生改变，并稳定地遗传给后代，我们称之为自然变异。由于生物体具有非常有效的变异修复体系，因此自发突变的频率非常低，需要较长时间的积累才可得到丰富的变异，而人为进行化学诱变可以让植物的突变频率大大升高，在短时间内创造出大量的遗传变异。其中， EMS （ Ethyl methanesulfonate ）属于一种烷化试剂，可以导致嘌呤和嘧啶的转换，是目前公认的一种最为有效且应用比较多的化学诱变试剂。使用 EMS 诱变的方法创造新的变异，是研究植物基因功能的一种非常有效的工具，已经在拟南芥、水稻、玉米、小麦等多种植物中广泛应用。 1. 利用 “ 三重反应 ” 筛选拟南芥乙烯反应突变体 1988 年 ANTHONY B. BLEECKER 等在 Science 上发表了一篇题为 “ Insensitivity to Ethylene Conferred by a Dominant Mutation in Arabidopsis thaliana ” 的文章，首次报道了利用人工诱变和 ” 三重反应 “ 筛选拟南芥乙烯反应突变体。该文章鉴定到了一个显性突变 etr ，可使拟南芥的各个组织和器官在各个生长发育时期，都表现出乙烯不敏感的表型，并进一步将突变定位在一号染色体的 ap-1 位点附近。这个突变基因就是后来大名鼎鼎的乙烯受体 ETR1 ，这也是通过遗传学方法鉴定到的第一个植物激素受体。从此，乙烯信号通路组分的遗传学筛选就拉开了帷幕。拟南芥乙烯反应突变体筛选体系（ Merchante 等， 2017 ； Hao 等， 2017 ）两年后， Plinio Guzman 和 Joseph R. Ecker 在 The Plant Cell 上发表了一篇文章 “ Exploiting the Triple Response of Arabídopsís To ldentify Ethylene-Related Mutants ” ，系统地介绍了如何利用拟南芥的 “ 三重反应 ” 和 EMS 诱变进行乙烯反应突变体的筛选和鉴定。并利用该体系筛选到了 3 类乙烯反应突变体 eto1 ( ethylene overproducer ) ， hls (hookless) ， ein1 (ethylene insensitive ) 和 ein2 。其中， eto1 黄化苗表现出组成型的乙烯反应，由自身乙烯合成增加所致； hls1 黄化苗的下胚轴和根对乙烯的反应正常，但是不能形成弯钩，并且乙烯的合成减少； ein1 和 ein2 都对乙烯不敏感，乙烯的合成增加，并且 ein1 很可能是 etr 的等位突变，而 ein2 则定位在 4 号染色体上，是一个新的乙烯相关突变位点。利用 “ 三重反应 ” 筛选到的拟南芥乙烯反应突变体（ Guzman, P. 和 Ecker, J. R. ， 1990 ）在 The Plant Cell 文章中， Ecker 指出了以拟南芥为模式研究植物乙烯反应的三大优势： 1. 三重反应非常明显，容易进行突变体的筛选； 2. 可以进行基因的定位和克隆； 3. 遗传转化系统也逐渐成熟。因此， Ecker 呼吁大家以拟南芥黄化苗系统为模式，进行植物乙烯相关生理过程的研究。而 Ecker 也使用该体系，鉴定到了一系列乙烯信号通路中的重要组分，并因此奠定了其在乙烯信号转导领域中 “ 大神 ” 的地位，还培养出了一批活跃在乙烯信号领域最前沿的的大牛，比如郭红卫老师和乔红老师。 2. 利用 “ 双重反应 ” 筛选水稻乙烯反应突变体从上世纪八十年代开始，以拟南芥为代表的双子叶植物的乙烯信号转导通路研究进行的如火如荼，经过二十多年的发展，取得了丰硕的成果。迄今为止，乙烯的信号转导通路已经是研究的最透彻的植物激素通路之一。然而，单子叶植物乙烯信号转导通路方面的研究一直没有突破性的进展，归根到底是由于一直没有建立一套高效且稳定的乙烯反应表型鉴定体系。直到 2013 年，中科院遗传发育所张劲松课题组的马彪老师经过无数次的尝试和失败，最终摸索出了一套稳定的水稻乙烯反应鉴定系统，并利用该系统筛选出了一系列水稻乙烯反应突变体，相关成果以 Identification of Rice Ethylene-Response Mutants and Characterization of MHZ7/OsEIN2 in Distinct Ethylene Response and Yield Trait Regulation 为题发表在 Molecular Plant 上。水稻乙烯反应突变体筛选体系（ Ma 和 Zhang ， 2017 ）说起水稻乙烯反应突变体筛选体系的建立，还有一则趣事咧。话说当年马彪老师筛选水稻乙烯突变体时，起初是把水加到筛子面的，经过了许多次的尝试，一直也没有筛选到表型非常好的突变体。当时组里的许多人都劝马老师放弃，重新选择其他课题。可是，马老师从来不是一个轻言放弃的人，仍然不忘初心，对系统一点一点进行改进。直到有一次，无意中把水加少了，却意外地看到了非常明显的乙烯反应表型，并在此基础上逐步改进，形成了今天非常成熟的体系。俗话说： “ 万事开头难 ” 。科学研究的过程并不是一帆风顺的，尤其是开始阶段更加艰难，这就需要我们有坚韧不拔的毅力和忍耐力，遇到困难和挫折时，不要轻言放弃，也许再坚持一点点，通往真理的大门就从此敞开了。马老师的经历就是最好的例证。试想，如果没有马老师当年的坚持，水稻乙烯信号领域的研究可能要滞后数年甚至数十年也说不准。在此，向马老师的 “ 死磕精神 ” 致敬 ! 3. 乙烯反应突变体筛选和功能研究的主要步骤时至今日，拟南芥和水稻乙烯反应突变体的筛选和功能研究体系已经非常成熟，此处对一般的研究思路做一个大概的总结。 1. 对萌发的种子进行 EMS 诱变，收到 M1 种子后，自交得到 M2 后代。 2. 对 M2 植株进行乙烯反应表型的筛选，一般分为乙烯不敏感、钝感和过敏感。 3. 对筛选到的突变体按表型分类，对具有相同或相似表型的突变体进行等位分析。 4. 将突变体和野生型亲本回交， F1 进行显隐性鉴定，并对自交得到的 F2 进行分离比统计，以确定突变表型是由单基因还是多基因控制。 5. 将突变体和乙烯信号通路中已知组分的遗传材料杂交，进行遗传分析，确定突变基因在信号通路中的位置。 6. 通过图位克隆或者 BSA 寻找候选基因，并通过遗传转化确定突变基因。 7. 确定突变基因后，对基因的功能，及其分子机制进行具体的研究。比如，如果突变基因是转录因子，就找它的靶基因，如果是酶就找它的底物，等等。从该步开始，就要具体问题具体分析了。【参考文献】 Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. (1988). Insensitivity to ethylene conferred by a dominant mutation in Arabidopsis thaliana. Science , 241 (4869), 1086-1089. Guzman, P., Ecker, J. R. (1990). Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. The Plant Cell , 2 (6), 513-523. Hao, D., Sun, X.,Ma, B.,Zhang, J. Guo, H.(2017). Ethylene. Hormone Metabolism and Signaling in Plants . Academic Press.203-241. Ma, B., He, S. J., Duan, K. X., Yin, C. C., Chen, H., Yang, C., ... Zhang, W. K. (2013). Identification of rice ethylene-response mutants and characterization of MHZ7/OsEIN2 in distinct ethylene response and yield trait regulation. Molecular plant , 6 (6), 1830-1848. Ma, B., Zhang, J. S. (2017). Analysis of Growth and Molecular Responses to Ethylene in Etiolated Rice Seedlings. Ethylene Signaling: Methods and Protocols , 237-243. Merchante, C., Stepanova, A. N. (2017). The Triple Response Assay and Its Use to Characterize Ethylene Mutants in Arabidopsis. Ethylene Signaling: Methods and Protocols , 163-209. 欢迎关注 BioArt植物微信公众号

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楚王好细腰，水稻爱“高腰”

yjjh143 2018-5-6 21:12

《墨子·兼爱》中记载：“昔者楚灵王好士细腰，故灵王之臣皆以一饭为节，胁息然后带，扶墙然后起。比期（jī）年，朝有黧（lí）黑之色。”这就是我们常说的“楚王好细腰”的典故。唐朝大文豪白居易更是有“樱桃樊素口，杨柳小蛮腰”此等脍炙人口的诗句广为流传。由此可见，我们对细腰的痴迷古已有之，且源远流长。当代社会中，我们夸赞女孩子身材好的时候，经常说她有标准的S型曲线，而细腰就是其中重要的一环。前段时间， “A4” 腰在网络上风靡一时，成了一场全民参与的“晒美运动”，把我们对细腰的追求推上了一个新高度。你知道吗？我们餐桌上每天都能见到的水稻，对“腰”也有特殊的“审美”和“偏好”。只不过和我们人类对细腰的痴迷不同，一些水稻更加喜欢细细长长的“高腰”。中科院遗传发育所张劲松课题组在对水稻乙烯反应突变体筛选的过程中，鉴定到一个特殊的材料。和野生型比，在空气中和用乙烯处理时，该突变体的中胚轴和胚芽鞘都明显伸长。水稻的中胚轴上连胚芽鞘，下接种子和根，伸长后就像人的腰一样，细细长长，形态优美，整个黄化苗形似一位亭亭玉立、婀娜多姿的美少女，故将该突变体命名为高腰1（ gaoyao1 ， gy1 ）。我们都知道，当我们把种子播种到土壤中后，会有一个萌发和出土的过程。在水稻的萌发出土过程中，胚芽鞘起到保护幼嫩胚芽的作用，而中胚轴的作用就是在黑暗的地下快速伸长，把胚芽鞘推出土壤，早点享受阳关的沐浴，呼吸空气的芬芳。了解水稻栽培的小伙伴应该知道，传统的水稻种植包括育苗和插秧两个步骤，浪费了大量的人力物力和时间。出于人类偷懒的本能，水稻直播栽培越来越受到重视。从名字上也可以看出来，直播省去了插秧的步骤，直接播种，一步到位，我们刷剧、吃鸡、打王者农药的时间又可以充足一些了。可是有研究表明，水稻直播的出苗率与水稻秧苗中胚轴和胚芽鞘的长度有极大的关系，中胚轴和胚芽鞘越长，出苗率越高。说的通俗一点，水稻的“腰”越高，直播的成活率也就越高。而一般的水稻品种，中胚轴和胚芽鞘的长度并不太长，这就导致水稻直播的出苗率并不理想。 GY1 基因功能和分子机制的研究，对水稻直播技术的推广和应用具有重要的意义。通过图位克隆，发现 GY1 基因定位在一号染色体长臂的末端，编码一个PLA1类型的磷脂酶。GY1蛋白定位在叶绿体上，参与了JA生物合成的起始步骤。 gy1 突变体中 GY1 基因发生了G518A的突变，导致R173Q的氨基酸变异，使GY1磷脂酶的活性降低，阻碍了JA的生物合成，导致突变体中JA的含量减少。外源施加茉莉酸甲酯，可以恢复 gy1 突变体的中胚轴和胚芽鞘到野生型的长度，说明 gy1 中胚轴和胚芽鞘伸长的表型确实是由于JA的合成减少导致。在对水稻幼苗的出土过程进行精细研究后发现，出土过程中茉莉酸的含量会降低，而乙烯的释放反而会上升。进一步研究揭示， GY1 是水稻乙烯通路中重要的转录因子OsEIL2的靶基因，乙烯处理抑制 GY1 的表达，减少JA的合成，进而使中胚轴和胚芽鞘伸长。对3000分水稻重测序数据中的 GY1 基因进行比对分析后发现，有141份水稻品种发生了G376T的突变，导致GY1蛋白第126位的甘氨酸突变为半胱氨酸，使GY1的磷脂酶活性明显降低。收集到了44个具有G376T突变位点的水稻品种，发现中胚轴和胚芽鞘都有不同程度的伸长。说明在自然群体中，GY1基因376T的SNP位点与较长的中胚轴和胚芽鞘相关联。值得注意的是，这141个水稻品种起源于水稻不同的亚组且分布在不同的国家和地区。不过，这些品种的起源地大都属于热带季风气候。而GY1基因376T的SNP位点，很可能是受到长期的驯化和选择，以适应热带季风气候特殊地理环境的结果。不禁感叹，大自然真是一位审美奇特的“选美大师”，她既喜欢没有腰的“短粗胖”，又喜欢高腰的“长细瘦”。不过，也正是因为大自然这种独特的审美口味，才使得我们生活的环境如此多姿多彩，壮丽恢弘。【参考文献】 Xiong Q, Ma B, Lu X, Huang YH, He SJ, Yang C, Yin CC, Zhao H, Zhou Y, Zhang WK, Wang WS, Li ZK, Chen SY, Zhang JS (2017) Ethylene-Inhibited Jasmonic Acid Biosynthesis Promotes Mesocotyl/Coleoptile Elongation of Etiolated Rice Seedlings. Plant Cell, 29: 1053-1072.

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call variants from wheat RNA_seq

mashengwei 2018-1-25 22:39

call variants from wheat RNA_seq 1 24 本期作者：Neal call variants from wheat RNA_seq 上周我们推送的何中虎研究员的文章（中国小麦产业发展与科技进步——小麦里我见过的最豪华作者阵容），目前阅读人数是8400多人，也是迄今为止我们公众号阅读人数最高的推送之一，这也直接让我们的关注人数猛增到3000人。过去一段时间，有不少小麦育种老师和专家也关注了我们，我们非常欢迎各位分享育种方面的经验。今天要说一些说从RNA seq数据里得到序列变异的步骤。首先要交代一下背景，我们要研究一个EMS突变体（已回交多次），前期已经将突变基因定位到一个染色体区间，根据中国春参考序列，我们已经发现一个候选基因已经在水稻里被报道过了，测序发现，该基因确实发生了变异。后期安排了RNA seq实验，想在机制方面做一个有益的尝试。另外我们也想通过这样一个RNA_seq数据，比较在定位区间内还有那些基因发生了变异，因此就有了今天这样一个推送。这里还要特别强调一点，这不是混池数据，分析过程中的一些参数请根据实验目的调整。使用STAR将reads mapping至小麦基因组，然后使用sentieon流程（本质是GATK）call variant，接着使用SnpSift筛选高质量SNP，结合EMS诱变的特点，进一步排除可能的假阳性SNP，最后获得大概300个SNP，使用SnpEff注释SNP。根据前期遗传定位结果，我们发现只有4个SNP位于我们的区间内(20Mb)，但是只有一个SNP导致蛋白提前终止，该SNP所在的基因其在水稻里的直系同源基因已被报道，突变之后与我们的突变体表型非常相似。下面是具体的流程，如果有兴趣欢迎交流。这个需要具有一定的高通量数据分析基础，其他的就没有什么特别的地方了。 # 工作目录 cd / data / rna_seq / genome / #构建 A 基因组 index STAR -- runThreadN 10 -- runMode genomeGenerate -- genomeDir ./ -- genomeFastaFiles CS_A_genome_part . fasta -- sjdbFileChrStartEnd TGACv1_part_A . ss -- limitGenomeGenerateRAM 68800833920 #!/usr/bin/env python # -*- coding: utf-8 -*- __author__ = 'wheatomics' import subprocess # inpu.txt放着fastq文件的名字 with open ( 'input.txt' , 'r' ) as f : for line in f : line = line . strip (). split () fq1 , fq2 = line print fq1 , fq2 # 1. Mapping reads with STAR proc = subprocess . Popen ( , 'SM:' + fq1 . split ( '_' ) , 'PL:ILLUMINA' ], shell = False ) proc . wait () proc = subprocess . Popen ( , shell = False ) proc . wait () proc = subprocess . Popen ( , shell = False ) proc . wait () proc = subprocess . Popen ( , shell = False ) proc . wait () # 2. Metrics proc = subprocess . Popen ( , shell = False ) proc . wait () proc = subprocess . Popen ( + '-metrics-report.pdf' , 'gc=gc_metrics.txt' , 'qd=qd_metrics.txt' , 'mq=mq_metrics.txt' , 'isize=is_metrics.txt' ], shell = False ) proc . wait () # 3. Remove Duplicate Reads proc = subprocess . Popen ( , shell = False ) proc . wait () proc = subprocess . Popen ( , shell = False ) proc . wait () # 4. Split reads at Junction proc = subprocess . Popen ( , shell = False ) proc . wait () # 5. Indel realigner proc = subprocess . Popen ( + '.realigned.bam' ], shell = False ) proc . wait () Call SNP #此处只统计了unique mapped的reads sentieon driver - r / data2 / masw_data / rna_seq / dqyRNA - seq / masw_analysis / genome / CS_A_genome_part . fasta -- read_filter MapQualFilter , min_map_qual = 60 - t 10 - i WT . realigned . bam - i br . realigned . bam -- algo Genotyper -- emit_conf 20 -- call_conf 20 WT_br_UG . vcf 筛选SNP # # 要注意，EMS诱变的变异一般是C/T和A/G的变异，其他类型的变异频率很低很低。另外，突变里的关键功能变异理论上与参考序列不同。EMS mutations result in G:C to A:T mutations, whereas false positives could be any change. Thus, we retained only the alleles that corresponded to G:C to A:T mutations using SnpSift cat WT_ms_UG . vcf | java - jar / data / snpEff / SnpSift . jar filter (QUAL 30) (MQ 40) (QD 5) (FS 30.0) GEN .DP 5 GEN .DP 5 (((GEN .GT = '0/0') (GEN .GT = '1/1')) | ((GEN .GT = '1/1') (GEN .GT = '0/0'))) WT_ms_UG_filtered . vcf #上述筛选参数不是固定的，要根据实验和分析结果调整。具体每个参数表示的意思，请Google搜索SnpSift即可。 vcf文件里的一条染色体还是拆开的，需要合并成一个整体。 #!/usr/bin/env python # -*- coding: utf-8 -*- __author__ = 'wheatomics' chr = , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ] with open ( 'WT_br_UG_filtered.vcf' , 'r' ) as f : for line in f : if line . startswith ( '#' ): print line , else : line = line . replace ( '_part1' , '' ) line = line . strip (). split ( '' ) if line . endswith ( 'part2' ): for i in chr : if line . split ( '_' ) == i : line = int ( line ) + int ( i ) line = line . split ( '_' ) for m in line : print str ( m ) + '' , print line + '' , 最好再修改下vcf的表头信息 ##contig=ID=chr1A,length=594102056,assembly=unknown ##contig=ID=chr2A,length=780798557,assembly=unknown ##contig=ID=chr3A,length=750843639,assembly=unknown ##contig=ID=chr4A,length=744588157,assembly=unknown ##contig=ID=chr5A,length=709773743,assembly=unknown ##contig=ID=chr6A,length=618079260,assembly=unknown ##contig=ID=chr7A,length=736706236,assembly=unknown ##contig=ID=chrUn,length=480980714,assembly=unknown 转换之后就要统计SNP的信息，比如染色体上的SNP个数等 #使用snpEff注释SNP java - Xmx8g - jar snpEff . jar IWGSCv1 . 0 WT_itr_UG_filtered_whole . vcf WT_itr_UG_filtered_whole_eff . vcf 根据上述结果，即可进行下一步的分析。 SnpEff这个我们前面也介绍过，可以参考使用SnpEff 对SNP结果进行分析。欢迎关注 “ 小麦研究联盟 ”，了解小麦新进展投稿、转载、合作以及信息分布等请联系： wheatgenome 原始链接

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