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从富含多糖多酚的组织中提取高质量RNA: 热度 14 xudabin98 2013-6-8 14:51; 从不同细胞中分离提取高纯度、高质量的 RNA 对于很多分子生物学实验至关重要，如 cDNA 的合成、 Northern 印记分析、 mRNA 差别显示技术分离基因以及转录组测序等等实验，很大程度上取决于 RNA 的完整性。然而由于 RNA 自身结构的特点，以及周围环境中众多而又稳定存在的 RNA 酶，常常会使得 RNA 发生降解。在植物果实组织中，如玉米籽粒、柑橘、香蕉，含有丰富的多糖、蛋白，由于多糖与 RNA 在溶解性上高度一致，导致二者形成非常难溶的胶状复合物，使得 RNA 提取量下降，并造成一定程度上的降解；在植物老化组织中，如玉米老叶、冬青叶、茶叶，含有大量的多酚，当其氧化后，会使得 RNA 沉淀变成褐色，干扰了后续实验；有些产生次生代谢组织，如葡萄、苹果、甘蔗，其次生产物会降低 RNA 的获取率。 RNA 提取原理：目前在 RNA 提取上最常使用的是酸性酚—异硫氰酸胍—氯仿提取法，该方法首先由 Ullrich 于 1977 年提出。细胞在异硫氰酸胍的作用下发生裂解并释放出 RNA ，在酸性酚的作用下使 RNA 和 DNA 发生分离。当加入氯仿后，样品分为水相和有机相， RNA 存在于水相中。收集水相后，加入异丙醇就可沉淀出 RNA 。因此无论 DNA 、 RNA 还是蛋白提取，其原理步骤大体相似，无非使细胞破碎，释放成分，通过溶剂分离回收。 RNA 抽提试剂：目前市面上有很多 RNA 抽提试剂盒，但对于某些特殊的组织，试剂盒并不是最好的选择。这里介绍一款抽提富含多糖、多酚组织 RNA 试剂配方。富含多糖抽提试剂（简称抽提缓冲液）： 0.25M NaCl ， 0.05M Tris-HCl （ pH7.5 ）， 20mM EDTA ， 1% （ M/V ） SDS （所有试剂均以 DEPC 水配制， 121 ℃灭菌 20 分钟，冷却备用）。富含多酚抽提试剂（简称抽提缓冲液）： 0.25M NaCl ， 0.05M Tris-HCl （ pH7.5 ）， 20mM EDTA ， 4% （ M/V ） PVP （所有试剂均以 DEPC 水配制， 121 ℃灭菌 20 分钟，冷却备用）。常用试剂：氯仿：异戊醇（ 24:1 ）、异丙醇、0. 1% （ V/V ） DEPC 水（焦碳酸二乙酯，该化合物很香，但具有很强的致癌性，操作时一定要注意防护，过夜搅拌后，高温高压灭菌，灭菌后分解失去毒性，主要用于各种试剂配制时的母液）、 75% 酒精（以 DEPC 水配制）。 RNA 抽提器材处理：研钵、量筒、药匙等耐高温的器材以锡箔纸包好，在 180 ℃烘箱中放置 6 个小时以上，冷却备用。枪头、 EP 管等塑料器皿以 0.5M NaOH 浸泡 10 分钟，然后用水清洗干净，高温高压灭菌，即可。预防 RNA 酶污染注意事项：操作时可在超净台上进行，常规的分子生物学实验室如果洁净度很高，在敞开的环境中操作也可以。戴上口罩，经常更换一次性手套，唾液或者汗液中经常带有 RNA 酶，会导致 RNA 降解。操作步骤：以玉米授粉后 18 天的籽粒为例。 1 、研钵先以液氮预冷，倒入事先保存的玉米籽粒，迅速研磨，最好 1 分钟之内解决，并且要研磨充分，将研磨好的粉末加入 1.5ml 的 EP 管中； 2、向上述 EP 管中加入 1ml 抽提缓冲液，以涡旋振荡器剧烈震荡，使细胞充分裂解； 3、将匀浆后的样品置于室温 5 分钟，使核酸蛋白复合物完全分离； 4、向 EP 管中加入 0.2ml 氯仿，盖好管盖，涡旋震荡 20 秒，室温放置 3 分钟； 5、 4 ℃， 12000rpm 离心 15 分钟，此时 EP 管中样品分为两层，上层水相，下层有机相， RNA 位于水相中； 6、吸取约 600ul 水相转移到一新的 1.5mlEP 管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，至于 -20 ℃冰箱中；（在吸取水相时，不要因为担心量不够，而过多吸取，会导致较多的 DNA 掺杂在 RNA 中） 7、取出 EP 管于 4 ℃， 12000rpm 离心 15 分钟，离心后 RNA 以胶状形式沉淀在管底； 8、加入 1ml 75% 乙醇洗涤沉淀；（主要是去除异丙醇、 SDS 和 EDTA 等） 9、 4 ℃， 12000rpm 离心 3 分钟，倒出乙醇，残余的少量液体短暂离心后，以枪头吸出； 10、室温放置晾干（使乙醇发挥干净，但不要使 RNA 晾的过干，会导致 RNA 很难溶解，大约 2-3 分钟即可），根据后续实验需要，加入 50ul RNase-free ddH 2O ，利用移液枪反复吹打，混匀，充分溶解 RNA 。 11、实验前提前配制一块 1.5% 的琼脂糖胶，电泳槽和制胶槽最好进行无 RNA 酶处理。将得到的 RNA 母液稀释 10 倍后，取 3ul ，加入 7ul 上样缓冲液，点样， 120V 电压下电泳 15 分钟左右，拍照保存。注：电泳后判断 RNA 质量的标准：有溴化乙锭存在时，电泳后 28srRNA 和 18srRNA （ s 代表沉降系数）应当能清楚地在紫外灯下看到，同时还可以看到 5.8srRNA 和 5srRNA ，但二者由于比较接近，在较小胶浓度下，会叠加在一条带上。如果 RNA 没有被降解， 28srRNA 的亮度应当是 18srRNA 亮度的两倍，且这两条带都没有弥散现象。当以 DNA 酶消化后再次电泳时，加样孔附近如果仍有明亮的条带，表明 DNA 并未被消化干净。 12、电泳后，如果提取效果较好，以 DNA 酶进行消化处理，消化完成后，测量 RNA 的浓度。注： RNA 的贮存方法：①水溶解后的沉淀物贮存于 -80 ℃，可保存一年以上，最为常用的方法；② RNA 沉淀保存在 75% 乙醇中， 4 ℃可放置一个星期以上或 -20 ℃一年以上；③用去离子甲酰胺溶解 RNA 贮存于 -20 ℃，可保存一年以上。（甲酰胺溶液提供稳定的化学环境，使 RNA 免遭 RNase 降解）以该方法提取富含多糖玉米籽粒 RNA 电泳图如下（本人所做）：以酸性酚—异硫氰酸胍—氯仿提取法提取 RNA 电泳图如下（ Takara 试剂盒说明书）： RNA 提取过程中常见问题： 1、RNA 吸光度说明： 260nm 、320nm 、230nm 、280nm 下的吸光度分别代表了核酸、溶解液、盐浓度和蛋白质的吸光度值。OD260/OD280 （R ）体现了RNA 中的蛋白质等有机物的污染程度，质量好的RNA 的R 值应在1.8-2.2 之间，当R1.8 时，表明溶液中存在蛋白质等有机物的污染，当R2.2 时，说明RNA 已经被水解成了单核苷酸。 2、RNA 得率低： ① 样品裂解不充分，细胞未能全部释放出RNA ；②得到的RNA 沉淀未完全溶解。 3、提取的RNA 不溶解 RNA 在晾干时干燥时间过长，可在60 ℃溶解5 分钟然后放置于冰上继续溶解几个小时，因此在RNA 晾干时要把握好火候。 4、提取的RNA 发生降解 ①材料收获后没有及时保存，获取材料后迅速冷冻至于-80 ℃保存；②操作过程中引入RNA 酶或者实验器材未能完全去除RNA 酶。 5、相关电泳图片分析下图可以看见点样空中有明亮的条带，表明存在DNA，未能消化干净，如果以这样质量的RNA来进行试验，会对后面结果产生极大干扰，出现假阳性。下图28s和18sRNA已挤作一团，进入同一条带，表明发生严重降解。如果碰到下面这样RNA电泳图是否表明所提取的RNA不能用呢？未必如此，可能是由于RNA的浓度过大，在电泳过程中在EB的拖动下，全部进入底部，此时可以通过稀释RNA母液，重新电泳验证。欢迎交流学习，本人邮箱： xudabin98@163.com ，QQ：448170507。; 28957 次阅读|52 个评论

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