我们都知道RNA-seq是通过NGS技术来检测基因表达量的测序方法。在衡量基因表达量方面，若是单纯以比对到参考基因的Reads个数（我们通常称之为Count值）来衡量基因的表达量，在统计上是一件相当不合理的事。今天就为大家介绍一下衡量基因表达量的RPKM和FPKM两种方法。 在随机抽样的情况下，序列较长的基因被抽到的概率本来就会比序列短的基因高，如此一来，序列长的基因永远会被认为表达量较高，而错估基因真正的表达量。在测序深度不同的情况下，测序深度更深的样品中，比对到每个基因的Read数量更多。 为排除因基因的长度、测序深度等因素造成的干扰，RPKM（Reads Per Kilobase Million）和FPKM（Fragments Per Kilobase Million）等方法就应运而生了。 RPKM （Reads Per Kilobase per Million）和 FPKM （Fragments Per Kilobase per Million） 首先需要解释FPKM和RPKM的原理是相似的，区别在于FPKM对应的是DNA片段，比如在一个Illumina的pair-end（双尾）RNA-seq中，一对（两个）reads对应是一个DNA片段。有了FPKM（RPKM）概念，我们就能比较：同一个样本中基因A和基因B的相对表达量；或者不同样本中，同一个基因的相对表达量。 具体的原因是：引入“每一千碱基（per kilobase）”的原因在于，不同的RNA可能有不同长度，长度越长，对应的reads就越多。当每个RNA都除以自身长度（以1000碱基为单位）时，就可以比较同一个样本中不同基因的相对表达量了。相似地，引入“每一百万reads”的原因是，不同的样本可能测序的深度不一样，深度越深，当然对应的reads就越多了。如果结果除以各自库的数量（以一百万reads为单位），那么我们就能很好地衡量两个不同样本中同一个基因的相对表达量。 RPKM RPKM是将Map到基因的Reads数除以Map到Genome的所有Read数(以Million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)。 FPKM FPKM是将Map到基因的Fragments数除以Map到Genome的所有Read数(以Million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)。 从公式上可以看出，方法是将Reads（Fragments）Count进行标准化，分别是对测序深度标准化（以Million为单位）和对基因长度标准化（以KB为单位），从而消除了因测序深度和基因长度不同对基因表达量的影响。
FPKM, Fragments Kilobase of exon model per millon mapped reads, which can be used to indicate the expression (abundance) characteristics of genes. Now I will describe operation about obtaining interested gene FPKM value. 1.Software Download 1).fastq-dump: convert sra file to fastq file. website: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=software 2).bowtie:an ultrafast and memory efficient tool for aligning sequencing reads to long reference sequences. website: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml 3).cufflinks:assembles transcripts, estimates their abundances, and tests for differential expression and regulation in RNA-Seq samples. website: http://cufflinks.cbcb.umd.edu/ 4).gffread: convert gff3 file to gtf file. website: http://cufflinks.cbcb.umd.edu/ (This program is included with cufflinks package) 2. Operation 1) Download genome.fa and genes.gff3 file from genome website; Download sra file from NCBI 2) Format conversion $ fastq-dump -I --split-files SRR123456789.sra # convert sra file to fastq file $ gffread -E genes.gff3 -o genes.gtf # convert gff3 file to gtf file 3) Index files $bowtie2-build genome.fa genome 4) Alignment $bowtie2 -x genome -1 SRR123456789_1.fastq -2 SRR123456789_2.fastq -S SRR123456789.sam $samtools view -bS SRR123456789.sam SRR123456789.bam $samtools sort SRR123456789.bam SRR123456789 5) FPKM values $cufflinks SRR123456789.bam -G genes.gtf -o result After these operations, we can extract FPKM values from genes.frkm_tracking file based on gene ID. Notes: If you find some bugs, please contact me.
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