李白在《蜀道难》中有“ 剑阁峥嵘而崔嵬，一夫当关，万夫莫开 ”的诗句广为流传。在信号通路中，受体是激素分子引起细胞内部反应的第一道关卡。它就好比那当关的勇士，不攻克这一关，任它有千军万马，细胞内也仍是风平浪静，没有丝毫反应。由此可见，受体在信号转导通路中的关键性作用。 我们在上一讲中提到过， 1988 年 Bleecker 等人在 Science 上报道了一个乙烯不敏感突变体，当用乙烯处理时，它无法表现出正常的 “ 三重反应 ” ，如鹤立鸡群一般，高傲地俯视着脚下的野生型，并且在其生长发育的各个时期，所有组织和器官都表现出乙烯不敏感的表型。另外，突变体的乙烯结合能力也大大降低。基于以上结果，作者推测， ETR1 很可能在乙烯信号的早期发挥作用，并且可能作为受体发挥作用。 1993 年， Elliot M. Meyerowitz 实验室和 Bleecker 合作，在 Science 上发表了一篇文章 Arabidopsis Ethylene-Response Gene ETR1: Similarity of Product to Two-Component Regulators 。他们通过染色体步移（ Chromosome walking ）的方法，成功克隆到了 ETR1 基因。 ETR1 位于一号染色体的末端，编码了 738 个氨基酸。序列比较发现，和野生型比， etr1-1 突变体中 ETR1 基因的 N 端一个碱基的替换导致氨基酸发生 C65T 的突变。 通过染色体步移方法定位到 ETR1 基因（ Chang 等， 1993 ） 对于 ETR1 表达模式的分析发现，该基因在拟南芥的根、茎、叶、花和幼苗中都有表达，并且不存在可变剪切。此外，乙烯处理不影响 ETR1 mRNA 的表达。以 ETR1 基因片段和拟南芥基因组杂交，可检测到多个片段，说明拟南芥基因组可能编码多个和 ETR1 序列类似的类似基因。在此后的研究中，科研工作者们慢慢揭示了乙烯受体家族复杂的功能分化，我们后续再讲。 ETR1 蛋白分析结果表明，其 N 端没有发现保守的结构，但是 C 端和参与原核生物信号转导的双组份系统具有很高的相似性，暗示着它们可能具有相似的作用机制。 将 etr1-1 基因组序列转化到拟南芥中，可引起转基因黄化苗出现乙烯不敏感的表型，而转化正常 ETR1 基因的转基因植株的乙烯反应正常，说明 etr1-1 突变体的表型确实是由于 ETR1 基因的突变导致，这就敲实了 ETR1 在乙烯信号中的功能。 etr1 转基因株系的乙烯反应表型（ Chang 等， 1993 ） 1995 年， BLeecker 实验室报道，在从拟南芥中提取 ETR1 蛋白时，提取出来的蛋白的大小总是为 147kD 左右，而根据基因的 CDS 预测的蛋白大小是 79kD 左右，二者存在着约两倍的关系。同时，当从异源表达 ETR1 的酵母中提取蛋白时，也出现类似的情况。可是，当用还原剂二硫苏糖醇处理后，蛋白大小即可变为 79kD ，说明 ETR1 蛋白可能通过二硫键形成二聚体。将 ETR1 蛋白分段研究发现，其 N 端参与了二聚体的形成。将 N 端的半胱氨酸分别进行点突，发现第 4 位和第 6 位的半胱氨酸介导了二聚体的形成。 ETR1 第 4 位和第 6 位的半胱氨酸介导了二聚体的形成（ Schaller 等， 1995 ） 1999 年， Bleecker 实验室再次在 Science 上发文 A Copper Cofactor for the Ethylene Receptor ETR1 from Arabidopsis ，报道了铜离子可作为辅助因子和 ETR1 的 N 端结合，影响 ETR1 与乙烯的亲和性。另外，文章中还揭示了 etr1-1 突变的分子机制： etr1-1 中的点突变导致蛋白无法和铜离子结合，进而导致和乙烯的亲和性降低，无法识别和传递乙烯信号，导致乙烯不敏感的表型。 铜离子作为 ETR1 的辅助因子影响乙烯的亲和性（ Rodrıguez 等， 1999 ） 虽然 ETR1 基因早在 1993 年就已经被克隆了，但是限于当时的技术手段， ETR1 蛋白的亚细胞定位一直是个不解之谜。通过蛋白结构分析发现， ETR1 N 端含有一个跨膜结构域，但是序列分析并未为其亚细胞定位提供任何可参考的信息。直到 2002 年， G. Eric Schaller 实验室在 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 杂志上发表题为 Localization of the Ethylene Receptor ETR1 to the Endoplasmic Reticulum of Arabidopsis 的文章，综合使用了双水相萃取、蔗糖梯度离心和免疫电镜等技术，确定 ETR1 蛋白主要定位在内质网上，该定位主要由其 N 端决定。并且，乙烯的结合并不会改变 ETR1 的亚细胞定位。 免疫电镜显示 ETR1 定位在内质网上（ Chen 等， 2002 ） 看完 ETR1 的研究历史，不仅感慨，小小的一个基因，竟然需要多个实验室合作，花费了近十年的时间才研究清楚它的基本功能。以今天的观点来看，简直有点不可思议。归根到底，主要原因是当时的实验方法和实验工具还比较落后。再看看我们现在的科研环境，要做某一方面的研究，成熟的体系都是现成的，这就大大加快了我们的研究进程。 当然，凡事有利就有弊。上世纪末，克隆出一个基因就能发个 CNS 级别的文章，而现在我们即使把功能做得非常深入，能发个 CNS 的子刊就不错了。唯一不变的是， 每一篇文章背后，都蕴藏着科研人员大量的心血和汗水。所以，当我们读每一篇文献时，请心怀敬畏。 【 参考文献 】 Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. (1988). Insensitivity to ethylene conferred by a dominant mutation in Arabidopsis thaliana. Science , 241 (4869), 1086-1089. Chang, C., Kwok, S. F., Bleecker, A. B., Meyerowitz, E. M. (1993). Arabidopsis ethylene-response gene ETR1: similarity of product to two-component regulators. Science , 262 (5133), 539-544. Schaller, G. E., Ladd, A. N., Lanahan, M. B., Spanbauer, J. M., Bleecker, A. B. (1995). The ethylene response mediator ETR1 from Arabidopsis forms a disulfide-linked dimer. Journal of Biological Chemistry , 270 (21), 12526-12530. Rodrıguez, F. I., Esch, J. J., Hall, A. E., Binder, B. M., Schaller, G. E., Bleecker, A. B. (1999). A copper cofactor for the ethylene receptor ETR1 from Arabidopsis. Science , 283 (5404), 996-998. Chen, Y. F., Randlett, M. D., Findell, J. L., Schaller, G. E. (2002). Localization of the ethylene receptor ETR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis. Journal of Biological Chemistry , 277 (22), 19861-19866. 欢迎关注 BioArt植物 微信公众号
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