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基于光固化水凝胶的轻量化3D细胞培养方案: heyongzju 2020-9-5 22:39; 组织工程极大地影响了基础生物学研究和生物医学技术的发展过程。长期以来，这些研究绝大多数都依赖于培养瓶、培养皿或孔板中常规二维（2D）细胞培养的实验结果。但是，这些2D培养结果可能与体内3D细胞外基质内细胞生长的实际情况大不相同，甚至完全相反。 3D细胞培养由于其更高的准确性和真实性而发挥着越来越重要的作用，未来3D培养的实验数据将会很大程度上取代2D培养的数据来佐证很多研究的意义及价值。然而，迄今为止3D培养技术还局限在一些有限的实验室，没有被广大生物及医学科研工作者所掌握及使用。 3D培养的操作方法能否像2D培养一样简单，成为生化实验室的常规方法？目前2D细胞培养已形成了从培养到后处理和表征的全套近乎标准的流程，这是2D培养如此流行的根本原因。近日， EFL 在 Bio-Designand Manufacturing期刊发表了题为 Facile 3D cell culture protocolbased on photocurable hydrogels的Technical Note ，给出了一种基于光固化水凝胶的轻量化3D细胞培养方案，谢明君博士为第一作者，贺永教授为通讯作者。研究人员通过系列的工具包括多型号的光固化水凝胶，固化环，可控光源和水凝胶裂解液实现3D细胞培养的简单、量化及可控。图1 轻量化的3D细胞培养流程工作流程步骤一：Bioink制备在实际的有机体中，不同的组织拥有具有特定成分和强度的基质，以实现一系列生物学功能。因此，就3D细胞培养而言，首先要考虑的因素是ECM的选择。用于体外3D培养的合适ECM具有三个主要要求：生物相容性水凝胶基底、合适的强度和其他必要的ECM成分。在这里，GelMA水凝胶因其出色的生物相容性和成型能力而被选作本文体外3D培养的ECM基础。根据体内的实际组织选择具有适当取代度和其他必要成分的GelMA水凝胶。例如，如果研究人员想在3D环境中培养肝细胞，则需要选择合适的GelMA类型，使其固化后可达到6-8kPa的拉伸模量。另外，需要将肝脏组织的无细胞基质添加到GelMA前驱液中。就软骨细胞而言，研究人员需要添加足够的透明质酸以实现其相关的生物学功能。选择了GelMA和其他成分后，通过将冻干的GelMA溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，制备合适的浓度，该溶液包含光引发剂（LAP）和选择的添加物。从培养瓶中分离细胞，并用制备的溶液重悬以形成生物墨水。第二步：在3D环境中培养在培养过程中，一方面，3D细胞培养需要全方位的物质交换空间，因此样品必须漂浮在培养基中，而不是简单地沉入培养皿底部。另一方面，尽管交联的GelMA水凝胶具有较高的生物相容性，但其机械强度较低，特别是具有较低取代度的墨水。这些3D样本总是太软，以致于无法在培养过程中保持初始形状并无法在随后的表征中进行操作。因此，考虑到这些难题，我们发明了固化环。将制备好的生物墨水浇筑到固化环上并用可定时的蓝光光源使其交联。固化环上的把手或支撑脚可以方便在操作时抓取样品，并为物质交换形成更大的空间，更密的固化环网格可以保持较低模量的交联GelMA的形状。第三步：细胞回收培养一段时间后，可以对样品进行后处理以进行细胞表征和分析。处理后的3D样本中存在两种情况。一方面，某些样品中的水凝胶无需降解，可以对细胞进行简单处理，例如对细胞产物进行染色，可以在光学显微镜或共聚焦荧光显微镜下直接观察染色的样品。另外，在某些生物学测试项目中，例如流式细胞仪（FCM），聚合酶链反应（PCR），酶联免疫吸附测定（ELISA）等，必须使用水凝胶分离3D样品中的细胞。因此，我们设计了GelMA裂解液，使固化的GelMA降解而不会损坏细胞，回收的细胞可用于这些表征当中。第四步：生物学表征通过回收的细胞，研究人员可以进行一系列生物学测试项目，例如显微镜观察，FCM，ELISA，PCR等。根据这些测试和分析结果，研究人员可以得出3D细胞体外培养数据，并可进一步估计不同刺激因素在相关生物医学应用中的作用。为了检查提出的3D细胞培养方案的可行性，我们以这种3D培养方式培养了不同种类的细胞，包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC），大鼠脂肪来源干细胞（rat-ADSC），人骨间充质干细胞（hBMSC）并测试了它们的存活率，伸展能力和分化。用5％（w/v）EFL-GM-60和0.5％（w/v）LAP制备GelMA前驱液。将HUVECss，大鼠ADSC和hBMSC分别混入其中并在EFL-SCR-2D-24-2固化环上固化。在完全培养基中培养HUVEC和大鼠ADSC，在成骨诱导培养基中培养hBMSC。观察发现，包裹的大鼠ADSC和hBMSC在培养的第一天和第七天都显示出高存活率。从固化环的光镜图像中，我们可以发现细胞均匀地分布在交联的GelMA内部的3D空间中。此外，包裹的细胞在培养7天后会在3D环境中扩散。该结果表明，在提出的3D培养方案中，包裹在3D固化环上的GelMA中的细胞可以保持较高的存活率和伸展能力。图2 3D培养中的细胞活力和传播能力。A）大鼠ADSC的存活/死亡。B）hBMSC的存活/死亡。C）大鼠ADSC的F-肌动蛋白/ DAPI。D）hBMSC的F-肌动蛋白/ DAPI。此外，研究人员测试了hBMSC的成骨分化和HUVEC的血管分化。与培养14天后的空白组相比，诱导的hBMSC显示出高碱性磷酸酶（ALP）表达，茜素红S（ARS）染色的钙结节也表明，包裹的hBMSCs实现了成骨分化。此外，包裹的HUVEC在细胞膜上显示了血小板内皮细胞粘附分子-1（CD31）的高表达，并显示了明显的细胞增殖。图3 3D培养中的细胞分化。 A）hBMSC的ALP表达。 B）hBMSC的ARS染色。 C）HUVEC的CD31表达。 D）HUVEC的增殖。后续我们可以基于其他种类的水凝胶基底（例如胶原、明胶、透明质酸等）进一步构建3D细胞外基质。此外，固化环的基本材料可以转变为功能性材料，例如导电材料，高强度的一种或多种与生物因子和纳米颗粒混合的材料，以便对包裹的细胞增加额外的刺激。这一全新概念可以引领细胞培养和相关生物医学应用领域的趋势。表1 光固化水凝胶产品种类表2 其他辅助工具【视频】基于光固化水凝胶的轻量化3D细胞培养方案光固化水凝胶 3D细胞培养辅助工具; 个人分类: 论文|5416 次阅读|0 个评论

GelMA水凝胶使用TOP10问题解惑: heyongzju 2020-7-2 08:32; 甲基丙烯酰化明胶（GelMA）由于具有生物兼容性好、可见光固化的特点，已广泛应用于细胞3D培养、组织工程、生物3D打印等研究领域，已有上万篇学术论文中采用了GelMA水凝胶。EFL团队研制的GelMA产品具有批次稳定、服务专业等优点，自推出以来，已服务哈佛、剑桥、麻省理工、香港理工、清华、北大、浙大、上交、华西、九院等国内外高校及医院的数百个课题组， EFL团队整理了GelMA使用的高频问题，可供参考。 Q1：1g GelMA可以配多少溶液？答：EFL推荐使用的常用工作液浓度为5%-10%（w/v），1g可以配10-20mL工作溶液，送引发剂。 Q2：GelMA怎么保存？固体-20℃，配成溶液-4℃吗？我放在-4℃冰箱里，发现溶液固化了，是不是变性了呀？答：无菌GelMA液体可以放4度保存，凝固是因为冷凝了，加热即可恢复。GelMA储存条件如下：干燥固体：-20℃，避光，6个月内有效。无菌溶液：4℃，避光，7天内有效；-20℃，避光，3个月内有效。GelMA溶液建议现配现用，多次反复冻溶无法保证固化品质。GelMA溶液具有温敏性，低温形成可逆的物理凝胶，室温或冰箱冷藏避光保存时凝胶化属于正常现象，加热即可恢复溶液状态。 Q3：GelMA溶解后是有点稠的液体，能过滤么？过滤损耗大吗？高浓度过滤会不会很费劲啊？有没有其他的灭菌方式啊？能121℃高温高压灭菌吗？答：可以过滤，可用0.22微米无菌过滤头过滤除菌。过滤损耗与浓度成正比，同一型号GelMA溶液过滤，浓度越高损耗越多，常用的5% (w/v)浓度过滤损耗率＜10%。常规5%（w/v）浓度优先选0.22um过滤除菌，高浓度不易过滤的可以选择巴氏灭菌，GelMA属于多肽类不能121℃高温高压灭菌会变性。 Q4：GelMA的取代度有哪些型号？在GelMA表面接种细胞，应该选什么型号的GelMA？如果把细胞混到GelMA里做三维培养，又应该选什么型号的GelMA？答：EFL目前有氨基取代度为30%、60%和90%三种固定型号的GelMA，均有现货。GM30、GM60和GM90均可应用于细胞培养，同等条件下，取代度越高，固化后的水凝胶强度越强。每种细胞的最适取代度和最适强度均有所不同，建议您先用三个型号的水凝胶分别做一下预实验，筛选最适合的型号、浓度及固化条件。在所有型号GelMA的表面接种细胞效果都很好；对于细胞混GelMA里做三维培养的型号选择上，EFL常用型号及使用参数推荐如下：5%GM30（w/v），EFL-LS-1601便携式固化光源光照30-60s。5%GM60（w/v），EFL-LS-1601便携式固化光源光照15-22s。 Q5：哪种型号的GelMA适合用于动物实验啊？答：各型号都可应用于动物实验，具体选用的型号和浓度要根据实验需求来选择，需要GelMA降解的慢就用高浓度高取代度，反之相反；如果是载细胞实验要同时考虑所需细胞效果的条件。 Q6：用GelMA负载外泌体或者ECM做细胞培养可以吗？能固化吗？有推荐的型号吗？答：可以的。EFL有很多客户做相关研究，调整好添加物与GelMA的比例固化没有问题，具体型号要看您对强度的需求以及细胞的特性。GM30、GM60和GM90均有客户使用，您可以先做预实验找出适合自己细胞的条件。 Q7：将GelMA铺在载玻片或者培养皿上，固化以后明胶就会粘在基底上，有什么方法可以避免明胶粘在基底，或者尽量减少粘附力？答：可以使用EFL的防粘膜。如果您是做细胞3维培养可尝试EFL的3维培养定制的固化环套装，可改善细胞在胶内的生长状态，便于后期表征操作。 Q8：请问怎么从GeMA中提取细胞做WB和PCR呢？答：您可使用EFL的GeMA裂解液(货号：EFL-GM-LS-001)来降解GelMA提取细胞，GeMA裂解液可在0.5-2h内快速降解GelMA并能较好的保持细胞的完整性和活性。 Q9：为什么我3D打印的GelMA网格载细胞支架有一面细胞长的好，有一面长的差呢？不是应该整个支架都长的差不多吗？答：EFLers实践经验表明，支架放在板孔中培养，贴板底侧没有上表面长的好，支架在培养基中悬浮培养，则整个支架细胞生长无明显差异。您可将打印好的载细胞支架置于EFL自主研发的固化环3D细胞培养辅具上培养，可使支架整个悬浮在培养基中，增强支架内细胞的物质代谢，改善您所遇到的问题。 Q10：为什么我同一次实验做出来的胶块里面，有的胶块细胞长的好，有的胶块细胞长的不好啊？答：您好！这可能与您的固化操作有关。您在固化过程中，需保持固化条件一致，光强、光照距离和光照时间相同。推荐您使用EFL自主研发的EFL-LS-1601便携式固化光源，该光源对比传统的手电筒光源，具有光强稳定，光照距离固定，光照时间可控等优点，可以很好的消除样本间制作的差异性。更多技术支持，请联系我们～; 个人分类: 科普|16534 次阅读|0 个评论

GelMA生物水凝胶可光固化性能堪比胶原的水凝胶: heyongzju 2018-9-22 09:08; 课题组几年前开始 GelMA生物水凝胶的产业化工作，我们建立了一整套的生产及测试规范，确保不同批次GelMA水凝胶性能的一致。GelMA水凝胶有接近胶原的生物兼容性，尤其适合细胞的三维培养，生物3D打印，载细胞结构等。和胶原相比，GelMA水凝胶可采用可见蓝光（405波长）即可快速固化，机械性能佳。这几年GelMA的应用越来越广，从迷你组织构建、细胞三维培养、植入治疗、伤口敷料等无所不包。我们也围绕GelMA做了系列的工作，从各种打印工艺的精确成形，到各种组织器官模型的构建。 GelMA水凝胶生物材料销售联系方式 GelMA.mp4 GelMA制造的微血管（内皮细胞迁移成管）基于GelMA的血管芯片（内皮成血管的各种抗体，炎症反应等都可在芯片上表达出来）; 个人分类: 科研乱侃|14281 次阅读|0 个评论

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