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大尺寸血管化组织的同轴生物3D打印方法: heyongzju 2020-3-23 08:28; 大尺寸血管化组织的同轴生物3D打印方法 4 Directly Coaxial 3D Bioprinting of Large-scale Vascularized.pdf 【背景】组织/器官内的血供系统，为组织提供了必须的营养及代谢交换。而组织体外重建时当尺寸200μm时，就会超出营养/氧气的扩散极限，需要构造丰富的血管系统，避免内部营养输送不畅。 2015 年，我们提出组织+营养通道一次性制造的同轴生物打印方法（Biomaterials, 2015，61, 203-215），用来制造带有营养流道的大尺寸结构，如图1所示。其基本原理是：将交联剂/水凝胶材料分别通入同轴喷头的内/外通道，交联剂和水凝胶在喷嘴出口处相遇，水凝胶发生快速交联形成中空凝胶管，再将凝胶管通过层层沉积形成带有流道的三维结构。然而，当时采用灌流内皮细胞悬液进行了血管化尝试，效果不佳，因为灌流内皮细胞悬液的方式只能实现简单结构的血管化，故而15年的工作重点聚焦在提升大尺寸组织的营养输送效率。图1 同轴打印血管通道 16 年我们开始探索如何深化，19年我们通过耦合牺牲打印和同轴打印工艺，提出组织/血管同轴3D打印思路，以实现血管+结构同步制造（图2）。通过设计核/壳型的GelMA/明胶墨水，利用同轴喷头将载组织细胞墨水(外喷头)和载内皮细胞牺牲墨水(内喷头)同时挤出，打印时牺牲墨水支撑流道，培养时牺牲墨水融化形成通畅的流道网络，同时内皮细胞从牺牲墨水中释放，粘附于流道内壁进行血管化，实现从流道网络到血管化网络的转变。基于此方法，实现了血管化大块组织结构（≥1 cm）的打印及体外长时间培养（≥20 days），并成功将其应用于血管化的肿瘤模型和骨组织的制造。图2 血管+结构一次性打印原理此外，在血管+结构的一次性打印策略中，由于载细胞墨水和牺牲墨水相互协同作用，相互增强了各自的可打印性，能够容易的实现复杂结构的打印。同时，由于实体结构的自支撑效应，可打印具有较高保证度的三维复杂结构，且在结构内的血管流道保持的较好（图3）。图3 三维复杂血管流道网络结构打印为了模拟生物体内细胞或细胞外基质组成多样性，我们还模拟制造了多细胞或多材料组织结构（图4、图5），采用多合一喷头装置，可以切换多种载细胞材料与牺牲材料进行同步打印。打印时，选择性的通入目标载细胞材料，同时通入牺牲材料，可以打印出含有血管流道的多组分组织结构体。图4 多组分血管流道网络结构打印原理图5 多组分血管流道网络结构为了验证血管流道网络输送营养/氧气的有效性，，我们打印了cm级的含血管流道网络的大块载细胞结构体(10 mm × 10 mm × 10 mm)，并观察结构体不同部位的细胞生长状况（图6），细胞在整个流道网络结构内均可逐渐伸展、迁移并连接，验证了流道网络的传输营养/氧气的有效性。图6 培养第6天时，乳腺癌细胞在结构内逐渐伸展并连接随后我们验证了通过内皮细胞自动沉积生成血管化通道的可行性，经验证内皮细胞可以自沉积并粘附到血管流道内壁，并随着体外培养而增殖，最终覆盖并内皮化流道网络，形成功能化的内皮管腔。（图7）。图7 内皮细胞自动沉积，可以有效的无死区的内皮化流道，同时内皮细胞在流道内增殖、伸展连接形成功能化的内皮管腔最后基于血管+结构一次性打印策略，我们打印了血管化的肿瘤组织，癌细胞在血管化组织结构内伸展，连接，同时内皮细胞覆盖并内皮化流道网络，最终形成功能化的血管化肿瘤组织（图8）。图8 血管化肿瘤组织与此同时，随着长时间的培养，内皮细胞会产生血管新生芽朝向肿瘤组织内部生长（图9），而且癌细胞会逐渐向血管流道方向迁移（图10）。这些实验结果说明打印的血管化组织具有相应的生物功能，模拟出了肿瘤组织的血管化、迁移和侵袭等特性。图9 血管出芽图10 癌细胞迁移最后，我们还打印血管化骨组织（图11），再次验证血管化大组织打印策略的有效性，血管+结构一次性打印方法突破了大块组织的体外制造瓶颈。图11 血管化骨组织血管+结构一次性打印方法简单实用，可有效的，无死区的使复杂血管流道网络血管化，促进了细胞的存活、伸展、迁移、连接及血管化组织的新生。同时载细胞墨水和牺牲墨水同轴打印自支撑实体结构，使得复杂结构的制造更加容易。而且，采用多合一喷头，可实现多组分血管流道结构的打印，使得多细胞或多细胞外基质的组织结构制造成为可能。此外，打印的血管流道结构后续可通过灌流培养，进行实时灌流下的血管化组织发育成熟过程研究。血管+结构一次性打印方法特别擅长于大尺寸组织的体外重建。相关论文“Directly Coaxial 3D Bioprinting of Large-scale Vascularized Tissue Constructs”近日刊登在Biofabrication杂志上。第一作者为邵磊博士生，通讯作者为贺永教授，傅建中教授，高庆博士为共同通讯。论文地址： https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab7e76 最受关注文章Top10 甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）生物3D打印操作教程 EFL团队2019年度总结 EFL招聘啦！ 3D打印构建全血管网络及肿瘤-血管相互作用初探自带荧光水凝胶来袭！生物3D打印-从形似到神似多尺度3D打印高生物相容性及力学强度兼具的组织工程支架高精度3D打印助力水凝胶类生物材料微纳结构精准制造 EFL课题组2018年度回顾生物3D打印入门概述加引用地址; 个人分类: 论文|4015 次阅读|0 个评论

甲基丙烯酸酐化明胶GelMA生物3D打印操作教程Protocol of 3D bioprinting: heyongzju 2019-12-26 12:17; 甲基丙烯酸酐化明胶GelMA生物3D打印Protocol 77 jove-protocol-60545-protocols-3d-bioprinting-gelatin-methacryloyl-hydrogel-based(1).pdf 摘要：甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)已成为生物3D打印领域的一种常用生物墨水。为了提升科研人员的生物3D打印效率，EFL团队总结了我们实验室各种GelMA打印的Protocol，其中包括GelMA微球、GelMA纤维、GelMA复杂三维结构和GelMA凝胶基微流控芯片的制备。甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA) 已成为生物3D打印中最通用的材料，GelMA最初由Van Den Bulkke等人于2000年提出。这种材料的来源是明胶（由哺乳动物的胶原蛋白水解而成）。因此，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列和基质金属蛋白酶（MMP）的靶序列保留在分子链上，有助于实现细胞的黏附和材料的降解。此外， GelMA 具有良好的成形性能，EFL-GM系列GelMA在可见光照下3-5s快速固化成胶。EFL团队近日受邀发表文章，总结了我们实验室的各种GelMA打印方法及流程，其中包括GelMA微球、GelMA纤维、GelMA复杂三维结构和GelMA凝胶基微流控芯片的制备。利用EFL-BP5800的微纳尺度打印机，可灵活方便的打印GelMA微球。利用EFL-BP6600系列+同轴打印模块，GelMA纤维在粘性海藻酸钠的辅助下也可高效制造。利用EFL-BP8600生物3D打印机可批量打印复杂的水凝胶三维结构。此外，将凝胶水凝胶与传统的微流控芯片相结合，通过二次交联的方法可构建基于GelMA凝胶的生物微流控芯片。论文题为“ Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks ”在实验视频期刊《Journal of Visualized Experiments (JOVE)》发表，谢明君博士生为一作，贺永教授为通讯作者。为了更好的普及各类GelMA结构的制造，EFL团队也一并录制了相关视频。视频中GelMA微球制备由谢明君博士演示操作，GelMA纤维制备由邵磊博士演示操作、GelMA复杂三维结构制备由喻康博士及孙元博士演示操作，GelMA凝胶基微流控芯片制备由聂晶博士演示操作。 https://www.bilibili.com/video/av80697900/ 一、GelMA微球的制备在制备凝胶微球的过程中，利用外加电场力将GelMA液滴分散。液滴落入接收的硅油中时可保持标准的球形，没有拖尾。这是因为凝胶滴属于水相，而硅油属于油相。在两相之间形成的表面张力使凝胶滴保持标准的球体形状。对于载细胞微球，从染色的乳腺癌细胞（MDA-MB-231s）细胞的形态（图1）可以发现，包裹的乳腺癌细胞保持良好的伸展能力，验证了这种电辅助制备方法的生物相容性。图1 GelMA微球的制备(EFL-BP5800微纳尺度打印机打印) 二、GelMA纤维的制备在GelMA纤维制备过程中，GelMA和海藻酸钠溶液分别在同轴喷嘴的内外喷嘴中流动。由于海藻酸钠比GelMA具有更高的粘度，GelMA在海藻酸钠溶液中的流动受到限制并保持线形。在光照（405 nm波长）条件下，内部GelMA交联并形成GelMA纤维（图2）。骨髓间充质干细胞（BMSCs）被包裹在GelMA纤维中，可以看到，包封的BMSCs在制备过程后保持着良好的伸展能力。图2 GelMA纤维的制备（EFL-BP6600系列+同轴打印模块）三、GelMA复杂三维结构的制备 DLP 打印机以其更高的精度被广泛应用于3D打印领域。EFL团队将DLP打印机用于构建形状更为复杂的GelMA三维结构（图3），通过计算机辅助设计软件构建“鼻子”、“耳朵”和“多室”的三维结构模型，并将其导入DLP打印软件中，构建各类具有复杂形状的GelMA结构。在构建的GelMA结构的表面上接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs），可发现附着在凝胶材料上的细胞铺展。这表明，利用DLP打印机建立具有复杂形状的GelMA三维结构在生物医学领域具有巨大的应用潜力。图3 GelMA复杂三维结构的制备（EFL-BP8600生物3D打印机制备）四、GelMA凝胶基微流控芯片的制备传统的微流控芯片是基于不具有生物降解性能的材料（即树脂、玻璃、聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA））构建的。EFL团队提出基于二次交联策略的GelMA凝胶基微流控芯片（图4）。生物墨水中的两个组分（GelMA和明胶）相继交联，通过按需设计的不同模具制造出具有各种微通道的芯片。同样的，在构建的流道内表面接种人脐静脉内皮细胞（HUVECs），可发现细胞可流入通道并附着在内流道壁上，形成宏观血管形状。图4 GelMA凝胶基微流控芯片的制备论文链接： https://www.jove.com/video/60545/protocols-3d-bioprinting-gelatin-methacryloyl-hydrogel-based; 个人分类: 论文|4065 次阅读|0 个评论

生物3D打印带纤维GelMA微球：三维共培养新思路: heyongzju 2019-11-26 22:24; 生物3D打印带纤维微球：三维共培养新思路 3D biofabrication of microfiber-laden minispheroids a facile 3D cell co-culturin.pdf 背景：在实际的生物体中，许多组织都是由球状结构和纤维结构组成，而不是由单一类型的结构组成。为了模拟体内这些组织中的细胞相互作用，需要探讨如何在体外建立具有不同结构类型的异质组织模型。摘要：由球体和纤维结构组成的异质组织，例如肿瘤，胚胎和肾小球等，广泛存在于生物体中。作为体外组织模型，已经开发了独立构建球状和纤维结构的方法。然而，同时打印它们并进行集成以更真实的模仿体内环境仍有很多工艺有待解决。EFL团队提出了一种3D细胞共培养新思路—— 负载纤维的水凝胶微球。该技术应用同轴生物打印和电喷墨技术，并利用多组分流体流动时的“悬绳效应”，实现了带复杂纤维结构的微球制造，并将其应用于三维共培养。相关工作以题为“3D Biofabrication of Microﬁber-Laden Minispheroids: A Facile 3D Cell Co-Culturing System”在Biomaterials Science 上在线发表。谢明君博士为第一作者，浙江大学机械工程学院贺永教授为通讯作者。 http://doi.org/10.1039/C9BM01189G 这种三维共培养微球通过同轴生物3D打印结合电流体喷墨实现不同结构的形态及尺寸控制。GelMA生物水凝胶以其优异的特性被选作为该共培养系统的基本材料。纯GelMA从外喷头流出，形成球状结构。GelMA与海藻酸钠混合（用于增加粘度）从内喷头流出，在球体内形成纤维结构。图1 制造原理图为了深入分析两相流体的流动状态，使用高速摄像机观察了该结构的基本制造过程。由此，文章详细分析了其制备过程以及对纤维和球尺寸影响的参数，证实了该策略的制备可行性。图2 电场作用下液滴状态及产球频率图3 载纤维迷你球结构及尺寸分布此外，在这种制造方法中，纯GelMA溶液以及混合未交联海藻酸钠的GelMA溶液被用于构建封装细胞的微环境。考虑到材料系统将对细胞生长和功能化产生重大影响，文章详细研究了该材料体系的各项性能。发现该材料系统具有良好的SEM形貌，降解曲线，孔面积分布和压缩特性。值得注意的是，与未交联的藻酸钠混合的GelMA显示出比纯GelMA大得多的孔隙，为物质交换和细胞生长提供了更大的空间。图4 材料体系理化特性表征最后，我们证明了HUVECs和MDA-MB-231s细胞在该结构中能保持较高的生存能力。重要的是，转染的HUVECs与MDA-MB-231s在共培养的条件下表现出明显的相互作用。在肿瘤细胞的影响下，HUVECs的肌动蛋白逐渐延长。经过十三天的培养后朝向肿瘤细胞生长，而HUVEC单独培养时并没有表现出相同的现象。图5 内皮细胞与肿瘤细胞在共培养体系中的存活情况图6 内皮细胞与肿瘤细胞在共培养体系中的F-Actin及DAPI染色; 个人分类: 论文|4980 次阅读|0 个评论

纳米粘土辅助的生物水凝胶复杂支架3D打印: heyongzju 2019-3-19 16:55; 纳米粘土辅助的生物水凝胶复杂支架 3D 打印 3DPrintingofComplexGelMA-basedScaffoldswithNanoclay.pdf 生物水凝胶在生物 3D 打印中为细胞提供接近细胞外基质的环境，面向创伤再生的可定制化，理想的可生物 3D 打印的水凝胶必须有要兼顾可打印性及生物活性。课题组所产业化的 GelMA 水凝胶，尤其是低浓度的 GelMA ，具有优良的生物相容性。但是，低浓度 GelMA 水凝胶粘度很低（接近于水），常规 3D 打印设计并不能有效打印这种材料。如何打印 GelMA 水凝胶的复杂结构，一直是一个难点。图 1. 课题组实现的复杂水凝胶支架打印（分叉血管、耳朵）为了解决 GelMA 水凝胶的打印难题，我们设计了一种 Nanoclay/GelMA 复合打印策略，使其既能够在普通条件下进行打印，又保留了 GelMA 水凝胶良好的生物相容性。我们对这种材料的打印特性以及生物特性进行验证，并且将制造过程划分为挤出、沉积、融合三个阶段，系统的研究了不同的元素对支架制造过程的影响，给出具体的打印工艺窗口。图 2. 打印原理以及水凝胶材料流变性能 Nanoclay/GelMA 生物墨水具有良好的剪切变稀性能和自支撑性能。打印过程中，这种材料可以在溶胶状态（低粘度）和凝胶状态（高粘度）切换。挤出过程中，生物墨水受到剪切力的作用，粘度降低成为溶胶状态，很容易被挤出。沉积到打印平台后，剪切力消失，生物墨水快速恢复到凝胶状态。 GelMA 是一种光敏材料。利用 Nanoclay/GelMA 生物墨水打印的结构可以在紫外光下完成光交联，成为稳定的组织工程支架。图 3. GelMA/Nanoclay 生物墨水挤出过程可打印性研究在挤出过程中，由于剪切力的存在，生物墨水纤维会产生膨胀。我们将膨胀率定义为 α=D/d （ D 为生物纤维直径， d 为喷头直径）。 α 值越小，生物墨水纤维膨胀程度越小。对于同一种材料，喷头直径与挤出速度会对 α 值产生明显的影响。 α 值与喷头直径成反比，与挤出速度成正比。而且随着生物墨水中 Nanoclay 含量的增加， α 值也呈现减小的趋势。根据这些数据， α 值在（ 1.2, 1.5 ）这个区间内时，生物墨水纤维的性能良好。图 4. GelMA/Nanoclay 生物墨水沉积过程可打印性研究由于自身重力以及喷头挤压，生物墨水纤维沉积在打印平台时会发生变形。纤维界面会由圆形变为椭圆形。我们将这种变形定义为 β=W/D （ W 为纤维宽度， D 为纤维直径）。 β 值越小，变形越小。在保持挤出速度不变时，生物墨水浓度、层高、打印速度是对 β 值产生影响的重要因素。根据实验结果，随着层高以及打印速度的增加， β 值减小。生物墨水中 Nanoclay 的含量越高， β 值越小。当 0.9 ＜ β ＜ 1.2 时，生物墨水纤维沉积后的效果良好。我们将这个区间定义为当前阶段的可打印窗口。图 5. GelMA/Nanoclay 生物墨水融合过程可打印性研究在打印中，不同层的生物墨水纤维会产生融合。融合程度对打印结果会产生较大的影响。严重时可能会造成打印的结构失真。这种融合的结果体现在结构上就是打印结构的实际高度和面积与理论值不同。网格与圆柱是两种比较有代表性的结构。我们定义两个参数 θ 和 γ 来表示这两种结构的融合程度。 θ=S/S 0 （ S 为单个网格实际面积， S 0 为单个网格理论面积）， γ=H/H 0 （ H 为实际高度， H 0 为理论高度）。 θ 和 γ 的值越大，融合程度越小。 GelMA/Nanoclay 生物墨水中 Nanoclay 的含量，是否边打印边进行光交联反应，都会对 θ 和 γ 的值产生影响。我们通过实验发现，增加 Nanoclay 的含量，采取边打印边固化的方式，都能够抑制融合现象。当 θ 和 γ 的值都在（ 0.8, 1 ）这个区间内时，打印的结构基本可以满足我们的需求。所以我们将这个区间定义为此工艺阶段下的可打印窗口。图 6. 水凝胶支架的机械性能研究组织工程支架需要满足细胞培养的需求，包括营养流通、维持水性环境。与 GelMA 相比， GelMA/Nanoclay 生物墨水具有较高的强度。 GelMA/Nanoclay 生物墨水的机械强度与 Nanoclay 的含量成正比。利用 GelMA/Nanoclay 生物墨水打印出的组织工程支架具有明显的孔隙，尤其是侧孔。这些孔隙对于营养的流通是非常有帮助的。 GelMA/Nanoclay 支架的平衡溶胀率和 GelMA 相比略有下降，但是依然维持在较高水平。这种特性对于维持水性环境是非常重要的。图 7. 水凝胶支架的生物相容性研究为了验证 GelMA/Nanoclay 支架的生物特性，我们分别将内皮细胞接种在 GelMA 支架和 GelMA/Nanoclay 支架上。经过 5 天的培养之后，这两种支架上的细胞均有较高的存活率，而且没有明显差异。所以，加入 Nanoclay 并不会对 GelMA 支架的生物相容性产生不利影响。利用我们的研究内容，可以打印出具有良好生物相容性的个性化结构。相关论文“ 3D Printing of Complex GelMA-based Scaffolds with Nanoclay ”已被 Biofabrication 杂志录用，一作为高庆博士、牛雪峰硕士为共同一作，通讯作者为贺永教授。论文 DOI ： 10.1088/1758-5090/ab0cf6; 个人分类: 论文|5373 次阅读|0 个评论

电场辅助生物3D打印载细胞GelMA微球: heyongzju 2018-12-21 09:47; 电场辅助生物打印载细胞GelMA微球 66 Electro-Assisted Bioprinting of Low-Concentration GelMA Microdroplets.pdf 微球由于结构简单，广泛应用在生物医疗领域，诸如注射治疗、细胞三维培养、药物载体等中。基于微球构造迷你类器官一直是课题组这几年的关注重点。微球类迷你组织构建要解决两大问题：其一、找到生物学性能优异的生物水凝胶；其二、发展出基于该水凝胶的可量化稳定生产的制造工艺，毕竟如果要想后续能真正应用，必须要有量化生产的工艺。打印是一种量化生产方法，而课题组所产业化的可光固化的 GelMA 水凝胶也是一种性能堪比胶原及基质胶的生物水凝胶。 GelMA 水凝胶 , 尤其是在低浓度的 GelMA 有无比优越的生物学性能。可惜低浓度时 GelMA 水凝胶粘度很低，比水高不了多少，导致其成形一直是个难点，尤其是载细胞微球的打印更是困难。我们发展了基于电场辅助的微球生物打印方法，其原理是通过高压电场的吸附，从喷嘴中拉出微液滴，通过油相的接收装置收集后，使用可见光即可高效批量固化载细胞微球。我们系统的探讨了各个工艺参数（电压、气压、喷嘴直径）对载细胞微球打印的影响，定义了四种微球打印状态， (i) Microdripping. (ii) Taylor jet. (iii) Oscillating jet. (iv) Shaking spindle ，给出了工艺窗口。为了展示打印微球的广泛应用前景，我们给出了三个典型应用： 1 、用于细胞包裹，载间充质干细胞（ BMSC ）的微球第二天就有很好的伸展发育，第三天就完全伸展发育。 2 、药物控释，使用葡聚糖及牛血清蛋白包裹于微球中，均有很好的控释效果。 3 、作为生物砖进行生物 3D 打印，我们将载细胞微球作为成形单元，通过控制喷头有序移动可直接实现三维载细胞结构的打印。图 1 电场辅助的载细胞微球生物打印原理图 2 微球打印时不同的形态划分图 3 微球打印工艺窗口图 4 BMSCs 包裹于微球中图 5 GelMA 微球直接用于打印载细胞三维结构相关工作已发表在 Small （ IF=9.6 ）上，一作为谢明君博士、高庆博士后为共同一作，通讯作者为贺永教授。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/smll.201804216; 个人分类: 论文|5729 次阅读|0 个评论

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