同轴生物3D打印器官原型——从营养输送到血管化 97 Coaxial 3D bioprinting of organ prototyping, from nutrients delivery to vascu.pdf 组织/器官内的血供系统，为组织提供了必要的营养及代谢交换。而在体外构造组织/器官原型时，如何在大尺寸结构中构建营养网络，是一个长期以来的技术难题。近年来，同轴生物3D技术的发展为该问题的解决提供了一种极具潜力的解决方案。同轴生物3D技术的基本原理是：使用同轴喷头将外层的水凝胶材料和内层的牺牲材料共同挤出，打印为所需的复杂结构，内层的牺牲材料去除后形成的中空通路即成为了后续培养中的营养网络。该技术结合了传统生物打印方法和牺牲组分3D打印方法的优点，能够一步构造内置营养网络的大尺寸仿生结构，在组织工程和器官重建等领域具有突出的优势。 近期，EFL受浙大学报英文版的约稿，结合课题组这几年围绕同轴生物3D打印所做的一些工作，梳理和总结了该技术的最新研究进展，撰写了相关综述。该综述主要关注以下几点： （1）在同轴3D打印血管时必须考虑的因素；（2）首选生物材料清单；（3）内皮化通道的制造原理及其潜在机制；（4）同轴生物3D打印的最近进展；（5）未来的挑战 。 首先，论文概述了当前生物3D打印中常用的水凝胶材料，包括海藻酸钠（Alginate），明胶/甲基丙烯酸酐化明胶（Gelatin/GelMA）和胶原（Collagen）等，介绍了这些材料的生物相容性、可打印性、打印原理等生物3D打印中重点关注的因素。 随后，论文详述了同轴生物3D打印的基本原理，技术特点以及使用该技术构造内含营养网络，特别是血管化的大尺寸结构的最新尝试。最新的研究进展表明，该技术为快速制造血管化的组织/器官原型提供了可能。 最后，论文展望了同轴生物3D技术未来可能的发展方向。 题为“Coaxial 3D bioprinting of organ prototyping, from nutrients delivery to vascularization”的综述论文在Journal of Zhejiang University-SCIENCE A 期刊上在线刊登，博士生Hamed Ramezani为第一作者，贺永教授为通讯作者。论文链接： http://www.jzus.zju.edu.cn/iparticle.php?doi=10.1631/jzus.A2000261 . 图1. 使用同轴3D打印方法构建血管化组织/器官的基本要求 图2. 3D打印的基本过程 图3. 同轴3D打印制造的血管化结构 图4. 同轴3D打印制造内含营养网络的大尺寸结构
EFL课题组生物3D打印研究阶段性工作总结 生物 3D 打印（ 3DBioprinting ）又称“生物增材制造”，从广义上来分，生物 3D 打印大致可划分为四个层次：第一层次为制造无生物相容性要求的结构，比如目前有广泛应用的手术路径规划用产品的 3D 打印、手术导板等；第二层次为制造有生物相容性要求，不可降解的制品，比如钛合金关节、缺损修复的硅胶假体等；第三层次为制造有生物相容性要求，可降解的制品，比如活性陶瓷骨、可降解的血管支架等；第四层次就是狭义生物 3D 打印，即操纵活细胞构建仿生三维组织，比如打印药物筛选及机理研究用的细胞模型、肝单元、皮肤、血管等。 开发合适的生物墨水一直是生物 3D 打印中的一个核心问题，浙江大学贺永教授课题组多年从事生物 3D 打印研究，已成功实现 GelMA 基“生物墨水”的产业化，解决了生物墨水的批次差异性大、批量化稳定性差等问题，被国内外百余个课题组所应用。生物墨水作为典型的软物质材料，可打印性一直是研究的焦点所在，该课题组对可打印性进行了系统的研究，从墨水的调控、打印中的误差控制、研究精准成形工艺等角度对生物墨水的可打印性展开了系列研究，实现了水凝胶精确打印及单细胞分辨率的操控（图 1 ） 。 图 1 GelMA 水凝胶复杂结构打印 GelMA基生物墨水 活性组织内遍布的各类血管是器官保持活性的根本，只有有效的加工出相似的血管网络才有可能实现营养的有效输送，确保 3D 打印后形成一个真正的活性器官。 常见的方法是先制造类似血管的流道结构，然后包覆在凝胶结构中，或者是基于牺牲工艺的流道构建技术。但是这些方法需要的工艺过程复杂，无法实现支架结构和流道网络的同时打印，难以在内部构造有效的流道。贺永课题组提出了一种全新的基于中空凝胶纤维融合工艺的细胞打印方法，实现了支架结构和流道网络的同时成形（图 2 ）。通过课题组自行研发的三维打印机，利用同轴喷头制造出中空凝胶纤维，通过三维打印平台控制中空凝胶纤维的沉积位置以及控制凝胶反应的交联时序，使中空凝胶纤维融合一起形成具有内置流道的三维结构。课题组通过大量的工艺实验，系统解决了凝胶融合工艺；证实了融合后的凝胶结构强度适合于器官打印要求；并通过后续的细胞培养验证了营养通道的有效性 。在本方法的基础上，课题组提出了一种血管 3D 打印工艺，该工艺能实现宏微跨尺度血管结构的打印，宏观流道可用于各种机械力的加载，微观通道可用于营养输送以及化学物质的加载。课题组通过大量的工艺实验，系统解决了跨尺度血管结构的成型问题，成功构建出了含成纤维、平滑肌及内皮细胞的三层血管结构 ，进一步的课题组建立了体外血管模型， CD31 、 Vinculin 及 Ve-Cadherin 抗体染色表明，已成功构建出了接近体内血管功能的血管芯片。随后通过炎症诱导因子的加载，模拟了动脉粥样硬化等病理条件下血管的炎症反应 。在相关工作的推动下，同轴生物 3D 打印方法已经发展成为一个新兴的研究方向。 图 2 同轴生物 3D 打印方法 类器官是药物评价、器官病变机制等研究的有效工具，课题组发 明了一种气流辅助异质螺旋微球类器官的成型工艺（图 3 ）， 首次实现了 在微球内构造出复杂的活性结构 。该方法 精度可达到单细胞分辨率，为类器官的高效及精准构建提供新思路，相关工作刊登在 Small 杂志上并被选为封底论文 。 课题组受到旋绳效应的启发，实现了 GelMA 材料异质微纤维的制造，可打印多种组分，多种形态的纤维状迷你组织。在微纤维中包裹了内皮细胞，内皮细胞在很短的时间内即可迁移到纤维表面，形成螺旋等各种微血管结构 。此外，课题组提出了电场辅助的 GelMA 微球制造方法，解决了低浓度 GelMA 成形的难题。通过细胞包裹、药物控释、生物 3D 打印三个典型案例展示了 GelMA 微球在组织工程领域的潜在应用 。 图 3 气流辅助异质微球类器官的成型工艺 生物 3D 打印的组织结构除了在器官发育机制、病变机理、药物评价领域有众多应用外，课题组一直在思考如何将载细胞打印变成成标准的临床产品。从临床产品视角出发，我们认为打印的结构需要满足： 1 ）包裹细胞的水凝胶材料生物性能优异，便于让包裹的细胞发育出功能； 2 ）打印工艺简单稳定，可量化稳定制造； 3 ）打印后的结构可长期储存，能像创可贴一样随取随用。由于水凝胶纤维结构简单，易于营养渗透及包裹细胞的功能化，我们认为水凝胶纤维是非常有潜力成为临床产品的结构。围绕这三个需求，课题组选用高生物活性的 GelMA 水凝胶作为细胞包裹材料，在纤维上成功实现了血管类器官、毛细管新生（血管出芽）、血管化肿瘤等结构的构造，证明了 GelMA 载细胞结构可以高效的实现细胞的功能化；开发了同轴打印工艺，可稳定、大批量地制造 GelMA 纤维，实现载细胞纤维的量化生产；制备的载细胞纤维还可通过冻存长期稳定的保存，取出后又可快速恢复功能，这样可建立一个载细胞微纤维银行，实现随取随用。相关工作刊登在 Advanced Heathcare Materials 杂志上并被选为封底论文 。 图 4 产品化载细胞 GelMA 纤维的要求 基于以上研究，课题组已发表相关论文 20 余篇（ 3 篇封面），撰写著作 1 部 ，如图 5 所示。此外，为了降低医学人员使用生物 3D 打印机的门槛，课题组还联合苏州智能制造研究院产业化了 EFL-BP 系列模块化生物 3D 打印机（图 6 ），其最大特点是可直接置入超净工作台，功能通过模块可灵活配置，操作简单易用。可搭载气动、挤出、高精度直写（ 3 到 5 微米打印精度）、光固化等喷头，支持细胞、水凝胶、生物陶瓷、 PLA 、 PVA 、 PBS 等材料。 图 5 课题组撰写的专著及发表的论文封面 图 6 苏州智能制造研究院推出的 EFL-BP 系列生物 3D 打印机 （ a ） BP66 系列挤出式打印机；（ b ） BP58 系列高精度（2微米精度）打印机；（ c ） BP86 系列（全球首款商业化投影式光固化生物 3D 打印机） He Y, Yang F F, Zhao H M, et al. Research on theprintability of hydrogels in 3D bioprinting . Scientific reports, 2016, 6:29977. Gao Q, Niu X, Shao L, et al. 3D printing of complexGelMA-based scaffolds with nanoclay . Biofabrication, 2019,11: 035006 . Gao Q, He Y, Fu J, et al. Coaxial nozzle-assisted 3Dbioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery .Biomaterials, 2015, 61: 203-215. Gao Q, Liu Z, Lin Z, et al. 3D bioprinting of vessel-likestructures with multilevel fluidic channels . ACS biomaterials science engineering, 2017, 3(3): 399-408. Nie J, Gao Q, Wang Y, et al. Vessel ‐\ on ‐\ a ‐\ chip with Hydrogel ‐\ based Microfluidics .Small, 2018, 14(45): 1802368. Zhao H, Chen Y, Shao L, et al. Airflow ‐\ Assisted 3D Bioprinting ofHuman Heterogeneous Microspheroidal Organoids with Microfluidic Nozzle .Small, 2018, 14(39): 1802630. Shao L, Gao Q, Zhao H, et al. Fiber ‐\ based mini tissue withmorphology ‐\ controllableGelMA microfibers . Small, 2018, 14(44): 1802187. Xie M, Gao Q, Zhao H, et al. Electro-Assisted Bioprintingof Low-Concentration GelMA Microdroplets . Small, 2018: 1804216. Shao L , Gao Q , Xie C , etal. Bioprinting of Cell-Laden Microfiber: Can It Become a Standard Product? . Advanced Healthcare Materials, 2019: 1900014 贺永，傅建中，高庆著. 生物3D打印：从医疗辅助制造到细胞打印，华中科技大学出版社，2019
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