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公布若干有关电磁场对神经细胞影响的研究进展（之二）：30mT恒定磁场对神经细胞钠通道特性的影响: 人为峰 2009-8-7 22:43; 30mT恒定磁场对神经细胞钠通道特性的影响 1引言随着现代科学技术的飞速发展，各种电子产品、电器设备也大量普及到人们的生活中，由此产生的磁场对人类产生的影响也越来越大，因此研究磁场对生物组织的影响有很重要的价值。人体中神经系统对磁场的作用最为敏感，尤其以丘脑下部和大脑皮质最为突出。关于磁场对生物组织影响方面的研究陆续出现。如：脉冲电磁场具有止痛作用；治疗用电磁场可以安全的减少瘤细胞的生长和增值，治疗用电磁场作为有益的辅助可以增加常规瘤治疗的治疗指数；磁场的应用可以刺激体外培养的骨细胞的生长；风湿性关节炎和正常的关节对特殊脉冲磁场的响应是不同的；4mT恒定磁场能通过抗氧化损伤保护Schwann细胞；人类DNA的一些位置在无线电频率电磁场的作用下更多的倾向于变化，并且无线电微波照射会对细胞增殖动力学产生明显的影响；利用8T静磁场作用于施沃恩细胞队列的磁场控制在医学工程应用中是有益的；0.2T静磁场对人类神经细胞有重要的生物效应。但是目前大多数研究停留在生物整体或器官方面，这会出现由于个体差异、基因遗传和环境等方面的影响。而利用膜片钳技术深入到细胞和分子水平的研究，如从细胞膜离子通道、动作电位特性方面，可避免这种情况。另外，研究低强度磁场（30mT量级）对神经系统影响的报道也很少见。本文就是在细胞水平上，利用膜片钳实验技术，通过对30mT恒定磁场作用的小鼠皮层神经元钠离子通道特性影响的研究，为从细胞和分子水平探索低强度恒定磁场的生物刺激效应开辟了一条新的道路，为人们研究磁场对神经系统的影响提供依据。 2材料与方法 2.1材料动物：昆明小鼠，鼠龄10～13天，雌雄不限，中国医学科学院放射医学研究所提供。试剂：链霉蛋白酶（Pronase），为Merck公司产品。河豚毒素（TTX）、氯化镉（CdCl2）、4－氨基吡啶（4－AP）、氯化四乙胺（TEA-CL）、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、已二醇－双（2－氨基乙基）四乙酸（EGTA）、氯化铯（CsCl）、氟化铯（CsF）、Na2ATP均为Sigma公司产品。下列用到的试剂均为国产分析纯。（1）孵育液(ACSF,mmol/L)：NaCl134，KCl5，NaH2PO41.5，MgSO42，CaCl22，NaHCO325，Glucose10，HEPES10，pH7.3；（2）细胞外液（mmol/L）：NaCl130，KCl5.4，CaCl22，MgCl21，Glucose10，HEPES10，pH7.3，使用前经0.22滤膜过滤并通95%O2+5%CO2混合气饱和；（3）电极内液（mmol/L）：CsCl70，CsF70，HEPES10，EGTA10，Na2ATP3，MgCl22，pH7.2，经0.22滤膜过滤。 2.2小鼠额叶皮层锥体神经元急性分离考虑到价格、鼠源及现取现用等方面的原因，本文采用昆明小鼠进行实验，在国内外的文献中很少有用小鼠去进行膜片钳实验的。通过相关文献的查阅和长期细胞的制备，可以得到符合膜片钳实验的很好的细胞。小鼠断头取脑，置于0～4°C孵育液中迅速取出额叶皮层，手工切成400~600厚的脑片，置于孵育液中，连续通入95%O2+5%CO2混合气，孵育50分钟，而后将加入Pronase，使其终浓度为0.3g/L，32°C下消化15min。消化结束用孵育液洗脑片3次，加入盛有标准细胞外液的离心管中，用不同口径的Pasteur吸管轻轻吹打，制成细胞悬液，静置2-3min后取上部细胞悬液，放入带有盖玻片的培养皿内，约20min后细胞贴壁，即可用于全细胞膜片钳记录，分离完整的皮层神经细胞可在4～6小时内保持良好的生理状态。 2.3磁场装置的设计及照射本文采用磁铁产生磁场，通过选择不同大小的磁铁及调节磁铁之间的距离来改变磁铁间的磁场大小及选择符合要求的磁场均匀度。用PF-035型数字特斯拉计可测得磁铁间的磁场强度及均匀情况，从而得到所需的磁场。本实验选用30mT的磁场强度。在膜片钳实验记录时将上述所得的贴壁好的细胞放置于磁铁中间，如图1所示，刺激的同时进行记录。磁场作用于细胞15min、30min、1h和80min时记录数据。实验过程中能够在倒置显微镜下观察磁场作用于目标细胞上的情况。图1磁场照射示意简图 2.4全细胞膜片钳记录和数据分析 1GΩ）后，立即进行快电容补偿，然后稍加负压破膜，使电极内液与细胞内液相通，再进行慢电容和串联电阻补偿。之后在设定的刺激电压下，观察通道电流的激活情况。实验结果分析采用Clampfit软件和Origin6.0统计软件完成，数据经P/N漏减处理后进行统计分析，分析结果用Mean±SD表示，磁场照射前后差异的显著性用单因数方差分析和检验进行分析。 3结果 3.1钠通道电流(INa)的记录采用上述标准细胞外液和电极内液，且在外液中加入34－AP、0.1的CdCl2和30的TEA-Cl后，记录皮层锥体神经细胞膜上内向钠电流。置钳制电位于-100mV，给予脉冲幅度为-100mV～+60mV，脉冲宽度20ms，步幅+10mV的去极化脉冲刺激电压(图2A)，刺激频率0.2Hz，记录得到一组内向电流，该激活的外向电流具有快速激活和快速失活的特性（图2B），即为钠电流INa。向外液中加入1TTX后可绝大部分阻断之，证实所记录到的内向电流为钠电流。由于INa电流具有激活和失活迅速的特点，故刺激脉冲宽度选择20ms的刺激时程。图2记录的INa电流曲线 (A)刺激脉冲(B)记录的INa电流曲线 3.2恒定磁场照射对INa时间依赖性的影响考察正常皮层神经细胞INa电流何时达稳定，数据的记录应该在通道电流稳定的时间区段内进行。给予脉冲幅度-30mV，脉冲宽度20ms的去极化脉冲刺激，分别在2、4、6、8和10min记录不同时间的INa，可知INa在4min基本达到稳定，数据记录应该从此时刻开始进行。图3为给予不同阶梯去极化脉冲刺激，经磁场作用15min、30min、1h和80min后的INa电流的曲线。由实验结果可知：静磁场作用后，INa幅度都有明显增大。图3磁场照射不同时间对INa电流I-V曲线的影响 3.3恒定磁场照射对钠电流曲线的影响给予同3.1中相同的刺激方式，对未被照射的细胞进行激活并记录INa作为对照组。然后在磁场对细胞照射30min时以相同的刺激方式进行激活并记录作为磁场作用对照组。本文选用膜电容相同的细胞记录作为对照，其磁场刺激前后的INa曲线如图4所示。以不同膜电位（去极化刺激电位）为横轴，该膜电位下激活的INa电流密度值（电流/膜电容）为纵轴，绘制通道电流的曲线（图5）。由曲线可知磁场照射可以明显抑制INa，且抑制作用随着膜电位的改变而改变，即呈现出电压依赖特性。对照组、照射组的最大激活电流密度分别为347.73pA/pF、499.07pA/pF（n=10,P<0.05）。经检验，对照组和磁场照射组INa在统计学上有显著性差异（n=10,P<0.05）。由此可知，磁场作用可电压依赖性地抑制钠通道电流。图4INa电流变化曲线 (A)磁场未作用的电流曲线(B)磁场作用30min后的电流曲线图5对照组、磁场照射组INa的曲线 3.4静磁场照射对INa稳态激活特性的影响 0.05）。由此可知，磁场作用可略微改变INa的激活特性，但没有显著性差异。图6对照组和磁场照射组钠电流稳态激活曲线 3.5静磁场照射对INa稳态失活特性的影响 0.05）。由此可知，磁场作用可明显改变INa的失活特性，使失活曲线向超极化方向移动，同时改变其斜率因子。图7INa失活的刺激波形和记录的电流曲线，下图是上图部分的放大 (A1)和(A2)刺激脉冲(B1)和(B2)记录的电流曲线图8对照组和磁场照射组钠电流稳态失活曲线 4结论实验结果表明，30mT的磁场照射，使小鼠额叶皮层神经细胞膜钠通道电流INa显著增大，且这种增大作用呈现时间依赖性、电压依赖性。结果还表明，30mT恒定磁场作用可使小鼠皮层神经元的INa的稳态激活曲线略微左移，基本没有显著性变化，失活曲线显著性左移，且改变其斜率因子。相比RosenAD 研究的125mT恒定磁场对钠通道的影响，本文30mT对神经细胞钠通道特性的影响更显著，可见，不同的细胞、磁场强度大小及磁场的作用时间会产生不同的实验结果。磁场的生物刺激作用机制和作用靶点目前尚不明确，仅限于一些假说。磁场对生物细胞的影响是多种多样的，它能够使细胞内电荷运动方向发生改变，使电子或离子不能达到正常的生理功能位置，生物分子之间的亲和力受到破坏，从而抑制细胞周期的正常进行，导致细胞分裂停止。另外，磁场作用亦可促进组织细胞带电颗粒的运动，调整生物分子的液晶结构，改变胞膜的通透性，促进新陈代谢过程，加强组织细胞的生长。另一方面，在生物膜上反磁性分子是以高度规则方式排列，并以平行的反磁体矢量连接发挥作用。磁场的作用也可能导致各向异性反磁性分子的再定位。本实验从细胞膜电压门控钠离子通道角度研究磁场的生物刺激作用。从实验结果得出，30mT恒定电磁场可能导致了细胞膜上离子通道的电荷的运动或者反磁性分子的排列，从而导致了钠通道的离子通道特性的改变。本实验结果提示弱磁场的生物刺激作用与细胞膜离子通道特性及通道构形变化有关，但仍需进一步从分子生物学及细胞信号转导方面进行分子层面的理论和实验验证。参考文献 ShupakNM,PratoFS,ThomasAW.Humanexposuretoaspecificpulsedmagneticfield:effectsonthermalsensoryandpainthresholds .NeuroscienceLetters,2004,363:157-162. 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