镜面轴向超分辨 席鹏 镜子或许是人类发明的最古老的光学仪器。唐太宗李世民就曾写道：“以铜为鉴（镜），可以正衣冠”。而由于镜子是一个典型的理想光学系统（能够将一个单心光束转换为另一个单心光束，点对点映射），这一系统直到目前还被人们广泛地应用在日常生活中。 图 1 镜子是我们日常应用最广泛的光学器件。图片来源于网络。 而最近，我们实验室实现了利用镜面反射的干涉原理，得到了轴向6倍的分辨率提升（100nm轴向成像宽度），和对于STED的水平分辨率的2倍提升。通过这一技术，我们得到了STED上19 nm的分辨率，成功地观察到了细胞核孔的环状结构和人类呼吸道和包体病毒蛋白的中空结构。 这一技术广泛兼容于共聚焦和STED系统，不需要改变光路即可实现，因此能够迅速让广大生命科学工作者从中得益。 这一工作发表在Light:Science and Applications ，并迅速受到国际媒体关注。在最近，这一工作被Nature Photonics重点报道（highlight） 。 STED技术通过一束高强度的环形光束提供受激辐射来实现超分辨（参见我之前的如何实现超分辨的帖子）。理论上，STED分辨率的提升可以通过提升环形光的能量来实现，但是，事实上，生物样品的微结构非常娇弱，对高能量的激光“承受不起”。于是，我们就产生了一个问题：如何在有限的激光功率下，利用好STED光使得分辨率能够得到提升？我就有了一个自然的想法：一般来说，光总是一次性穿过样品。 如果我们在系统后面放一面镜子，把光再次利用一下，会有什么效果呢？ 这个想法看上去非常的幼稚，但是似乎你也想不出它为什么不行。当时我们有一个模拟STED光场的程序 ，是我的学生谢浩写的，我就让他跑了一下。结果令我们很振奋：利用镜面后，能带来多项好处： （1）由于这是一个反射系统，所以事实上构成了一个4Pi系统。对于轴向来说，能够将点扩展函数从600多纳米，直接压缩到100nm。 （2）镜面的半波损的存在，将导致系统的干涉极大不出现在镜面上，而是距离镜面100 nm。 （3）由于荧光同时也被反射回来了，因此它的接收效率大大提升。 （4）由于光场从600nm被压缩到了100nm，其强度增加了3.6倍。这使得STED的水平分辨率可以得到大幅提升。 理论验证完了以后，大概是2012年底。我们当时非常兴奋，就开始做实验。在我的实验室，杨旭三是实验上的一员大将。可是买了一批又一批Thorlabs的镜子，总是不能得到满意的增强效果，而且实验还异常难调。一时让我们陷入了困境。 这个困境，直到2014年我在FOM会议上见到UCSF的黄渤教授后，才得到了解决。他们当时已经发表了利用SLM结合镜面实现三维STORM ，我们就聊起了这个工作。他告诉我，镜子上一般都有一层保护层，比方说protective silver，其实都不是简单的银镜，而是前面还有一层SiO2，而这层的厚度一般在150nm上下。这对我来说简直是天大的福音啊！如果这层有150nm厚，我们的镜面干涉增强层将很难到达样品，导致实验做不出来！ 找到了问题，就找到了解决的钥匙。 我们于是就联系了大恒，请他们为我们定制保护镀层薄的镜子。有了这种镜子，我们就可以实现对STED的增强了。而且，在和我们澳大利亚的合作伙伴金大勇教授讨论后，他提到，或许这一技术不仅可以造福STED超分辨领域，对于世界上广大共聚焦用户，我们的技术也可以立即让他们得益。我们接下来就一一尝试了各种共聚焦及其衍生技术，发现不论是点扫描、转盘式、多色的、双光子等等，都能得到令人满意的增强效果。 接下来，我们把镜子寄给我们在佐治亚理工的合作伙伴Phil Santangelo教授，请他帮我们准备合适的生物样品。我们的合作者很快克服了在镜子上养细胞的不便。这个相对来说比较容易，因为镜面上还有二氧化硅，因此和在玻璃上养细胞比较类似。我们选了两个目标：一个是细胞核孔，这种结构大约50nm，如果分辨率不足是很难看到的；另一个是Phil实验室经常做的灭活人类呼吸道合胞体病毒丝。 对于细胞核孔，一旦找到了一个比较好的区域能感受到镜子带来的信号明显增强，打开STED光，则能够得到两倍的分辨率提升。不要小看这里的两倍，如果原来你是一个50nm的分辨率，则在我们的MEANS中就可以得到25nm的分辨率。同时，由于镜子带来的信号反射会影响探测器，我们利用了徕卡time-gated STED的一个非常好的功能，就是把前面一段的光子丢掉，只要1ns以后收集的光子。有了这个利器，我们对比MEANS共聚焦和MEANS-STED，能感受到那种分辨率瞬间提升十几倍所带来的震撼----细胞核孔能够在镜下展示其孔状结构了！而这些是过去的STED所达不到的，一般都只能看到一个个的点 。 图 2 NUP62在共聚焦、MEANS-STED、和电镜下的结果 。 同时，利用轴向层切能力的提升，我们也成功观察到了hRSV-F蛋白包在hRSV-N蛋白外面的图像。而用传统的二维超分辨是很难看到的。在早先，Phil Santangelo教授曾试图使用dSTROM技术来进行观测 ，但是看到的仍然是实心的，没有空心的结构。利用我们的超高分辨，他们首次观察到了和电镜一致的结果。 图 3 hRSV virus在dSTORM，STED，和MEANS-STED下的结果对比。透射电镜下的hRSV可从Wikipedia得到：http://en.wikipedia.org/wiki/Human_respiratory_syncytial_virus 到目前，我们都认为故事已经完整到可以投出了。但是，审稿人在看了我们的稿子后，提出了一个很有意思的问题：这一技术很好，但是只能观察镜面以上的某一层。能不能实现对不同层的观察？ 可以说，这是一个疯狂的问题。但由于是审稿人提的，你只能逼着自己去想。结果通过其他审稿人提出的建议，让我们看到了一篇非常有启发性的工作：发表在2011年PNAS上面的SpecON技术 。这一技术利用荧光不同的发射波长，通过距离对荧光光谱的调制探测实现轴向超分辨。我们就想到，如果用一个白光激光器对样品进行激发，会出现什么呢？这个问题模拟上很快证明，随着波长的增加，干涉的极大值点高度也在相应缓慢增加。实验上，困难来了：有什么东西可以有很宽的吸收谱呢？我们很快锁定了两样纳米材料：量子点和纳米钻石。量子点我们实验室用过不少 ，但是它在这个应用中有一个明显的缺陷：量子点会闪烁。而我们需要的，是不随时间变化的点，这样我们就可以用excitation spectral optical nanosectioning (ESON)的原理，实现轴向超分辨。于是，我们就想到我们之前的合作者，台湾中研院的张焕正教授给我们的纳米钻石 。这个样品的光学稳定性非常好，而且它刚好有很宽的吸收谱。很快，我们就用这个样品展示了我们MEANS-ESON的层切能力。 当然，从层切方面，我们可以镀不同厚度的SiO2来调整我们实际成像的高度，这个简单粗暴的方法已经经过实际验证。它的缺点在于不能做在同一样品上。 图 4 MEANS利用白激光实现不同深度探测的成像结果 同时，这一技术对共聚焦的意义，和TIRF对于宽场的意义是等同的：TIRF虽然不能提升水平分辨率，但是通过减少轴向厚度，它能够得到更高的信噪比，因此也就能够有更清晰的呈现。我们期待这一技术能够在生命科学中得到更为广泛的应用。 图 5 MEANS和TIRF分别针对样品的上表面和下表面进行成像。 回顾我们的论文，2012年有了想法，2015年开始投稿，2016年正式发表。在这其中，我们认准了一点： 一个好的想法，一定要完整地呈现给读者。 为了这个简单的目标，我们四年磨一剑。这个求索的过程是曲折的，在山穷水尽疑无路时，幸好得遇贵人指点，才得以柳暗花明又一村。而点点滴滴看似日常的困难的克服，则是团队上下一心，精诚合作的结果。也特别感谢徕卡公司，他们在国内虽然只是一个贸易公司，但是他们的销售们都非常乐于帮助我们进行各种测试。大家心里只有一个想法：让中国的技术能够走出国门，走向世界！ 还有，特别值得鸣谢的是Light的编辑们。他们邀请到了国际一流的专家来审稿，并通过精湛的校排，让好的工作赏心悦目，受到世界瞩目。Light诞生刚三年，目前就已经是SCI光学类期刊排名第二了。期待通过大家的努力，不管是踊跃投稿还是踊跃引用，让我们的Light更上一层楼！ 本工作受到国家自然科学基金委和科技部重大科研仪器专项支持，在此特别致谢。 最后贴上我们在优酷拍的视频，祝大家观影愉快！ http://v.youku.com/v_show/id_XMTYyMzQ3MTczNg==.html 参考文献： X. Yang, H. Xie, E. Alonas, X. Chen, Y. Liu, P. J. Santangelo, et al., Mirror-enhanced super-resolution microscopy, Light: Science Applications, vol. 5, p. e16134, 2016. O. Graydon, Axial super-reoslution, Nature Photonics, vol. 10, p. 431, 2016. H. Xie, Y. Liu, P. J. Santangelo, D. Jin, and P. Xi, Analytical description of high-aperture STED resolution with 0-2pi vortex phase modulation, Journal of Optical Society of America A, vol. 30, pp. 1640-1645, 2013. J. Schnitzbauer, R. McGorty, and B. Huang, 4Pi fluorescence detection and 3D particle localization with a single objective, Optics Express, vol. 21, pp. 19701-19708, 2013. K. Kolmakov, C. A. Wurm, D. N. Meineke, F. Göttfert, V. P. Boyarskiy, V. N. Belov, et al., Polar red‐emitting rhodamine dyes with reactive groups: synthesis, photophysical properties, and two‐color STED nanoscopy applications, Chemistry-A European Journal, vol. 20, pp. 146-157, 2014. C. A. Wurm, K. Kolmakov, F. Göttfert, H. Ta, M. Bossi, H. 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Liu, et al., Sub-diffraction imaging of nitrogen-vacancy centers in diamond by stimulated emission depletion and structured illumination, RSC Advances, vol. 4, pp. 11305-11310, 2014. 新闻链接： http://www.eurekalert.org/pub_releases/2016-06/giot-tmi061416.php https://www.sciencedaily.com/releases/2016/06/160617082312.htm http://www.viraltechnologynews.com/tiny-mirror-improves-microscope-resolution-for-studying-cells/ http://www.bioopticsworld.com/articles/2016/06/mirror-approach-boosts-super-resolution-microscopy-for-cell-studies.html http://www.nanotechnologyworld.org/#!Tiny-Mirror-Improves-Microscope-Resolution-for-Studying-Cells/c89r/5767599b0cf27dd85c6d3af6 http://www.spacedaily.com/reports/Tiny_mirror_improves_microscope_resolution_for_studying_cells_999.html http://www.biosciencetechnology.com/news/2016/06/tiny-mirror-improves-microscope-resolution-studying-cells https://www.mdtmag.com/article/2016/06/tiny-mirror-improves-microscope-resolution-studying-cells http://www.news.gatech.edu/2016/06/16/tiny-mirror-improves-microscope-resolution-studying-cells http://newsroom.uts.edu.au/news/2016/06/looking-good-tiny-mirror-helps-get-better-view-living-cells GT video: https://www.youtube.com/watch?v=C3bX43uaido PKU video: https://www.youtube.com/watch?v=blq9Jvnw6ss
入射P波经界面反射成P波和S波，它俩的示意图位置标注反了： （1）Vibrations of Soils and Foundation, Prentice-Hall,1970；中译本1976 （2）Fundamentals of Soil Dynamics,Elsevier,1983；中译本，1984 （3）动力地基与基础，科学出版社，2001 （4）土动力学，高教出版社，2011
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