回头翻看以前的博客，算算我做免疫组库方面的工作已经有四个年头了。 这篇从苹果网搬过来的博客 记录了最早开始为免疫组库项目设计引物时候的情景。时间是07年十二月。而决定去用高通量测序方法做免疫组库研究是在07年的十月份，那是我刚刚离开Qiagen，加入HudsonAlpha研究院。 这篇08年七月的博客 记录了我和太太去斯坦福大学访问，那时我们刚刚完成了第一次用454测序免疫组库的工作，得到了很好的结果。在那以前，有关免疫组库方法学的专利已经申请进去了。 首次向外界披露我们的技术是在09年西雅图召开的 免疫年会 上。 论文 也是大概那个时候开始投稿的，不过一直到2010年年初 我们的论文 才在PNAS上发表。 免疫组库测序是个全新的领域，与其它“学院派”科学家不同，我们在做这个项目的时候不是把注意力集中在抢先发表论文上，而是努力把技术做得比别人好：更简 单，更好用，全自动，产品更全，软件更快更好。所以在他人不断发表论文的时候，我们却默默地做了大量技术研发的工作，也抢先申请了 一系列的专利 。 说道专利，我们最近还申请了另一个专利。这个专利的内容在 这篇博客 里面已经透露了一些。这个新专利是一个诊断产品。不过 我们要诊断的不是一个特定的病，而是一个正常指标 ！ 事情是这样的，早在09年西雅图免疫年会上，我们就报告了免疫组库在肿瘤病人中有明显的多样性缺失的现象： 如上面的幻灯片所示，正常人的免疫组库（T细胞beta受体）多样性很好，在三维图像上看起来丛林密布；而结肠癌病人或系统性红斑狼疮病人的免疫组库则多 样性缺失，三维图像看上去就是几棵树。这些病人T细胞总数是正常的，可是他们的T细胞功能太专一，缺乏健康人应有的多样性。我们随后做了许多病人，都是如此。 开始，我们也和其它科学家一样，试图通过多做一些病人标本找到 更特异性 的免疫组库变化：某个特定的VDJ重组总是和某个肿瘤相关。可是，免疫系统潜在的多样性（人可以有10的20次方那么多不同的T细胞）实在太大，找到病人之间共有的特异性VDJ (或者CDR3)可能性很小。那么，免疫组库研究的诊断意义到底在哪里？ 受中医思维影响，我对“上医医未病之病”一直感兴趣。可是医未病之病的前提条件就是能够诊断正常：只有能诊断正常，医生才能在病人稍微偏离正常状态时就能知道，及时加以纠正。引申开来，免疫组库技术在能诊断各种特异性疾病的同时，它的一个最好的应用可能就是去 诊断正常 。 如何评估一个人的免疫组库是否正常？ 那就看他（她）的免疫组库多样性是否完好。可是作为一个临床诊断，最好要有一个定量的描述。这，就是我们新专利的一个特点和诉求。我们称之为D50（Diversity 50)。下面是专利里面对D50的描述： Aspects of the invention include arm-PCR amplification of CDR3 from T cells, B cells, and/or subsets of T or B cells. Large numbers of amplified products may then be efficiently sequenced using next-generation sequencers. If the significant percentage that is chosen is 50%, the number may be referred to as the “D50.” D50 may then be the p ercent of dominant and unique T or B cell clones that account for fifty percent (50%) of the total T or B cells counted in that sample. For high-throughput sequencing, for example, the D50 may be the number of the most dominant CDR3s, among all unique CDR3s, that make up 50% of the total effective reads, where total effective reads is defined as the number of sequences with identifiable V and J gene segments which have been successfully screened through a series of error filters. 所谓D50，就是通过arm-PCR技术扩增免疫组库然后测序。把半定量扩增出的免疫组库和测序结果做sorting, 表达量最高到表达量最低排列，然后从高到低地相加。加到50%（reads)的时候看看一共包括多少个克隆，克隆数占总数的百分比就是D50值。一个健康 人，因为免疫组库多样性好，免疫细胞总数的50%就会由许多不同的细胞组成，D50值就会偏高；相反，病人常常会有克隆性扩增，免疫多样性差，所以几个克 隆就占据了免疫细胞的50%了，因此D50值就偏低。 专利诉求中除了可以用测序方法做D50计算以外，还提到可以用iCubate仪器通过杂交的方法对D50进行评估。这样就有快速，便宜的方法来“诊断正常”了。
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